In vivo en ex vivo benaderingen van eierstokkanker uitgezaaide Kolonisatie van Milky Spot Structuren Bestudeer in peritoneale Adipose
October 14th, 2015
We schetsen een protocol dat zowel in vivo als ex vivo benaderingen implementeert om de kolonisatie van peritoneale vetweefsels door eierstokkanker te bestuderen, met name het omentum. Bovendien presenteren we een protocol om immuuncelstructuren in het omentum, bekend als melkvlekken, te kwantificeren en te analyseren, die metastasen van peritoneale vetweefsels bevorderen.
Het algemene doel van deze procedure is om het gebruik van standaardtechnieken te demonstreren om ovariële kankerkolonisatie van peritoneale vetafzettingen te kwantificeren. Dit wordt bereikt door intraperitoneaal injecteren van ovariële kankercellen in muizen na het doden van de muizen op specifieke tijdstippen. Peritoneale vetafzettingen worden geïdentificeerd en geïsoleerd van de muizen.
Ten slotte wordt het aantal ovariële kankercellen in specifieke vetafzettingen gekwantificeerd met behulp van flowcytometrie. Voor mechanisme-gebaseerde studies kan ovariële kankercellicolonisatie ook worden bestudeerd in ex vivo co-cultuur, gevolgd door geschikte kwantitatieve en/of moleculaire analyses. Uiteindelijk maken deze in vivo en ex vivo benaderingen de ondervraging van processen betrokken bij ovariële kankercellicolonisatie van peritoneal vet mogelijk via kwalitatieve of kwantitatieve methoden.
Het belangrijkste voordeel van deze aanpak is dat we in staat zijn standaardtechnieken te implementeren om specifieke stappen in ovariële kankermetastatische kolonisatie van peritoneal vet te evalueren. De implicaties van de techniek breiden de preventie van metastase uit. Specifiek maakt het de identificatie mogelijk van interacties tussen kankercellen en micro-omgeving die de uitgroei van ovariële kankercellen binnen immuuncelstructuren, bekend als melkachtige vlekken, reguleren.
Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn in deze methode het nuttig vinden om ervaring te hebben met het hanteren van muizen. Hoewel intraperitoneale injecties eenvoudig lijken, kan een gebrek aan een goede techniek leiden tot onnauwkeurige gegevens. Bovendien vereist weefseldissociatie tot een enkele celsuspensie oefening en zorgvuldige planning voorafgaand aan het begin van het experiment.
Deze specifieke techniek vereist niet dat de dieren onder narcose zijn. Voer deze techniek uit volgens goedgekeurde protocollen op levende dieren. Laad 500 microliter van de fluorescerend gemerkte enkele celsuspensie in de spuit.
Steek vervolgens de spuit in een steriele afgesloten naald van 25 gauge om celshearing voorafgaand aan injectie te verminderen. Houd de muis met de andere hand vast en pak de muis op door de nek en houd de staart vast met de palm en wijsvinger. Bevestig vervolgens het linker achterste been tussen de ring- en pink om trauma aan buikorganen te voorkomen.
Houd de muis goed vast zodat hij zich tijdens de injectie niet kan bewegen. Stel je een lijn voor over de buik en lokaliseer een punt aan de rechterkant van het dier en dicht bij de middellijn. Het ingangspunt is twee cranial en iets mediaal van de laatste tepel.
Bereid u voor om de naald aan de rechterkant van de muis in te brengen om het blinddarm te vermijden en het risico op het puncteren van de darmen te verkleinen. Steek de naald in de onderste laterale regio van de buik van de muis tot een diepte van ongeveer 0,5 centimeter. Trek aan de zuiger om te bevestigen dat de naald geen bloedvat of andere peritoneale organen heeft gepenetreerd.
Als er geen vloeistof wordt afgezogen, injecteert u het monster met langzame, constante druk. Trek vervolgens de naald terug en plaats de muis terug in zijn kooi. Draai de spuit niet terug voordat u deze in de container voor scherpe voorwerpen gooit.
