Name: In vivo augmentatie van gut-homing regulatoire T Cell inductie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Leer hoe je de inductie van darm-homende regulatoire T-cellen versterkt via geëngineerde dendritische cellen. Deze methode werkt zelfs in sterk pro-inflammatoire omgevingen en is aanpasbaar voor humane toepassingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door het Bureau van de adjunct-secretaris van defensie voor gezondheidszaken via het peer reviewed medisch onderzoeksprogramma onder Awardnr. W81XWH-15-1-0240 (XT). Meningen, interpretaties, conclusies en aanbevelingen zijn die van de auteur en worden niet noodzakelijkerwijs onderschreven door het ministerie van defensie. Dit werk werd ook gedeeltelijk ondersteund door onderzoeks-innovatie subsidies van het departement geneeskunde aan de Loma Linda University (681207-2967 [XT en GG], 681205-2967 [XT] en 325491 [DJB]).

Alle in vivo dierenstudie protocollen werden beoordeeld en goedgekeurd door de Loma Linda University institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC), evenals het Bureau voor Dierverzorging en-gebruik (ACURO) van de US Army Medical Research and materiel Command (USAMRMC) van de Ministerie van defensie.
1. bereiding van het lentivirus dat zowel 1α-hydroxylase als RALDH2 (Lenti-CYP-ALDH virus) uitdrukt
<ol><li>Dag 0: bereid in de vroege ochtend 5 x 105 cellen/ml 293t cellen in het cm-10-D celkweekmedium voor.</li>
	<li>Zaad 20 mL/plaat in 150 mm x 25 mm cultuur gerechten. Kweek de cellen bij 37 °C en 5% CO2 voor 24 h. confluency zal ~ 80 – 90% bereiken na 24 uur.</li>
	<li>Dag 1: Maak 2x HBS (50 mM HEPES, 280 mM NaCl en 1,5 mM na2HPO4, pH 7,1). Aliquot en bewaren bij-20 °C.</li>
	<li>Maak 2 M CaCl2 en bewaar deze bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Voor elke 150 mm x 25 mm kweek schaal bereidt u een DNA-precipitatie mengsel voor in een steriele 50 mL kweek buis. Voeg eerst 1.620 μL van 2x HBS, 9,5 μg PMD2G (VSVG), 17,5 μg pCMVR 8.74 (Capsid), 27 μg Lenti-CYP-ALDH plasmide (een linviraal vector dat zowel CYP27B1 als ALDH1a2 draagt). Voeg vervolgens H2O toe aan een eindvolume van 3.037,5 μL.</li>
	<li>Voeg in de laatste 202,5 μL 2 M CACL2 druppelsgewijs toe tijdens het mengen van de oplossing tot de eindconcentraties van 1x HBS en 125 mm CACL2. CaCl2 moet de laatste zijn die moet worden toegevoegd. Laat de transfectie mengsels bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten met occasioneel mengen. Voor meerdere 150 mm x 25 mm cultuur gerechten, opschalen dienovereenkomstig.</li>
	<li>Voeg de 3.240 μL DNA precipitatie mengsel druppelsgewijs toe aan 1 150 mm x 25 mm kweek schotel met de 293t cellen. Zwenk de cultuur schaal voorzichtig met de zijkant terwijl het DNA-precipitatie mengsel wordt toegevoegd. Incuberen de schaal bij 37 °C en 5% CO2 voor 24 uur.</li>
	<li>Dag 2: Verwijder de calciumfosfaat transfectie oplossing, was zachtjes met 1x PBS en voer de celkweek opnieuw uit met het CM-4-D celkweekmedium. Inincuberen de cellen bij 37 °C en 5% CO2 voor 24 uur.</li>
	<li>Dag 3: oogst de supernatanten in steriele opslag flessen en bewaar bij 4 – 8 °c. Vul de celcultuur aan met het verse CM-4-D celkweekmedium. Kweek de cellen bij 37 °C en 5% CO2 voor nog eens 24 uur.</li>
	<li>Dag 4: oogst de supernatanten in steriele opslag flessen. Filtreer de supernatanten van dag 3 en dag 4 door een filter van 0,45 μm. Om het vsvg pseudo type virus te concentreren, breng de supernatanten over in centrifugebuizen en spin op 4.780 x g gedurende 24 uur bij 4 °c.</li>
	<li>Dag 5: giet de supernatanten van de pellets (de pellet is vaak zichtbaar) en laat de buisjes gedurende enkele minuten op een papieren handdoek in een steriele bioveiligheids kast lekken.</li>
