Eiwitsynthese Bioconjugaten via Cysteïne-maleïmide Chemistry

Het algemene doel van het synthetiseren van eiwit-bioconjugaten via cysteïne-maleïmide-chemie is om specificiteit te garanderen op de plaats van modificatie op het eiwit. Dit heeft op zijn beurt invloed op de activiteit van het resulterende bioconjugaat, bijvoorbeeld antilichaam-geneesmiddelconjugaten. Als u geïnteresseerd bent in eiwitstructuur of -functie en u onderzoek doet in nano-geneeskunde, fluorescente microscopie of systeemchemie, dan zal deze techniek u helpen bij het beantwoorden van uw vragen.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het onder meer voorwaarden zeer specifiek en hoog opbrengend is. Om deze procedure te starten, lost u 12 milligram gelyofiliseerd cytochroom C op in zes milliliter 20 millimolair fosfaatbuffer. Pipetteer 16 microliter van vers bereide één molair DTT-oplossing in de eiwit-oplossing om het cytochroom C te reduceren. Na het mengen van de oplossing, filtert u deze door een 0,22 micron laag eiwitbindende PBDF-seringfilter voordat u deze op chromotografische media injecteert.

Zuiver vervolgens de gereduceerde ruwe cytochroom C-oplossing door middel van fast protein liquid chromotografie of FPLC. Nadat u een sterk kationische strange kolom hebt geëquilibreerd, laadt u één milliliter van de oplossing in de injectieluis van het instrument. Start vervolgens een gradiëntmethode van 328 voor 450 millimolair natriumchloride, over vijf kolomvolumes.

Bewaak de 280 en 410 nanometer kanalen van de UV viz-detector en verzamel de grootste piek. Verhoog nu de zoutconcentratie tot één molair gedurende twee kolomvolumen om ISO2 cytochroom C te lozen. Nadat de kolom is gespoeld, re-equilibreer met twee kolomvolumen van 20 millimolair fosfaatbuffer voordat u de volgende ruwe aliquot injecteert. Op dit punt, lost u 0,9 milligram van het juiste ruthenium maleïmide complex op in 600 microliter acetonitril.

Bereid een 10 millimolair TCEP-oplossing door 2,87 milligram TCEP op te lossen in één milliliter ultrapuur water. Meng 11,4 milliliter ultrapuur water met drie milliliter van een 100 millimolair fosfaat-EDTA stamoplossing in een 50 milliliter plastic buis. Voeg vervolgens 0,15 micromolen gezuiverd cytochroom C toe aan de fosfaat-EDTA oplossing.

Voeg 7,5 microliter van de TCEP-stamoplossing toe aan de eiwit-oplossing. En laat vijf minuten roeren om eventueel eiwit dat gedimeriseerd kan zijn door cysteïne-oxidatie te reduceren. Voeg vervolgens 600 microliter van de ruthenium maleïmide complex oplossing toe aan de gereduceerde gebufferde cytochroom C-oplossing en laat het reactiemengsel in het donker bij kamertemperatuur 24 uur roeren.

De volgorde van toevoeging is van het grootste belang. Het is belangrijk om eerst het eiwit toe te voegen, vervolgens het reducerende middel en als laatste het maleïmide. Concentreer de volgende dag het reactiemengsel door centrifugatie met behulp van een spinfilter met een moleculair gewicht van 3,5 kilodalton.

Herhaal de centrifugatie twee tot drie keer met vers 20 millimolair fosfaatbuffer tot het filtraat helder is. Voor nikkel gebaseerde zuivering, spoel een 1 milliliter gemobiliseerde metaalaffiniteitschromatografiekolom af met drie milliliter ultrapuur water, drie milliliter 100 millimolair nikkelacetaatoplossing en zes milliliter ultrapuur water. Hecht vervolgens de met nikkel geladen kolom aan de FPLC tussen de injectieluis en UV viz-detector.

Vervolgens équilibreer de kolom met drie kolomvolumen van 20 millimolair fosfaat, 0,5 molair natriumchloridebuffer met een stromingssnelheid van 0,5 milliliter per minuut. Na het filteren door een 0,22 micron spuitfilter, laadt u 100 microliter van de ruwe reactiemengsel in de injectieluis van het instrument. Was de kolom met drie kolomvolumen buffer om het ongereageerde cytochroom C te elueren. Elueer vervolgens het cytochroom C bioconjugaat met een Imidazol-gradiënt van nul tot 125 millimolair over drie kolomvolumen.

Zodra het cytochroom C bioconjugaat van de kolom is elueerd, spoelt u met 250 millimolair Imidazol-buffer gedurende vijf kolomvolumen. équilibreer vervolgens de kolom opnieuw met 20 millimolair fosfaat 0,5 molair natriumchloridebuffer. Trek vervolgens de bioconjugaatfracties.

En concentreer door centrifugatie met behulp van een spinfilter met een moleculair gewicht van 3,5 kilodalton. Na centrifugatie, laadt u het geconcentreerde bioconjugaat in 3,5 kilodalton moleculair gewicht cut-off dialysecassettes en dialyseert u tegen ultrapuur water gedurende de nacht. De volgende dag bepaalt u de concentratie van de pure geconcentreerde bioconjugaatoplossing door UV-Vis spectroscopie.

Gebruik dezelfde molaire absorbtiviteitswaarde als ISO1 cytochroom C bij 410 nanometer. Bewaar het resterende bioconjugaat als 25 microliter aliquots bij minuus 20 graden Celsius. Voor gelelektroforese, bereid 10 microliter van elk te runnen eiwitmonster voor door het bioconjugaat te verdunnen met voorgemengde lithiumdodecylsulfaatbuffer tot een eindconcentratie van ongeveer 20 microgram per putje.

Vervolgens verwarmt u de monsters gedurende 10 minuten tot 70 graden Celsius. Laat de monsters afkoelen tot kamertemperatuur en laad ze voorzichtig op een voorgegoten 12% bis tris, één millimeter 10 putjes gel met behulp van lange pipettentips om het laden te vergemakkelijken. Laad een voorgekleurde 10 eiwit moleculair gewicht marker in een middelste put van het gel om de analyse te helpen.

Laat vervolgens de gel gedurende 35 minuten bij 200 volt draaien. Zodra de run voltooid is, kleurt u de gel gedurende twee uur met een commerciële Coomassie blauw oplossing. Na het verwijderen van de Coomassie blauw oplossing, wast u de gel gedurende 48 uur met ultrapuur water.

Een massatoename in afwezigheid van ongereageerd eiwit in het multi tof massaspectrum van het cytochroom C bioconjugaat toonde de succesvolle equivalente binding van het