Offer de muizen op specifieke tijdstippen na injectie voor het verwijderen van vitale organen. Zoals beschreven in het tekstprotocol, vormt het oogsten van peritoneale vetafzettingen het verwijderen van interne organen. Maak een middenlijnsnede dicht bij de inguinale pape door de peritoneale wand om de interne organen bloot te leggen om het omentale vet te verwijderen.
Leg het omentale pancreascomplex bloot door de milt uit de peritoneale holte te trekken met pincetten voor het gonadale vet. Gebruik pincetten om het gonadale vet rond de eierstokken op te tillen en verwijder het door de weefselverbindingen door te snijden. Onmiddellijk. Plaats de weefsels in ijskoud PBS.
Verwijder vervolgens het baarmoedervet door met behulp van pincetten het baarmoedervet rond de baarmoederhoorns op te tillen en het verwijderen door de weefselverbindingen door te snijden voordat u de weefsels onmiddellijk in ijskoud PBS plaatst. Wanneer u het mesenterisch vet verkrijgt, snijdt u de verbinding tussen de dunne darm en de pylorus. Gebruik pincetten om het vrije uiteinde van de dunne darm stevig vast te grijpen en pel het langzaam van het mesenterisch vet af.
Los het mesenterisch vet los van de mesenterische wortel met behulp van dissectieschaartjes. Plaats vervolgens onmiddellijk de weefsels in ijskoud PBS. Ten slotte, om het pleo portale vet te verwijderen, til het distale uiteinde van de milt op met behulp van pincetten om de dunne band van vetweefsel bloot te leggen die het hilum van de milt verbindt met de pancreas.
Verwijder het pleo portale vet door het eerst los te maken van de pancreas en het vervolgens voorzichtig uit de milt te dissecteren. Plaats vervolgens onmiddellijk de weefsels in PBS om te beginnen met wegen. Breng alle vetweefsels overeen met het omentum.
Breng de weefsels over in afzonderlijke vijf milliliter buisjes met 1,5 milliliter serumvrij ECCOs, gemodificeerd adelaarsmedium of DMEM en 0,1% bovien serumalbumine. Combineer de weefsels die zijn geoogst uit drie onafhankelijke muizen om een voldoende opbrengst aan cellen voor flowcytometrie te garanderen. Snijd vervolgens de weefsels in kleine stukjes met chirurgische schaar en voeg 1,5 milliliter serumvrij DMEM toe met 0,4% collageenase één.
Incubeer de weefselsuspensie gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius met rotatieve menging als optionele stap. Dissocieer het weefsel verder door het te kauwen. In dit geval brengt u de weefselcollageensuspensie over in een micromaagpje of zak en kauw gedurende 10 minuten op laag toeren, waarbij u de oriëntatie van de zakken om de vijf minuten draait.
Filter vervolgens de monsters door een nylon gaasfilter om groot puin te verwijderen. Verzamel de cellen door centrifugatie bij 250 keer G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius en gooi het supernatantfrac
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit protocol beschrijft in vivo en ex vivo methoden om de kolonisatie van peritoneale vetweefsels door eierstokkanker te bestuderen, met focus op het omentum. Het beschrijft ook een techniek voor het kwantificeren van immuuncelstructuren, bekend als melkvlekken, die metastase faciliteren.
Belangrijke onderzoekscomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Oncologie
- Immunologie
Achtergrond
- Eierstokkanker verspreidt zich vaak naar peritoneale vetweefsels.
- Het begrijpen van de interactie tussen kankercellen en vetweefsel is cruciaal voor het ontwikkelen van therapieën.
- Melkvlekken in het omentum spelen een rol in de kankerprogressie.
- Standaardtechnieken kunnen worden toegepast om deze interacties te bestuderen.
Doel van het onderzoek
- Om methoden voor het kwantificeren van eierstokkankerkolonisatie in vetdepots te demonstreren.