	<li>Respendeer de pellets door pipetteren met steriele PBS met 5% glycerol. Het volume voor resuspensie is 33,3 μL per 150 mm x 25 mm kweek schaal.</li>
	<li>Aliquot 200 μL/buis en bewaren bij-80 °C. Maak een apart aliquot van 50 μL/injectieflacon voor titratie doeleinden. Titers moeten binnen het bereik van 108– 109 Transducing units (TUs)/ml.</li>
	<li>Voeg Bleach toe aan de cultuur gerechten en gooi ze weg. Opmerking: deze getransfunteerde cellen zijn de grootste veiligheidszorg in het Protocol, omdat alle linvirale elementen in de cellen worden uitgedrukt.</li>
</ol>2. generatie van in het beenmerg afgeleide DCs (Bmdc's)
<ol><li>Oogst scheen en dijbeen van 4 – 5 Balb/c muizen in een steriele polypropyleen buis van 50 ml met het kweekmedium6.</li>
	<li>Breng de scheen en dijbeen over in een kweek schaal van 100 mm x 20 mm die het kweekmedium bevat. Verwijder weefsels zoals spieren uit de scheen en dijbeen met behulp van ontleden schaar en Tang.</li>
	<li>Snijd beide uiteinden van de scheen en dijbeen om de beenmerg holte bloot.</li>
	<li>Trek 10 mL kweekmedium in een injectiespuit van 10 mL die aan een naald van 30 G is bevestigd.</li>
	<li>Steek de naald voorzichtig in de beenmerg Holte en spoel het beenmerg in een schone 50 mL steriele polypropyleen buis. Herhaal deze procedure indien nodig om ervoor te zorgen dat het beenmerg volledig is uitgespoeld.</li>
	<li>Pellet de beenmergcellen door centrifugeren (400 x g) bij 2 – 8 °c gedurende 5 min. aspireren de supernatant.</li>
	<li>Respendeer de pellet met 5 mL 1x rode bloedcel lysisbuffer.</li>
	<li>Incuberen de cellen bij kamertemperatuur gedurende 4 – 5 minuten met occasioneel schudden.</li>
	<li>Stop de reactie door 30 mL kweekmedium toe te voegen.</li>
	<li>Pellet de cellen door centrifugeren (400 x g) bij 2 – 8 °c gedurende 5 min. respendeer de cellen in 10 ml cm-10-R celkweekmedium. Indien nodig kunnen de cellen worden doorgegeven via een 40 μm celzeef om vuil te verwijderen.</li>
	<li>Voer een celtelling uit en pas de cellen aan op 1 x 106 cellen/ml met behulp van het celkweekmedium van cm-10-R.</li>
	<li>Voeg recombinant Murine granulocyt/macrofaag kolonie-stimulerende factor (GM-CSF, uiteindelijke concentratie = 100 U/mL) en Murine Interleukine-4 (IL-4, uiteindelijke concentratie = 10 U/mL). Opmerking: de stockoplossingen van GM-CSF en IL-4 worden opgeslagen bij-80 °C bij respectievelijk 100.000 U/mL (1.000 x) en 10.000 U/mL (1.000 x).</li>
	<li>Verdeel de cellen in 6 goed cultuur platen op 4 mL/goed en kweek de cellen bij 37 °C en 5% CO2 voor 48 h.</li>
	<li>Verwijder niet-aanhangende cellen met zachte Pipetteer.</li>
	<li>Voeg een vers CM-10-R celkweekmedium toe dat de GM-CSF (100 U/mL) en IL-4 (10 U/mL) bevat. Kweek de cellen voor een ander 48 h.</li>
	<li>Oogst niet-aanhandige cellen (Bmdc's) voor transductie door het Lenti-CYP-ALDH-virus.</li>
</ol>3. transductie van DCs met Lenti-CYP-ALDH-virus om DC-CYP-ALDH-cellen te genereren
<ol><li>Bereid 1 x 106 DCS/goed voor in een totaal volume van 0,5 ml cm-10-R celkweekmedium met 50 μL virus en 8 μg/ml protamine in een 6-kweek plaat.</li>
	<li>Kweek de cellen bij 37 °C en 5% CO2 voor 24 uur.</li>
	<li>Vervang het medium met het verse CM-10-R celkweekmedium en kweek de cellen bij 37 °C en 5% CO2 voor nog eens 24 uur. Op dit moment kunnen de enzymatische activiteiten van 1α-hydroxylase en RALDH2 worden geëvalueerd (zie stap 4). Herhaal indien nodig de stappen 3.1 – 3.3 voor een tweede transductie.</li>
	<li>Toevoegen lipopolysaccharide (100 ng/mL) en cultuur van de cellen voor 24 h.</li>
	<li>Oogst de cellen (DC-CYP-ALDH-cellen) voor experimenten.</li>
</ol>4. evaluatie van de overgebrachte 1α-hydroxylase en RALDH2 in DC-CYP-ALDH-cellen
<ol><li>Evaluatie van de overgebrachte 1α-hydroxylase in DC-CYP-ALDH-cellen<ol>
