Name: Histologische analyses van acute alcoholische leverbeschadiging bij zebravis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Leer histologische analyses van acute alcoholische leverbeschadiging bij zebravislarven met 2% ethanol. Deze methode induceert hepatic steatosis en vasculaire zwelling om leverpathologie te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs zouden graag Dr. Katy Murray willen erkennen bij het Zebrafish International Resource Center; Dr. Stacey Huppert en Kari Huppert bij CCHMC, voor hun nuttige advies over het protocol; En CCHMC veterinaire dienst, voor de visverzorging. Dit werk werd ondersteund door NIH grant R00AA020514 en een onderzoeksbijdrage van het Center for Pediatric Genomics bij CCHMC (naar CY). Het was ook gedeeltelijk steun door NIH-subsidie ​​P30 DK078392 (Integrative Morphology Core) van het Spijsverteringskliniek Centrum in Cincinnati.

<ol><li>Yoon, Y. H., Chen, C. M., Yi, H. Y. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aYoon%2C+YH+%22Surveillance+report+%23100%3A+Liver+cirrhosis+mortality+in+the+United+States%3A+National%2C+State%2C+and+regional+trends%22">Surveillance report #100: Liver cirrhosis mortality in the United States: National, State, and regional trends</a>. , National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism. Bethesda, MD. 2000-2011 (2014).</li>
<li>Singal, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolving+frequency+and+outcomes+of+liver+transplantation+based+on+etiology+of+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Evolving frequency and outcomes of liver transplantation based on etiology of liver disease.</a> Transplantation. 95 (5), 755-760 (2013).</li>
<li>Louvet, A., Mathurin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alcoholic+liver+disease%3A+mechanisms+of+injury+and+targeted+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Alcoholic liver disease: mechanisms of injury and targeted treatment.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 12 (4), 231-242 (2015).</li>
<li>Ki, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-22+treatment+ameliorates+alcoholic+liver+injury+in+a+murine+model+of+chronic-binge+ethanol+feeding%3A+role+of+signal+transducer+and+activator+of+transcription+3%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Interleukin-22 treatment ameliorates alcoholic liver injury in a murine model of chronic-binge ethanol feeding: role of signal transducer and activator of transcription 3.</a> Hepatology. 52 (4), 1291-1300 (2010).</li>
<li>Tsuchiya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interstrain+differences+in+liver+injury+and+one-carbon+metabolism+in+alcohol-fed+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Interstrain differences in liver injury and one-carbon metabolism in alcohol-fed mice.</a> Hepatology. 56 (1), 130-139 (2012).</li>
<li>Koteish, A., Yang, S., Lin, H., Huang, X., Diehl, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+ethanol+exposure+potentiates+lipopolysaccharide+liver+injury+despite+inhibiting+Jun+N-terminal+kinase+and+caspase+3+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Chronic ethanol exposure potentiates lipopolysaccharide liver injury despite inhibiting Jun N-terminal kinase and caspase 3 activation.</a> J Biol Chem. 277 (15), 13037-13044 (2002).</li>
<li>Leo, M. A., Lieber, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+fibrosis+after+long-term+administration+of+ethanol+and+moderate+vitamin+A+supplementation+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hepatic fibrosis after long-term administration of ethanol and moderate vitamin A supplementation in the rat.</a> Hepatology. 3 (1), 1-11 (1983).</li>
<li>Tsukamoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+and+progressive+steatosis+and+focal+necrosis+in+rat+liver+induced+by+continuous+intragastric+infusion+of+ethanol+and+low+fat+diet%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Severe and progressive steatosis and focal necrosis in rat liver induced by continuous intragastric infusion of ethanol and low fat diet.</a> Hepatology. 5 (2), 224-232 (1985).</li>
<li>Tsukamoto, H., Mkrtchyan, H., Dynnyk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intragastric+ethanol+infusion+model+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Intragastric ethanol infusion model in rodents.</a> Methods Mol Biol. 447, 33-48 (2008).</li>
<li>Howarth, D. L., Passeri, M., Sadler, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drinks+like+a+fish%3A+using+zebrafish+to+understand+alcoholic+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol+Clin+Exp+Res%22%5BJournal%5D)">Drinks like a fish: using zebrafish to understand alcoholic liver disease.</a> Alcohol Clin Exp Res. 35 (5), 826-829 (2011).</li>
<li>Howarth, D. L., Yin, C., Yeh, K., Sadler, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+hepatic+dysfunction+parameters+in+two+models+of+fatty+liver+disease+in+zebrafish+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Defining hepatic dysfunction parameters in two models of fatty liver disease in zebrafish larvae.</a> Zebrafish. 10 (2), 199-210 (2013).</li>
<li>Lin, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+Animal+Model+for+Alcoholic+Liver+Disease+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Development of an Animal Model for Alcoholic Liver Disease in Zebrafish.</a> Zebrafish. , (2015).</li>
<li>Passeri, M. J., Cinaroglu, A., Gao, C., Sadler, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+steatosis+in+response+to+acute+alcohol+exposure+in+zebrafish+requires+sterol+regulatory+element+binding+protein+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hepatic steatosis in response to acute alcohol exposure in zebrafish requires sterol regulatory element binding protein activation.</a> Hepatology. 49 (2), 443-452 (2009).</li>