- Om de rol van immuuncelstructuren in kankermetastase te analyseren.
- Om een raamwerk te bieden voor toekomstig onderzoek in de kankerbiologie.
Gebruikte methoden
- Intraperitoneale injectie van eierstokkankercellen in muizen.
- Isolatie van peritoneale vetdepots na het doden op specifieke tijdstippen.
- Kwantificering van eierstokkankercellen met behulp van flowcytometrie.
- Ex vivo co-cultuurstudies voor mechanisme-gebaseerde analyses.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle kwantificering van eierstokkankercellen in vetdepots.
- Inzichten in de rol van melkvlekken in kankermetastase.
- Demonstratie van zowel in vivo als ex vivo methodologieën.
- Basis voor verder onderzoek naar kanker-vet interacties.
Conclusies
- Deze studie biedt een uitgebreid protocol voor het bestuderen van eierstokkankerkolonisatie.
- Het benadrukt de belangrijkheid van immuunstructuren in het metastaseproces.
- De methoden kunnen worden aangepast voor verschillende kankeronderzoekstoepassingen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This protocol enables biopharma R&D teams to quantitatively assess ovarian cancer metastatic colonization of peritoneal adipose tissue, a critical step in peritoneal metastasis formation. By providing standardized in vivo and ex vivo approaches to study milky spot-mediated interactions, the method supports target validation and mechanistic de-risking in early discovery. The ability to quantify cancer cell localization within immune-rich microenvironments enhances predictive confidence for therapeutic intervention strategies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses regarding immune cell-mediated promotion of ovarian cancer metastasis.
- Operational Value: Provides a standardized workflow to functionally validate milky spots as determinants of metastatic outgrowth.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by clarifying the role of omental adipose structures in cancer progression.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative flow cytometry readouts of cancer cell colonization in specific adipose depots for assay standardization.
- Operational Value: Enables preparation of validated biological systems for downstream compound screening against metastasis-promoting interactions.
- Operational Value: Facilitates assay reproducibility through defined tissue dissociation and single-cell suspension protocols.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects discovery-phase mechanistic insights to preclinical models by maintaining disease-relevant peritoneal microenvironment context.
- Operational Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by quantifying metastatic colonization across independent mouse models and cell lines.
- Scientific Value: Enables evaluation of malignant potential in early lesion models through ex vivo co-culture analysis.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification by providing quantitative metrics of metastatic colonization in a physiologically relevant adipose microenvironment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of cancer-stromal interactions within immune cell-rich milky spot structures.
- Screening: Delivers assay-ready tissue preparations with standardized quantitative outputs for compound evaluation.
- Analytics: Provides flow cytometry-based measurements of cancer cell deposition to enable comparative condition analysis.
- Translational Research: Maintains continuity from in vivo colonization studies to ex mechanistic investigations using the same tissue source.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying metastasis across ovarian cancer cell lines and microenvironmental variables.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in metastasis pathways.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility across laboratories through defined injection, tissue harvest, and quantification procedures.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early assessment of metastasis-promoting biological interactions.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of therapeutic candidates based on quantitative metastasis inhibition data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine handling, intraperitoneal injection, and adipose tissue dissection to ensure data integrity.
- Dependent on instrumentation for flow cytometry, fluorescence imaging, and histology to quantify and visualize cancer cell localization.
- Necessitates cross-team standardization of tissue dissociation protocols to obtain consistent single-cell suspensions for downstream analysis.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different adipose depots or cancer models beyond omental tissue.
- Limited by the technical skill required to prevent tissue contamination during excision, which could skew quantitative flow cytometry outcomes.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
2:25
Intraperitoneal Injection of Cells
4:08
Identification and Isolation of Peritoneal Fat Depots
6:14
Quantitation of Cancer Cell Localization to Milky Spots Using Flow Cytometry
8:33
Ex vivo Co-culture of the Mouse Omentum with SKOV3ip.1-GFP Cells
10:06
Results: Analysis of Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose
12:06
Conclusion