<li>Zaad 1,0 x 106 DC-CYP-aldh cellen/goed in 2 ml cm-10-R cel cultuurmedium in 12 goed cultuur platen.</li>
		<li>Voeg 25 (OH) D toe aan de eindconcentratie van 2,5 μM. Incuberen de DC-CYP-ALDH-cellen gedurende 24 uur.</li>
		<li>Oogst de supernatanten en bewaar bij-20 °c.</li>
		<li>Test voor 1,25 (Oh)2D concentraties in de supernatanten met behulp van een in de handel verkrijgbare radioimmunoassay (RIA) (Zie tabel met materialen).</li>
		<li>Bepaal de expressie van 1α-hydroxylase in DC-CYP-ALDH-cellen door fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) met behulp van een anti-CYP27B1 antilichaam.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Evaluatie van de overgeuite RALDH2 in DC-CYP-ALDH-cellen Opmerking: de expressie en activiteit van de overgebrachte RALDH2 worden bepaald met behulp van een commerciële aldehyde dehydrogenase (ALDH)-detectiekit (Zie tabel met materialen).<ol>
<li>Zaai 1 mL DC-CYP-ALDH-of controle cellen (1 x 105 cellen/ml in de test buffer) in elk van de twee buisjes van 5 ml (één gelabeld als "controle" en het andere gelabeld als "test").</li>
		<li>Voeg 10 μL diëthylaminobenzaldehyde (DEAB) oplossing (1,5 mM in 95% ethanol) toe aan elk van de regel buizen en meng onmiddellijk. DEAB is een RALDH2 remmer.</li>
		<li>Voeg 5 μL geactiveerd RALDH fluorescentie substraat (300 μM) toe aan de besturings-en reageerbuisjes en meng onmiddellijk.</li>
		<li>Inincuberen van de buizen voor 45 min.</li>
		<li>Pellet de cellen door centrifugeren bij 400 x g bij 2 – 8 °c gedurende 5 min. aspireren de supernatants.</li>
		<li>Reconstitueer de cellen in 200 μL test buffer.</li>
		<li>Houd de cellen op ijs en ga voor analyse door FACS.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Abraham, C., Cho, J. H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19923578">Inflammatory bowel disease.</a> New England Journal of Medicine. 361 (21), 2066-2078 (2009).</li>
<li>Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20192811">Inflammatory bowel disease.</a> Annual Reviews in Immunology. 28, 573-621 (2010).</li>
<li>Clifford, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natalizumab-associated+progressive+multifocal+leukoencephalopathy+in+patients+with+multiple+sclerosis%3A+lessons+from+28+cases%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurology%22%5BJournal%5D)">Natalizumab-associated progressive multifocal leukoencephalopathy in patients with multiple sclerosis: lessons from 28 cases.</a> Lancet Neurology. 9 (4), 438-446 (2010).</li>
<li>Linda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+multifocal+leukoencephalopathy+after+natalizumab+monotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Progressive multifocal leukoencephalopathy after natalizumab monotherapy.</a> New England Journal of Medicine. 361 (11), 1081-1087 (2009).</li>
<li>Fischer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+alpha4beta7+and+GPR15+on+homing+of+effector+and+regulatory+T+cells+from+patients+with+UC+to+the+inflamed+gut+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Differential effects of alpha4beta7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo.</a> Gut. 65 (10), 1642-1664 (2016).</li>
<li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Generation+of+Gut-Homing+Regulatory+T+Cells+for+the+Suppression+of+Colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">In Vivo Generation of Gut-Homing Regulatory T Cells for the Suppression of Colitis.</a> Journal of Immunology. 202 (12), 3447-3457 (2019).</li>
<li>Rosenblum, M. D., Way, S. S., Abbas, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+T+cell+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Regulatory T cell memory.</a> Nature Reviews Immunology. 16 (2), 90-101 (2016).</li>