<li>Tsedensodnom, O., Vacaru, A. M., Howarth, D. L., Yin, C., Sadler, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+metabolism+and+oxidative+stress+are+required+for+unfolded+protein+response+activation+and+steatosis+in+zebrafish+with+alcoholic+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Ethanol metabolism and oxidative stress are required for unfolded protein response activation and steatosis in zebrafish with alcoholic liver disease.</a> Dis Model Mech. 6 (5), 1213-1226 (2013).</li>
<li>Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3407311/">The bHLH transcription factor Hand2 marks hepatic stellate cells in zebrafish: Analysis of stellate cell entry into the developing liver.</a> Hepatology. , (2012).</li>
<li>Lassen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning%2C+baculovirus+expression%2C+and+tissue+distribution+of+the+zebrafish+aldehyde+dehydrogenase+2%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metab+Dispos%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning, baculovirus expression, and tissue distribution of the zebrafish aldehyde dehydrogenase 2.</a> Drug Metab Dispos. 33 (5), 649-656 (2005).</li>
<li>Reimers, M. J., Hahn, M. E., Tanguay, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+zebrafish+alcohol+dehydrogenases+share+common+ancestry+with+mammalian+class+I%2C+II%2C+IV%2C+and+V+alcohol+dehydrogenase+genes+but+have+distinct+functional+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Two zebrafish alcohol dehydrogenases share common ancestry with mammalian class I, II, IV, and V alcohol dehydrogenase genes but have distinct functional characteristics.</a> J Biol Chem. 279 (37), 38303-38312 (2004).</li>
<li>Zhang, C., Ellis, J. L., Yin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+vascular+endothelial+growth+factor+signaling+facilitates+liver+repair+from+acute+ethanol-induced+injury+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Inhibition of vascular endothelial growth factor signaling facilitates liver repair from acute ethanol-induced injury in zebrafish.</a> Dis Model Mech. , (2016).</li>
<li>Vonghia, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+alcohol+intoxication%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Intern+Med%22%5BJournal%5D)">Acute alcohol intoxication.</a> Eur J Intern Med. 19 (8), 561-567 (2008).</li>
<li>Wittekind, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traditional+staining+for+routine+diagnostic+pathology+including+the+role+of+tannic+acid.+1.+Value+and+limitations+of+the+hematoxylin-eosin+stain%5BTitle%5D)+AND+%22Biotech+Histochem%22%5BJournal%5D)">Traditional staining for routine diagnostic pathology including the role of tannic acid. 1. Value and limitations of the hematoxylin-eosin stain.</a> Biotech Histochem. 78 (5), 261-270 (2003).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3A+A+Guide+for+the+Laboratory+Use+of+Zebrafish+%28Danio+Rerio%29%22">The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio)</a>. , University of Oregon Press. (2007).</li>
<li>Theise, N. D. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/cld.172/full">Histopathology of alcoholic liver disease.</a> Clinical Liver Disease. 2 (2), (2013).</li>
<li>Lorent, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Jagged-mediated+Notch+signaling+disrupts+zebrafish+biliary+development+and+generates+multi-organ+defects+compatible+with+an+Alagille+syndrome+phenocopy%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Jagged-mediated Notch signaling disrupts zebrafish biliary development and generates multi-organ defects compatible with an Alagille syndrome phenocopy.</a> Development. 131 (22), 5753-5766 (2004).</li>
<li>Huang, M., Xu, J., Shin, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+Ethanol-induced+Fibrotic+Liver+Model+in+Zebrafish+to+Study+Progenitor+Cell-mediated+Hepatocyte+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration.</a> J Vis Exp. (111), (2016).</li>
<li>Paredes, J. F., Lopez-Olmeda, J. F., Martinez, F. J., Sanchez-Vazquez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Daily+rhythms+of+lipid+metabolic+gene+expression+in+zebra+fish+liver%3A+Response+to+light%2Fdark+and+feeding+cycles%5BTitle%5D)+AND+%22Chronobiol+Int%22%5BJournal%5D)">Daily rhythms of lipid metabolic gene expression in zebra fish liver: Response to light/dark and feeding cycles.</a> Chronobiol Int. 32 (10), 1438-1448 (2015).</li>
<li>Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+isolation+of+PCR-ready+genomic+DNA+from+zebrafish+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues.</a> Biotechniques. 43 (5), 610-614 (2007).</li>
<li>van der Velden, Y. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+serine-threonine+kinase+LKB1+is+essential+for+survival+under+energetic+stress+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The serine-threonine kinase LKB1 is essential for survival under energetic stress in zebrafish.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (11), 4358-4363 (2011).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Het huidige protocol beschrijft een gedetailleerde procedure voor acute ethanolbehandeling bij zebravislarven en de daaropvolgende histopathologische analyses met H &amp; E-kleuring. Acute ethanolbehandeling moet niet eerder dan 96 uur na bevruchting worden uitgevoerd, aangezien dit het stadium is waarop de zebravislever alcohol-metaboliserende enzymen uitdrukt 13 . 2% ethanol is de maximale dosis die larven 13 , 14 kunnen tolereren. De m...

