Primaire cultuur van neuronen geïsoleerd van embryonale muis cerebellum
26 oktober 2019
Het uitvoeren van in vitro experimenten om zo goed mogelijk te reflecteren in vivo omstandigheden is geen gemakkelijke taak. Het gebruik van primaire celculturen is een belangrijke stap naar begrip van celbiologie in een heel organisme. Het meegeleverde protocol schetst hoe succesvol groeien en cultuur embryonale muis cerebellaire neuronen.
Primaire neuronale celcultuur is een ideaal modelsysteem om gescheiden neuronen in vitrocultuur te bestuderen. Het voordeel van het gebruik van deze methode is de mogelijkheid om de cellulaire kenmerken van gescheiden cellen, zoals mechanismen, functies en morfologie in vitro voorwaarden te behouden voor een paar weken zo dicht mogelijk bij in vivo conditie. Zet de ronde afdek slips in een 24-put plaat onder de biosafety kast.
Voeg 90 microliter poly-L-ornithine toe aan elke afdeksel. Sluit de dop en plaats de plaat voorzichtig in de 37 graden couveuse gedurende twee dagen. Bereid het kweekmedium en het zaaimedium voor en houd ze op vier graden Celsius.
Bereid de werkende trypsineoplossing in DMEM/F12 voor en houd deze op vier graden. Plaats het kweekmedium en het zaaimedium in de couveuse op 37 graden. Haal de 24-put plaat uit de couveuse.
Was de hoesjes drie keer met dubbel gedestilleerd water. Laat de afdekking minstens twee uur volledig drogen. Bereid drie petrischaaltjes gevuld met koude PBS, drie petrischaaltjes gevuld met koude HBSS en vijf petrischaaltjes gevuld met koud dissectiemedium op ijs.
Accijns de baarmoeder hoorns en was ze in koude PBS drie keer op ijs. Vanaf hier moeten alle stappen op ijs worden uitgevoerd om weefselschade te minimaliseren. Na de laatste wasstap, scheid de pups van de baarmoeder in HBSS en breng ze over naar het koude dissectiemedium.
In dissectie medium, onthoofden de pups met een schaar. Open het calvarium van de foramen magnum naar de inferieure grens van de orbitale holte. Met behulp van een paar fijne tangen, verwijder de schedelbasis en schil de schedel uit de buurt van de hersenen.
Verwijder voorzichtig de hersenvliezen van het cerebellum vanaf het zijdelingse oppervlak van de middelste cerebellar peduncle en pons. Snijd beide cerebellar peduncles en scheiden het cerebellum van de rest van de hersenen. Plaats de verzamelde cerebella onmiddellijk in een steriele 15 mL conische buis gevuld met DMEM/F12 op ijs.
Centrifugeren de buis op 1,000 g bij vier graden gedurende een minuut in DMEM/F12. Herhaal dit drie keer, elke keer voorzichtig verwijderen van de supernatant met een pipet en opnieuw ophangen van de pellet in verse DMEM/F12. Voeg twee milliliter voorverwarmde trypsine en voorzichtig pipet om ze samen te mengen.
Plaats de buis in een 37 graden waterbad gedurende 12 minuten. Breng na incubatie de buis naar de veiligheidskast en voeg 10 mLs DMEM/F12 toe om de trypsine te activeren. Centrifugeren het mengsel op 1, 200 g's gedurende vijf minuten.
Gooi de supernatant en resuspend in vers medium, gevolgd door centrifugatie drie keer. Voorwet een steriele plastic pipet met DMEM/F2. Voeg 3,5 milliliter DNAse werkoplossing toe aan dezelfde buis.
Triturate het weefsel met een pipet meerdere malen totdat de vloeistof een homogene melkachtige kleur bereikt. Voeg 10 mL koude DMEM/F12 toe aan het mengsel en ga naar de centrifuge. Centrifugeren het monster op 1, 200 g bij vier graden gedurende vijf minuten.
Verwijder de supernatant voorzichtig zonder de pellet te storen. Haal het zaaimedium uit de couveuse. Voeg 500 microliters van voorverwarmd zaaimedium toe en meng het goed met behulp van de pipet.
Tel de cellen met behulp van een hemocytometer. Verdun de celsuspensie met zaaimedium tot een dichtheid van 500.000 cellen per milliliter. Voeg 90 microliter van het mengsel toe aan elke put in het midden van de coverslip.
Plaats de plaat in de couveuse op 37 graden gedurende drie tot vier uur. Voeg na incubatie 500 microliters van voorverwarmd kweekmedium toe aan elke put. Vervang de plaat op 37 graden in de couveuse.
Na zeven dagen, vervang het oude medium door verse cultuur medium II.Bereid een aparte 24-well plaat met bijbehorende numerieke organisatie en voeg 100 microliters van PFA 4%aan elke put. Na de gewenste dagen in de cultuur, verwijder voorzichtig de deksel slips uit de putten van de oorspronkelijke cultuur plaat en plaats ze in de overeenkomstige putten van de PFA plaat beschreven in de vorige stap. Voeg PFA toe aan de putten om de afdekslips volledig onder te dompelen.
Houd de PFA-plaat gedurende 30 tot 120 minuten op vier graden. Na incubatie, herstel de plaat op kamertemperatuur. Was de hoes glijden zachtjes met PBS gedurende vijf minuten drie keer.
Figuur twee in de tekst toont cerebellar celcultuur vanaf E18. Immunofluorescentie voor calbindin toont Purkinje neuronen met axonale extensies met drie dagen in vitro. Met zeven tot 10 dagen in vitro zijn dendritische processen duidelijk.