<li>Grimm, A. J., Kontos, S., Diaceri, G., Quaglia-Thermes, X., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+of+tolerance+and+induction+of+regulatory+T+cells+by+erythrocyte-targeted+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Report%22%5BJournal%5D)">Memory of tolerance and induction of regulatory T cells by erythrocyte-targeted antigens.</a> Science Report. 5, 15907(2015).</li>
<li>Kim, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+inhibitory+activity+of+regulatory+T+cells+requires+the+transcription+factor+Helios%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stable inhibitory activity of regulatory T cells requires the transcription factor Helios.</a> Science. 350 (6258), 334-339 (2015).</li>
<li>Bhela, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Plasticity+and+Stability+of+Regulatory+T+Cells+during+Viral-Induced+Inflammatory+Lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The Plasticity and Stability of Regulatory T Cells during Viral-Induced Inflammatory Lesions.</a> Journal of Immunology. 199 (4), 1342-1352 (2017).</li>
<li>Bluestone, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+1+diabetes+immunotherapy+using+polyclonal+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Type 1 diabetes immunotherapy using polyclonal regulatory T cells.</a> Science Translational Medicine. 7 (315), (2015).</li>
<li>Marek-Trzonkowska, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapy+of+type+1+diabetes+with+CD4%28%2B%29CD25%28high%29CD127-regulatory+T+cells+prolongs+survival+of+pancreatic+islets+-+results+of+one+year+follow-up%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Therapy of type 1 diabetes with CD4(+)CD25(high)CD127-regulatory T cells prolongs survival of pancreatic islets - results of one year follow-up.</a> Clinical Immunology. 153 (1), 23-30 (2014).</li>
<li>Desreumaux, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+efficacy+of+antigen-specific+regulatory+T-cell+therapy+for+patients+with+refractory+Crohn%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Safety and efficacy of antigen-specific regulatory T-cell therapy for patients with refractory Crohn's disease.</a> Gastroenterology. 143 (5), 1201-1202 (2012).</li>
<li>Di Ianni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tregs+prevent+GVHD+and+promote+immune+reconstitution+in+HLA-haploidentical+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Tregs prevent GVHD and promote immune reconstitution in HLA-haploidentical transplantation.</a> Blood. 117 (14), 3921-3928 (2011).</li>
<li>Brunstein, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infusion+of+ex+vivo+expanded+T+regulatory+cells+in+adults+transplanted+with+umbilical+cord+blood%3A+safety+profile+and+detection+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Infusion of ex vivo expanded T regulatory cells in adults transplanted with umbilical cord blood: safety profile and detection kinetics.</a> Blood. 117 (3), 1061-1070 (2011).</li>
<li>Kang, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((1%2C25-Dihyroxyvitamin+D3+promotes+FOXP3+expression+via+binding+to+vitamin+D+response+elements+in+its+conserved+noncoding+sequence+region%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">1,25-Dihyroxyvitamin D3 promotes FOXP3 expression via binding to vitamin D response elements in its conserved noncoding sequence region.</a> Journal of Immunology. 188 (11), 5276-5282 (2012).</li>
<li>Correale, J., Ysrraelit, M. C., Gaitan, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+effects+of+Vitamin+D+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory effects of Vitamin D in multiple sclerosis.</a> Brain. 132, Pt 5 1146-1160 (2009).</li>