Alcoholische leverziekte (ALD), die wordt veroorzaakt door overconsumptie van alcohol, is een belangrijke oorzaak van alcoholgerelateerde morbiditeit en sterfte. In de Verenigde Staten betreffen bijna de helft van de leverziekte de alcohol 1 , en ALD is verantwoordelijk voor bijna 1 op 3 levertransplantaties 2 . ALD heeft een breed spectrum. Steatose, die wordt gekenmerkt door overmatige lipide accumulatie in hepatocyten, komt voor in het vroege stadium van zwaar drinken en is omkeerbaar bij stopzetting van alcoholgebruik. Onder invloed van genetische en omgevingsfactoren en voortdurende alcoholinname kan hepatische steatosis zich verder ontwikkelen tot alcoholische hepatitis en uiteindelijk cirrose 3 . Studies met behulp van ALD-modellen van knaagdieren hebben een aanzienlijke inzichten gegeven in de ziekte, maar ze hebben beperkingen (beoordeeld in referentie 3 ). Mondelinge voeding van een alcohol dieet veroorzaakt alleen steatosis bij knaagdieren 4 , &lt;/ Sup&gt; 5 . Ontwikkeling van ontsteking en fibrose vereist een tweede belediging 6 , 7 of chronische intragastrische infusie, die invasieve en technisch uitdagend is 8 , 9 . De teleostzebravis ontwikkelt ook leverschade als reactie op zowel chronische als acute alcoholbehandeling 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 . In het bijzonder vertegenwoordigt de larvezebravis een aantrekkelijk complementair modelorganisme waarin acute alcoholische leverletsel 10 , 11 , 13 , 15 wordt bestudeerd. De zebravis lever is functioneel en produceert belangrijke enzymen voor ethanol metabolisme met 4 dagenPost-fertilisatie (dpf) 13 , 16 , 17. Ethanol kan direct aan het water toegevoegd worden, en blootstelling aan 2% ethanol gedurende 24 uur is voldoende om hepatische steatosis en fibrogenische reacties in zebravis larven 13 , 15 te induceren. Er is gemeld dat behandeling met 2% ethanol gedurende 24 uur resulteerde in een weefselethanolconcentratie van 80 mM in zebravis larven 13 . Anderen hebben aangetoond dat larven deze concentratie tolereren en de leverfenotypen die in de behandelde dieren zijn gezien, zijn specifiek voor de blootstelling aan ethanol 11 , 13 , 15 , 18 van ethanol. Echter, omdat 80 mM bijna dodelijk is bij mensen 19 , is het belangrijk om de leverhistologie van de met ethanol behandelde zebravis en dete te evalueren.De fysiologische relevantie voor de mens. De snelle externe ontwikkeling en translucentie van zebravis larven maken het mogelijk om de werking van alcohol in de lever in real-time en in vaste monsters te karakteriseren. De beschikbaarheid van celltypespecifieke fluorescerende transgene lijnen en de recente vooruitgang in confocale microscopie vergemakkelijken de studie van hoe verschillende levercel-typen hun morfologie en gedrag veranderen in reactie op acute ethanolbehandeling 11 , 15 . Het confocale beeldvorming van de fluorescerende transgene zebravis kan echter niet volledig vervangen worden door hematoxyline en Eosin (H &amp; E) kleuring bij het bestuderen van leverhistologie. Als u alle levercel types tegelijkertijd gebruikt met behulp van transgene zebravis, hoeft u alleen transgenische lijnen te genereren, die elk een leverceltype met een unieke fluorofoor labelen. Het introduceren van verschillende transgene achtergronden in dezelfde vis vereist rasG meerdere generaties, wat tijdrovend en kostbaar is. Extra immunofluorescentie kleuring is nodig om extracellulaire matrix componenten te detecteren. H &amp; E-kleuring etikettert tegelijkertijd alle levercel-typen en extracellulaire matrixcomponenten, waardoor een overzicht van de lever 20 wordt gegeven . Bovendien onthult het verscheidene histopathologische kenmerken van leverziekten, zoals hepatocytestoornissen, steatosis en fibrose. Hoewel H &amp; E een routinevlek is in zoogdierleverhistologie, wordt het niet vaak gebruikt bij leveronderzoek op zebravisvissen, en het protocol is minder goed gevestigd. Dit werk beschrijft een protocol voor acute ethanolbehandeling bij zebravislarven en voor de follow-up histologische analyses met H &amp; E-kleuring. Het H &amp; E-kleurprotocol kan in alle studies van leverontwikkeling en -functie worden gebruikt. Bovendien kunnen de paraffine secties worden gebruikt voor immunohistochemie, evenals voor andere speciale staIns in leverpatologie, inclusief de trichroomvlek, reticuline vlek, enz .