Na 21 dagen zijn complexe dendritische takken aanwezig. Figuur drie in de tekst toont cerebellar celculturen vanaf verschillende embryonale dagen. immunofluorescentiedetectie van calbindin toont Purkinje-neuronen met vroege axonen pas na 18 dagen in vitro.
Purkinje neuron culturen begonnen bij E14 en E15 zal ontwikkelen dendrieten, maar nooit zo complex als die zich ontwikkelen wanneer E18 is het uitgangspunt. Figuur vier in de tekst laat zien dat verschillende celtypen zich ontwikkelen van E18-culturen na 21 dagen in vitro. Calbindin groene immunofluorescentie toont Purkinje neuronen.
Rode immunofluorescentie voor parvalbumine in B en C vertonen remmende interneuronen. Rode immunofluorescentie voor natriumspanningskanaal in E en F toont korrelneuronen. Het huidige protocol is kosteneffectief en gemakkelijk uit te voeren.
Aan het einde van deze video, zult u in staat zijn om te verzamelen en cultuur cerebellar neuronen en vast te stellen op de gewenste DIVs.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie beschrijft een protocol voor het succesvol kweken van embryonale muizen cerebellum neuronen in vitro, die in vivo-omstandigheden weerspiegelen. Door gebruik te maken van primaire neuronale celcultuur, kunnen onderzoekers de cellulaire kenmerken, mechanismen en functies die geassocieerd zijn met cerebellum neuronen beter begrijpen.
Belangrijke Studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Celbiologie
- Neuronale Ontwikkeling
Achtergrond
- Het uitvoeren van in vitro experimenten die in vivo-omstandigheden weerspiegelen, is uitdagend.
- Primaire celculturen bieden inzicht in de celbiologie binnen een organisme.
- Het cerebellum is cruciaal voor motorische controle en cognitieve functies.
Doel van de Studie
- Om een gedetailleerd protocol te bieden voor het kweken en cultiveren van cerebellum neuronen.
- Om onderzoek naar de kenmerken van neuronale cellen in vitro te vergemakkelijken.
- Om verdere studies naar de ontwikkeling en functie van cerebellum neuronen mogelijk te maken.
Gebruikte Methoden
- Het belangrijkste platform dat wordt gebruikt, is primaire neuronale celcultuur.
- Het biologische model bestaat uit embryonale muizen cerebellum neuronen.
- Belangrijke stappen omvatten weefselextractie, trypsinisatie en celzaaien.
- Celculturen worden onder specifieke omstandigheden gehouden voor rijping en analyse.
Belangrijkste Resultaten
- Purkinje neuronen vertonen vroege axon groei en ontwikkelen later complexe dendritische structuren in vitro.
- Verschillende embryonale startdagen leveren uiteenlopende ontwikkelingsresultaten op bij neuronen.
- Het protocol is eenvoudig, kosteneffectief en toepasbaar voor neuronale studies.
Conclusies
- Deze studie biedt een waardevolle aanpak voor het kweken van cerebellum neuronen.
- De bevindingen verbeteren ons begrip van neuronale ontwikkeling en kenmerken in vitro.
- Het protocol is nuttig voor toekomstig onderzoek naar neurologische functies en stoornissen.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
Establishing reliable in vitro models of cerebellar neurons supports target validation in neurodevelopmental and neurodegenerative disease research. Primary cultures enable mechanistic de-risking by preserving neuronal morphology, electrophysiology, and marker expression over extended periods. This approach enhances predictive confidence in early discovery by providing a disease-relevant system for screening and pathway analysis.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in cerebellar pathways using dissociated neurons that retain in vivo-like features.
- Operational Value: Supports functional target validation through longitudinal monitoring of Purkinje neuron maturation and dendritic complexity.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by modeling embryonic-stage neuronal development relevant to early-onset neurological disorders.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a standardized, reproducible platform for assessing compound effects on neuronal survival, differentiation, and marker expression.
- Operational Value: Enables quantitative immunofluorescence readouts (e.g., calbindin, parvalbumin, sodium channels) for high-content screening applications.
- Scalability: Compatible with multi-well formats and long-term culture up to 21 days in vitro for chronic compound exposure studies.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Captures embryonic-day-dependent developmental trajectories, allowing modeling of genotype-phenotype correlations in cerebellar disorders.
- Mechanistic De-risking: Supports biomarker alignment via cell-type-specific immunofluorescence (Purkinje, interneuron, granule neuron markers) to validate target engagement.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables evaluation of neuroprotective or neurorestorative candidates through structural and functional maturation metrics.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing a biologically relevant system for hypothesis testing and assay validation prior to lead optimization.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and target validation in cerebellar signaling networks using embryonic neuron cultures.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible neuronal cultures with quantifiable morphological and molecular endpoints.
- Analytics: Generates immunofluorescence-based readouts for protein expression, axonal outgrowth, and dendritic arborization to compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects embryonic cerebellar development to preclinical models through conserved marker expression and maturation timelines.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable neuronal culture platform applicable across multiple projects targeting neurodevelopmental pathways.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by maintaining neuronal identity and function over weeks in culture, reducing false positives in target validation.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized dissociation, plating, and maturation protocols with defined media changes.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early assessment of compound effects on neuronal health and differentiation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of candidates based on effects on cerebellar neuron subtypes and maturation stages.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryonic tissue dissection, sterile cell culture, and immunofluorescence techniques.
- Depends on access to biosafety cabinets, incubators, centrifuges, and fluorescence microscopes for validation.
- Necessitates standardization of embryonic day selection (E12–E18) and seeding density (500,000 cells/mL) for cross-experiment consistency.
- Involves adaptation considerations when extending protocols to other brain regions or postnatal neuronal subtypes.
- Includes practical limitations such as gradual loss of non-neuronal glial support over time in culture, which may affect neuronal maturation.