<li>Iwata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+imprints+gut-homing+specificity+on+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid imprints gut-homing specificity on T cells.</a> Immunity. 21 (4), 527-538 (2004).</li>
<li>Steinman, R. M., Banchereau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taking+dendritic+cells+into+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Taking dendritic cells into medicine.</a> Nature. 449 (7161), 419-426 (2007).</li>
<li>Vicente-Suarez, I., Brayer, J., Villagra, A., Cheng, F., Sotomayor, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR5+ligation+by+flagellin+converts+tolerogenic+dendritic+cells+into+activating+antigen-presenting+cells+that+preferentially+induce+T-helper+1+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+Letters%22%5BJournal%5D)">TLR5 ligation by flagellin converts tolerogenic dendritic cells into activating antigen-presenting cells that preferentially induce T-helper 1 responses.</a> Immunology Letters. 125 (2), 114-118 (2009).</li>
<li>Danova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF-kappaB%2C+p38+MAPK%2C+ERK1%2F2%2C+mTOR%2C+STAT3+and+increased+glycolysis+regulate+stability+of+paricalcitol%2Fdexamethasone-generated+tolerogenic+dendritic+cells+in+the+inflammatory+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">NF-kappaB, p38 MAPK, ERK1/2, mTOR, STAT3 and increased glycolysis regulate stability of paricalcitol/dexamethasone-generated tolerogenic dendritic cells in the inflammatory environment.</a> Oncotarget. 6 (16), 14123-14138 (2015).</li>
<li>Liu, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+triggering+of+a+vitamin+D-mediated+human+antimicrobial+response%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor triggering of a vitamin D-mediated human antimicrobial response.</a> Science. 311 (5768), 1770-1773 (2006).</li>
<li>Cao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+vitamin+D+and+vitamin+D+analogs+in+acute+myelogenous+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Application of vitamin D and vitamin D analogs in acute myelogenous leukemia.</a> Experimental Hematology. 50, 1-12 (2017).</li>
<li>Anderson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lasting+Impact+of+Clostridium+difficile+Infection+in+Inflammatory+Bowel+Disease%3A+A+Propensity+Score+Matched+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammatory+Bowel+Disease%22%5BJournal%5D)">Lasting Impact of Clostridium difficile Infection in Inflammatory Bowel Disease: A Propensity Score Matched Analysis.</a> Inflammatory Bowel Disease. 23 (12), 2180-2188 (2017).</li>
<li>Tsai, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+Aneuploidy+and+Flat+Dysplasia+With+Development+of+High-Grade+Dysplasia+or+Colorectal+Cancer+in+Patients+With+Inflammatory+Bowel+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Association of Aneuploidy and Flat Dysplasia With Development of High-Grade Dysplasia or Colorectal Cancer in Patients With Inflammatory Bowel Disease.</a> Gastroenterology. 153 (6), 1492-1495 (2017).</li>
<li>Lee, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+of+dendritic+cell+migration+into+lymph+nodes+using+molecular+imaging+with+sodium+iodide+symporter+and+enhanced+firefly+luciferase+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Tracking of dendritic cell migration into lymph nodes using molecular imaging with sodium iodide symporter and enhanced firefly luciferase genes.</a> Science Reports. 5, 9865(2015).</li>
<li>Shen, Z., Reznikoff, G., Dranoff, G., Rock, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloned+dendritic+cells+can+present+exogenous+antigens+on+both+MHC+class+I+and+class+II+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cloned dendritic cells can present exogenous antigens on both MHC class I and class II molecules.</a> Journal of Immunology. 158 (6), 2723-2730 (1997).</li>