<table><tbody><tr><td>1.5 mL centrifuge tubes</td><td>E &amp; K Scientific</td><td>280150</td><td></td></tr><tr><td>15 mL conical tubes</td><td>VWR International</td><td>89039-664</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conical tubes</td><td>VWR International</td><td>89039-658</td><td></td></tr><tr><td>95% ethanol (EtOH)</td><td>Decon Labs, Inc.</td><td>2801</td><td>Ontvlambaar</td></tr><tr><td>Azijnzuur</td><td>Newcomer Supply</td><td>10010A</td><td>Irritant</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Research Products International</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>Aluminium pottenrek</td><td>Newcomer Supply</td><td>5300JRK</td><td></td></tr><tr><td>Bacteriologische petrischalen met deksel</td><td>Corning</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Biopsie pads</td><td>Simport</td><td>M476.1</td><td></td></tr><tr><td>Gelaaide glazen</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-16</td><td></td></tr><tr><td>Heldere montagemedia</td><td>Fisher Scientific</td><td>8310-16</td><td>Kan worden vervangen door andere heldere montagemedia</td></tr><tr><td>Commerciële zeezouten</td><td>Instant Ocean</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>Weggeef microtoommessen</td><td>Fisher Scientific</td><td>4280L</td><td></td></tr><tr><td>Dissectiemicroscoop</td><td>Leica Biosystems</td><td>Leica Mz 95</td><td></td></tr><tr><td>Gesloten weefselprocessor</td><td>Leica Biosystems</td><td>ASP300 S</td><td></td></tr><tr><td>Eosine-Floxine kleurstel</td><td>Newcomer Supply</td><td>1082A</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl alcohol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>Ontvlambaar</td></tr><tr><td>Formaldehyde oplossing, ACS reagens, 37 WT. % in H20, bevat 10 - 15% methanol als stabilisator (om polymerisatie te voorkomen)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549</td><td>Een vermoedelijke carcinogeen; irriterend</td></tr><tr><td>Formaline, gebufferd, 10%</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF100-4</td><td>Een vermoedelijke carcinogeen; irriterend</td></tr><tr><td>Gradueerde mediafles</td><td>VWR International</td><td>16159-520</td><td></td></tr><tr><td>Harris hematoxylinen</td><td>Poly Scientific R&amp;D Corp.</td><td>s212</td><td>Irriterend</td></tr><tr><td>Histologie mallen</td><td>Sakura Finetek USA Inc</td><td>4557</td><td></td></tr><tr><td>Hot plate/Stirrer</td><td>VWR International</td><td>47751-148</td><td></td></tr><tr><td>Zoutzuur (HCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144</td><td>Irriterend</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>VWR International</td><td>97058-220</td><td></td></tr><tr><td>Insulinespuitjes</td><td>BD Medical</td><td>BD-309301</td><td></td></tr><tr><td>Omgekeerde compoundmicroscoop</td><td>Carl Zeiss Microscopy</td><td>491912-9850-000</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Newcomer Supply</td><td>12094E</td><td>Ontvlambaar</td></tr><tr><td>Methyleenblauw</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140</td><td>Irriterend</td></tr><tr><td>Microtoom</td><td>Leica Biosystems</td><td>Leica Jung BioCut 2035&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Nutating mixer</td><td>VWR International</td><td>82007-202</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148-1KG</td><td>Een vermoedelijke carcinogeen; irriterend</td></tr><tr><td>Pasteur pipet</td><td>VWR International</td><td>53283-916</td><td></td></tr><tr><td>Pipetpompen (10 mL)</td><td>VWR International</td><td>53502-233</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchloride (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumfosfaat, monobasic (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>Scheermessen</td><td>Grainger</td><td>4A807</td><td></td></tr><tr><td>Glijden Kleurstel</td><td>Newcomer Supply</td><td>5300KIT</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxide (NaOH)</td><td>Fisher BioReagents</td><td>S318-500</td><td>Zeer gevaarlijk</td></tr><tr><td>Natriumfosfaat, dibasic (Na2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>Roestvrijstalen zeef (5 inch diameter)</td><td>Adaptive Science Tools</td><td>L0906045in</td><td></td></tr><tr><td>Weefsel cassettes</td><td>Simport</td><td>M505.12</td><td></td></tr><tr><td>Weefsel inbedding centrum</td><td>Sakura Finetek USA Inc</td><td>#5100</td><td></td></tr><tr><td>Weefseldoekjes, 1-laags</td><td>Fisher Scientific</td><td>06666A</td><td></td></tr><tr><td>Overdracht pipetten</td><td>Fisher Scientific</td><td>137117M</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine poeder/Ethyl 3-aminobenzoaat methaansulfonaat zout</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td>Irriterend</td></tr><tr><td>Tris base, primaire standaard en buffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Sproeifles, lagedichtheid polyethyleen, brede mond</td><td>Nalge Nunc International</td><td>2402-0750</td><td></td></tr><tr><td>Xyleen</td><td>Fisher Scientific</td><td>X3S-4</td><td>Irriterend</td></tr></tbody></table>

histologische analyses van acute alcoholische leverbeschadiging bij zebravis

Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish

Alcoholische Leverziekte (ALD) verwijst naar schade aan de lever door acute of chronische alcoholmisbruik. Het is een van de belangrijkste oorzaken van alcoholgerelateerde morbiditeit en sterfte en treft meer dan 2 miljoen mensen in de Verenigde Staten. Een beter begrip van de cellulaire en moleculaire mechanismen die aan alcoholgeïnduceerde leverschade liggen, is van cruciaal belang voor het ontwikkelen van een effectieve behandeling voor ALD. Zebravislarven vertoonden hepatische steatosis en fibrogenese na 24 uur blootstelling aan 2% ethanol, waardoor ze nuttig zijn voor de studie van acute alcoholische leverletsel. Dit werk beschrijft de procedure voor acute ethanolbehandeling bij zebravislarven en laat zien dat het leverkleuren en zwelling van de bloedvaten veroorzaakt. Een gedetailleerd protocol voor hematoxyline en Eosin (H &amp; E) kleuring die is geoptimaliseerd voor de histologische analyse van de zebravis larve lever, wordt ook beschreven. H &amp; E-kleuring heeft verschillende unieke voordelen ten opzichte van immunofluorescentie, aangezien het alle levens versterktCellen en extracellulaire componenten tegelijkertijd en kunnen gemakkelijk leverschade detecteren, zoals steatosis en fibrose. Gezien het toenemende gebruik van zebravis in modellerende toxine en door virus geïnduceerde leverletsel, evenals overgeërfde leverziekten, dient dit protocol als referentie voor de histologische analyses die in al deze studies zijn uitgevoerd.

10% gebufferd formaline en 4% paraformaldehyde (PFA) zijn twee van de meest voorkomende fixatiemiddelen die gebruikt worden voor histologiepraktijken. Ze geven echter geen optimale fixatie resultaten voor zebravis leverweefsel ( Figuur 1 en Tabel 1 ). Fixatie met 10% formaline of 4% PFA resulteert vaak in krimpen, waardoor grote lekken ontstaan ​​tussen de lever en de omliggende weefsels ( Figuur 1A , B<...

Dit protocol beschrijft histologische analyses van de levers van zebravislarven die 24 uur met 2% ethanol zijn behandeld. Een dergelijke acute ethanolbehandeling resulteert in hepatische steatosis en zwelling van de hepatische vasculatuur.

Histologische analyses van acute alcoholische leverbeschadiging bij zebravis

Alcoholic Liver Disease (ALD) refers to damage to the liver due to acute or chronic alcohol abuse. It is among the leading causes of alcohol-related ...