<li>Okada, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Administration+route-dependent+vaccine+efficiency+of+murine+dendritic+cells+pulsed+with+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Administration route-dependent vaccine efficiency of murine dendritic cells pulsed with antigens.</a> British Journal of Cancer. 84 (11), 1564-1570 (2001).</li>
<li>Li, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells%2C+engineered+to+overexpress+25-hydroxyvitamin+D+1alpha-hydroxylase+and+pulsed+with+a+myelin+antigen%2C+provide+myelin-specific+suppression+of+ongoing+experimental+allergic+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells, engineered to overexpress 25-hydroxyvitamin D 1alpha-hydroxylase and pulsed with a myelin antigen, provide myelin-specific suppression of ongoing experimental allergic encephalomyelitis.</a> FASEB J. , (2017).</li>
<li>Narula, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+High-Dose+Vitamin+D3+Supplementation+in+Patients+with+Crohn%27s+Disease+in+Remission%3A+A+Pilot+Randomized+Double-Blind+Controlled+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Digestive+Disease+Science%22%5BJournal%5D)">Impact of High-Dose Vitamin D3 Supplementation in Patients with Crohn's Disease in Remission: A Pilot Randomized Double-Blind Controlled Study.</a> Digestive Disease Science. 62 (2), 448-455 (2017).</li>
<li>Ahmad, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+A+Supplementation+during+Pregnancy+Enhances+Pandemic+H1N1+Vaccine+Response+in+Mothers%2C+but+Enhancement+of+Transplacental+Antibody+Transfer+May+Depend+on+When+Mothers+Are+Vaccinated+during+Pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Vitamin A Supplementation during Pregnancy Enhances Pandemic H1N1 Vaccine Response in Mothers, but Enhancement of Transplacental Antibody Transfer May Depend on When Mothers Are Vaccinated during Pregnancy.</a> Journal of Nutrition. 148 (12), 1968-1975 (2018).</li>
<li>Noronha, S. M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aldefluor+protocol+to+sort+keratinocytes+stem+cells+from+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cirurgica+Brasileira%22%5BJournal%5D)">Aldefluor protocol to sort keratinocytes stem cells from skin.</a> Acta Cirurgica Brasileira. 32 (11), 984-994 (2017).</li>
<li>Ferreira, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+D3+Induces+Tolerance+in+Human+Dendritic+Cells+by+Activation+of+Intracellular+Metabolic+Pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Vitamin D3 Induces Tolerance in Human Dendritic Cells by Activation of Intracellular Metabolic Pathways.</a> Cell Reports. 10 (5), 711-725 (2015).</li>
<li>Bakdash, G., Vogelpoel, L. T., van Capel, T. M., Kapsenberg, M. L., de Jong, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+primes+human+dendritic+cells+to+induce+gut-homing%2C+IL-10-producing+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid primes human dendritic cells to induce gut-homing, IL-10-producing regulatory T cells.</a> Mucosal Immunology. 8 (2), 265-278 (2015).</li>
</ol>

Drs. Xiaolei Tang en David J. Baylink zijn uitvinders van een octrooi in behandeling met betrekking tot deze studie.

In dit artikel beschrijven we het gebruik van DC-CYP-ALDH cellen, voor het verhogen van de inductie van gut-homing Treg cellen in perifere lymfoïde weefsels. Onze gegevens hebben aangetoond dat de DC-CYP-ALDH-cellen lokaal hoge concentraties de Novo van zowel 1,25 (OH)2D en RA in vitro kunnen synthetiseren in de aanwezigheid van overeenkomstige substraten (d.w.z. 25 [Oh] D en retinol, respectievelijk). Omdat voldoende bloed concentraties van 25 (Oh) D en retinol gemakkelijk kunnen worden bereikt door middel va...