Het algemene doel van dit experiment is om de pathohistologie van de lever van zebravissenlarven te evalueren na acute ethanolblootstelling. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van alcoholische leverziekten, zoals de histologische kenmerken van acute alcoholische leverschade en in hoeverre de reacties van de lever van de zebravis op acute alcoholische schade lijken op die bij mensen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat onze ethanolbehandeling robuustere reacties induceert dan andere gepubliceerde methoden.Daarnaast verbetert ons histologieprotocol de weefselintegriteit van de coupes. Begin met het selecteren van maximaal 40 larven 96 uur na bevruchting met opgeblazen zwemblazen met behulp van een Pasteurpipet. Verdeel deze gelijkmatig over twee nieuwe Petrischalen.Verwijder zoveel mogelijk resterend eierwater en voeg vervolgens aan één schaal eierwater met 2% ethanol toe, met een dichtheid van één larve per milliliter. Voeg aan de andere schaal dezelfde hoeveelheid eierwater zonder ethanol toe om als controle te dienen. Bewaar de controlelarven en de met ethanol behandelde larven gedurende 24 uur in de viskamer.Nadat de periode van 24 uur is verstreken, worden de larven verzameld in een centrifugebuisje van 1,5 milliliter met maximaal 20 larven per buisje. Verwijder, terwijl u in de zuurkast werkt, zoveel mogelijk vloeistof bij de larven en voeg vervolgens minstens één milliliter van Dietrich's fixatief toe. Laat de vissen minstens 24 uur fixeren op een nutator bij kamertemperatuur.Zet de weefselcassettes klaar en neem twee blauwe biopsiepads per cassette. Plaats één biopsiepad op de bodem van elke cassette. Label elke cassette met potlood om het monster duidelijk te identificeren.Verwijder, terwijl u in de zuurkast werkt, het fixatief uit de buisjes en was de larven drie keer gedurende vijf minuten per keer met 1 mL PBS. Plaats de buisjes tijdens het wassen op een nutator bij kamertemperatuur. Verhit tijdens de wasbeurten 3% agarose in water met een magnetron om het vaste materiaal te smelten.Verwarm telkens 30 seconden en let goed op om koken te minimaliseren. Zodra de agarose is opgelost, plaatst u de vloeibare agarose op een warmteplaat die is ingesteld op 90 °C onder zacht roeren. Breng met een transferpipet maximaal acht larven over naar een plastic histologievorm en verwijder zoveel mogelijk PBS.Vul de mal volledig met 3% agarose met behulp van een transferpipet waarvan de punt is afgesneden. Gebruik vervolgens een insulinespuit om de larven naar het centrum van de mal te verzamelen en druk ze naar de bodem. Positioneer de larven voor sagittale doorsneden in een lijn met de koppen naar de bovenkant van de mal. Om ervoor te zorgen dat de levers op een consistente manier zijn georiënteerd, draait u de larven zodanig dat de linkerzijde van het lichaam naar beneden is gericht en plat tegen de bodem van de mal ligt.Laat de agarose vier tot vijf minuten uitharden, verwijder vervolgens het agaroseblok uit de mal en gebruik een scheermesje om de agarose rondom de larven bij te trimmen. Zet het blok rechtop en snijd de dikte doormidden, zodat het uiteindelijke blok ongeveer twee tot drie millimeter dik is. Plaats het kleine agaroseblok in de voorbereide weefselcassette en leg het tweede biopsiepad bovenop het blok.Sluit de cassette en plaats de volledig geassembleerde cassette in een afsluitbare container met vers bereide 70% ethanol in dubbel gedestilleerd water. Gebruik na het inbedden van het weefsel in paraffine een microtoom om het overtollige paraffine dat het weefsel bedekt te verwijderen door coupes van vijf micron te snijden totdat het weefsel aan het oppervlak van het paraffineblok zichtbaar is; stop vervolgens en gooi alle gemaakte coupes weg. Week de blokken met de zijde van het weefsel naar beneden in PBS en bewaar deze gedurende de nacht bij vier graden Celsius.Verwijder de volgende dag één voor één de blokken uit de PBS en snijd coupes van vijf micron met een microtoom. Scheid het lint van de coupes van het mesje door de laatste coupe voorzichtig met een pincet of een penseel van het mesje weg te trekken. Gebruik het pincet om het lint bij de laatste coupe op te pakken en breng het over naar een waterbad op 42 °C.Laat de linten minstens vijf minuten op het wateroppervlak drijven. Gebruik de pincet om secties in kleinere groepen te scheiden zodat ze op de objectglazen passen. Plaats een geladen objectglas onder een hoek van 45 graden in het water en positioneer het voorzichtig onder de groep secties die verzameld moeten worden.Til de objectglas voorzichtig