Inflammatoire darmziekte (IBD) is een inflammatoire chronische ziekte in het maagdarmkanaal (DARM). In de Verenigde Staten zijn er ongeveer 1.400.000 IBD patiënten. Het is algemeen aanvaard dat een disgereguleerde immuunrespons op darmbacteriën de ziekte initieert en de mucosale epitheliale barrière1,2verstoort. Om deze reden, momenteel beschikbare U.S. Food and Drug Administration (FDA)-goedgekeurde drugs remmen de functies van inflammatoire mediatoren of blokkeren het homing van immune cellen in de darm. Echter, de ontstekingsmediatoren en immuuncellen die gericht zijn zijn ook nodig voor immuun afweer. Dientengevolge, de inflammatoire mediator remmers compromitteren systemische immuun verdediging en de immuuncel homing blokkers verzwakken gut immuun verdediging, die beide kunnen leiden tot ernstige gevolgen3,4. Bovendien, de immuuncel homing blokkers kunnen ook blokkeren het homing van regelgevende T (Treg) cellen in de darm en dus kan verergeren de reeds gecompromitteerde gut immuun tolerantie bij IBD patiënten. Bovendien, blokkeren van Treg cel homing in de darm kan ook leiden tot systemische immuunsuppressie als gevolg van de accumulatie van Treg cellen in het bloed5. Tot slot, remmers en blokkers functioneren tijdelijk en, daardoor, vereisen frequente toedieningen. Frequente toediening van deze remmers en blokkers kan verder verergeren de ongewenste neveneffecten.
Onlangs, we hebben voorgesteld een nieuwe strategie die potentieel kan verzachten of zelfs elimineren van de bijwerkingen geassocieerd met de huidige drugs voor IBD behandeling6. Deze strategie vergroot de inductie van gut-homing Treg cellen in perifere lymfoïde weefsels6. De logica van deze strategie is dat gut-homing Treg cellen specifiek de thuisbasis van de darm en dus zal niet in gevaar brengen systemische immuun afweer. Bovendien, aangezien Treg cellen potentieel geheugen kunnen vormen7,8, gut-homing Treg cellen kunnen mogelijk zorgen voor een stabiele controle van de chronische darmontsteking bij IBD patiënten en, daardoor, de behandeling moet niet zo frequent worden toegediend. Bovendien, aangezien deze strategie de inductie van gut-homing Treg cellen in vivo vergroot, heeft het niet de zorg van in vivo instabiliteit in een zeer proinflammatoire omgeving die gepaard gaat met adoptie overdracht van in vitro gegenereerde Treg cellen9,10. In dit verband, in vitro gegenereerde Treg cellen zijn een van de voorgestelde strategieën voor de behandeling van auto-immuunziekten11,12,13 en transplantatie afstoting14,15. Tot slot, in deze strategie, dendritische cellen (DCs) zijn ontworpen om lokaal hoge concentraties van twee moleculen de Novo te produceren: actieve vitamine D (1,25-dihydroxyvitamin D of 1,25 [OH]2D) en actieve vitamine A (retinoïnezuur of RA). We kozen voor 1,25 (Oh)2d en RA omdat 1,25 (Oh)2d de expressie van regelgevende moleculen kan induceren (bijv. Forkhead Box P3 [foxp3] en interleukine-10 [Il-10])16,17 en dat Ra de expressie van gut-homing-receptoren in T-cellen kan stimuleren18. Omdat zowel 1,25 (Oh)2D en RA ook de DCS28,29kunnen vertolderen, reden we dat de engineered DCS in vivo in een tolerogene toestand zal worden gehandhaafd en daarmee de in vivo instabiliteit problemen die geassocieerd zijn met in vitro gegenereerde tolerogene dc's (toldc's)19,20,21te omzeilen. In dit opzicht zijn toldc's ook een van de voorgestelde strategieën voor in vivo vergroting van de Treg-celfuncties19,20,21. Ter ondersteuning van onze redenering, hebben we aangetoond dat de engineered DCs, bij in vivo levering, kan de inductie van gut-homing Treg cellen in perifere lymfoïde weefsels te vergroten6.
Een bijkomend voordeel van onze voorgestelde strategie is dat 1,25 (OH)2D ook andere functies heeft die mogelijk ten goede komen aan IBD-patiënten. Deze andere functies omvatten het vermogen van 1,25 (OH)2D om de secretie van antimicrobiële geneesmiddelen22 te stimuleren en carcinogenese23te onderdrukken. Infecties en kankers worden vaak geassocieerd met IBD24,25.