uit het water en laat de coupes aan het glas hechten. Dep eventueel overtollig water van de coupes met pluisvrij weefsel. Plaats het objectglas in een objectglashouder of -doos.Ga door met het snijden van het blok totdat het gewenste weefsel is verzameld. Bak de coupes na voltooiing gedurende drie tot 16 uur in een incubator of oven op 55 °C om de paraffine te smelten. Controleer na de ingestelde tijd of de paraffine is gesmolten en laat de coupes afkoelen voor het kleuren.Deparaffineer de coupes door ze tweemaal gedurende 15 minuten onder te dompelen in 100% xyleen, en rehydrateer de coupes vervolgens via een ethanolgradiënt. Dip de coupes voor elke oplossing acht tot 10 keer gedurende twee seconden per dip, totdat de vloeistof volledig van de coupes afloopt. Plaats de coupes gedurende vier minuten in 100% gefilterde Harris Hematoxylin.Breng ze na vier minuten snel terug naar de bak met gedeïoniseerd water. Laat gedeïoniseerd water in de achterhoek van de bak lopen, zo ver mogelijk weg van de coupes. Leeg de bak periodiek totdat het water niet langer paars is.Controleer snel de intensiteit van de hematoxyline op een dissectiemicroscoop met zwanenhalslampen. Plaats de coupes voor één minuut terug in 100% hematoxyline als verdere kleuring is vereist. Zodra de gewenste hematoxylinekleuring is bereikt, worden de coupes tweemaal gedoopt in 0,05% zoutzuur en vervolgens onmiddellijk teruggeplaatst in de container met schoon gedeïoniseerd water.Leeg de container en vul deze twee keer opnieuw met water. Breng de objectglazen over naar twee containers met 95% ethanol gedurende elk 30 seconden. Plaats de objectglazen gedurende twee minuten in de Eosine Y-Phloxine B-oplossing.Breng de coupes na twee minuten terug naar de vorige container met 95% ethanol en controleer vervolgens de kleurintensiteit onder de dissectiemicroscoop. Als de kleuring onvoldoende is, brengt u ze gedurende 30 seconden terug naar de eosine-oplossing. Herhaal dit indien nodig.Wanneer de gewenste kleurintensiteit is bereikt, worden de objectglazen gedurende 15 seconden overgebracht naar 100% isopropanol. Vervang dit door verse 100% isopropanol en plaats de objectglazen opnieuw gedurende 15 seconden in de isopropanol. Herhaal dit proces voor een totaal van zes isopropanol-wassingen.Verwijder na drie minuten onderdompeling in 100% xyleen één objectglas. Voeg voldoende montagemedium toe om de coupes te bedekken en dip het objectglas vervolgens in 100% xyleen. Plaats een dekglas op het objectglas en dep overtollig montagemedium op een papieren handdoek totdat er slechts een dunne lijn zichtbaar is; dip daarna een tissue in het xyleen en veeg de achterkant van het objectglas schoon om eventuele druppels medium te verwijderen.Plaats het preparaat plat op een stevig maar verplaatsbaar oppervlak, zoals een stuk karton, en laat het xyleen gedurende 10 minuten verdampen in de zuurkast. Laat de preparaten overnight bij kamertemperatuur liggen zodat het inbeddingsmedium kan uitharden vóór de beeldvorming. Deze zebravislarvelever van 120 uur post-fertilisatie werd gedurende 24 uur bij kamertemperatuur ondergedompeld in Dietrichs fixatief.Het fixatief van Dietrich zorgt voor de optimale fixatie van dit weefsel. Bij fixatie met 10% formaline verliezen de hepatocyten vaak hun cytoplasma. Het weefsel wordt niet correct gekleurd met eosin en ziet er paars uit.Na fixatie met 4% PFA zijn er openingen zichtbaar tussen de hepatocyten. 4% PFA veroorzaakt krimp van het leverweefsel, waardoor er een grote opening lijkt te zijn tussen de lever en de omliggende weefsels. De stippellijn markeert de grens van de omliggende weefsels.Deze afbeelding bij een hogere vergroting toont de H&amp;E-kleuring van de lever in een onbehandelde controlelarve van het wildtype die deel uitmaakte van een ethanolbehandelingsstudie. Ook dit dier werd gefixeerd met Dietrich-fixeermiddel op 120 uur na bevruchting. Deze afbeelding toont het effect van behandeling met 2% ethanol van 96 tot 120 uur na bevruchting op de lever.Deze acute ethanolbehandeling veroorzaakt hepatische steatose en zwelling van de bloedvaten. De pijlen wijzen naar de hepatocyten met overmatige depositie van ronde druppeltjes, en de asterisken markeren de gezwollen hepatische bloedvaten. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de ethanolbehandeling moet plaatsvinden in een visfaciliteit met een licht-donkercyclus.Gebruik voor H&E Dietrichs fixatief voor een optimale weefselconservering. Denk er daarnaast aan om de kleurintensiteit regelmatig te controleren om overkleuring of onderkleuring te voorkomen.

histological-analyses-of-acute-alcoholic-liver-injury-in-zebrafish

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Om de moleculaire mechanismen van de ethanol-geïnduceerde ontwikkelingsschade begrijpen, hebben we een zebravis model van ethanol blootstelling en het verkennen van de fysieke, cellulaire en genetische veranderingen die optreden na blootstelling aan...

Het beoordelen van Teratogene Veranderingen in een zebravis model van foetale blootstelling aan alcohol

Om de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de door de galgangen gestuurde leverregeneratie bij zebravis te helpen beoordelen, hebben we een leverbeschadigingsmodel opgesteld waarin de nitroreductase-expresserende hepatocyten genetisch worden afgebroken na behandeling met metronidazol. In dit protocol beschrijven we hoe we op bekwame wijze hepatocytenafbraak en door galgangen gestuurde leverregeneratie kunnen manipuleren, bewaken en analyseren.

Hepatocyt-specifieke Ablation in zebravis-Biliary gedreven leverregeneratie Studie

Aanhoudende fibrose met afzetting van overmatige extracellulaire matrix-eiwitten leidt tot cirrose. Alcoholmisbruik is een van de belangrijkste oorzaken van ernstige leverziekten. We hebben een ethanol-geïnduceerde zebravis model van een fibrotische lever opgezet om de mechanismen en strategieën van het bevorderen van hepatocytenregeneratie bij alcohol-geïnduceerde schade te bestuderen.

Ontwikkeling van een ethanol-geïnduceerde fibrotische lever Model in zebravis om te studeren Progenitor Cell-gemedieerde Hepatocyt Regeneration

Hier demonstreren we een methode voor het kwantificeren van levergrootte bij larve zebravissen, die een manier bieden om de effecten van genetische en farmacologische manipulaties op levergroei en ontwikkeling te beoordelen.

Kwantificerende levergrootte bij larvale zebravissen met behulp van Brightfield Microscopie

Dit werk beschrijft een protocol om ethanolniveaus in een embryo van zebravissen te kwantificeren met behulp van hoofdruimtegaschromatografie van de juiste blootstellingsmethoden voor embryoverwerking en ethanolanalyse.

Kwantificering van ethanolniveaus in zebravisembryo's met behulp van head space gaschromatografie

Dit protocol beschrijft de procedure voor het verwijderen van de ventrale kwab van de lever bij volwassen zebravissen om de studie van leverregeneratie mogelijk te maken.

Gedeeltelijke hepatectomie bij volwassen zebravissen

Hier presenteren we hoe we een niet-alcoholische leververvetting (NAFLD) -geassocieerd Hepatocellulair Carcinoom (HCC) zebravismodel kunnen genereren om de impact van cholesteroloverschot op de micro-omgeving van de lever en het immuuncellandschap te bestuderen.

Analyse van levermicro-omgeving tijdens vroege progressie van niet-alcoholische leververvetting-geassocieerd hepatocellulair carcinoom bij zebravissen

Het doel van het huidige protocol is om de stappen te schetsen die nodig zijn om een sociale voorkeurstest voor volwassen zebravissen op te zetten en te gebruiken en aan te tonen dat deze kan worden gebruikt om door ethanol geïnduceerde sociale defecten te karakteriseren.

Modellering van foetale alcoholspectrumstoornissen bij zebravissen om de impact van een ongunstige embryonale omgeving op het sociale gedrag van volwassenen te karakteriseren

Hier presenteren we een betrouwbare methode om regeneratie van volwassen nieren te bestuderen door acute nierbeschadiging te induceren door gentamicine-injectie. We tonen aan dat de schade afhankelijk is van de gentamicine-dosering en de omgevingstemperatuur door middel van in situ hybridisatie om lhx1a+ zich ontwikkelende nieuwe nephronen te labelen.

Nier Regeneratie in Adult zebravis door Gentamicin geïnduceerd letsel

Dit artikel beschrijft een methode voor het creëren van een mechanische vaatbeschadiging bij zebravisembryo's. Dit verwondingsmodel biedt een platform voor het bestuderen van hemostasis, verwondingsgerelateerde ontsteking en wondgenezing in een organisme dat bij uitstek geschikt is voor real-time microscopie.

Mechanische vatverwonding in zebravis embryo&#39;s

Leer histologische analyses van acute alcoholische leverbeschadiging bij zebravislarven met 2% ethanol. Deze methode induceert hepatic steatosis en vasculaire zwelling om leverpathologie te bestuderen.

Histologische analyses van acute alcoholische leverbeschadiging bij zebravis

Meer video's verkennen