Om de DCs te genereren die lokaal hoge concentraties van zowel 1,25 (OH)2D en Ra de Novo kan produceren, gebruiken we een lentivirale vector om DCS te overdrukken om twee genen over te brengen. Een gen is de cytochroom P450 familie 27 subfamilie B lid 1 (CYP27B1) die codeert 25-hydroxyvitamin D 1α-hydroxylase (1α-hydroxylase), die fysiologisch katalyseert de synthese van 1,25 (OH)2D. Het andere gen is de aldehyde-dehydrogenase 1-familielid a2 (ALDH1a2) die de retinaldehyde dehydrogenase 2 (RALDH2) codeert, wat de synthese van RA6fysiologisch katalyseert.
Omdat in vivo augmentatie van gut-homing Treg Cell inductie is mogelijk belangrijk bij de behandeling van IBD, in het volgende protocol zullen we de procedures voor het genereren van de 1α-hydroxylase-RALDH2-overuitdrukken DCs (DC-CYP-ALDH cellen) die kan gebruikt worden voor het toekomstig onderzoek van de Treg cellen in vivo.

<table><tbody><tr><td>10 mL-spuitjes</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# 03-377-23</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 20 mm kweekschotels</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# CLS430167</td><td></td></tr><tr><td>12-wels kweekplaten</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# 07-200-82</td><td></td></tr><tr><td>150 mm x 25 mm kweekschotels</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# CLS430559</td><td></td></tr><tr><td>25-hydroxycholecalciferol (25[OH]D)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# H4014</td><td></td></tr><tr><td>293T cellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat#: 21985023</td><td></td></tr><tr><td>6-wels kweekplaten</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# 07-200-83</td><td></td></tr><tr><td>ALDEFLUOR kit</td><td>Stemcell Technologies</td><td>Cat# 01700</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CYP27B1</td><td>Abcam</td><td>Cat# ab95047</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria II</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# C1016</td><td></td></tr><tr><td>CM-10-D celkweekmedium</td><td></td><td></td><td>DMEM-medium bevattend 10% foetaal bovien serum (FBS), 100 U/ml penicilline/streptomycine, 0,055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM natriumpyruvaat, 0,1 mM niet-essentiële aminozuur en 2 mM L-glutamine.</td></tr><tr><td>CM-10-R celkweekmedium</td><td></td><td></td><td>RPMI 1640-medium (geen glutamine) bevattend 10% foetaal bovien serum (FBS), 100 U/ml penicilline/streptomycine, 0,055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM natriumpyruvaat, 0,1 mM niet-essentiële aminozuur en 2 mM L-glutamine.</td></tr><tr><td>CM-4-D celkweekmedium</td><td></td><td></td><td>DMEM-medium bevattend 4% foetaal bovien serum (FBS), 100 U/ml penicilline/streptomycine, 0,055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM natriumpyruvaat, 0,1 mM niet-essentiële aminozuur en 2 mM L-glutamine.</td></tr><tr><td>Corning fles-bovenkant vacuümfilters, 0,22 mM, 500 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# CLS430513</td><td></td></tr><tr><td>Corning fles-bovenkant vacuümfilters, 0,45 mM, 500 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# CLS430514</td><td></td></tr><tr><td>Dissectie schaar</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# 08-940</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# 11960044</td><td></td></tr><tr><td>Foetaal bovien serum</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# 16000044</td><td></td></tr><tr><td>Pincetten</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# 22-327379</td><td></td></tr><tr><td>Gibco ACK lyseringsbuffer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# A1049201</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# G5516</td><td></td></tr><tr><td>Geit anti-konijn IgG</td><td>Abcam</td><td>Cat# ab205718</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Millipore</td><td>Cat# 391340</td><td></td></tr><tr><td>Lenti-CYP-ALDH</td><td>Op maat gemaakt</td><td>1,6-kb muis CYP27B1 en ALDH1a2 cDNA's werden versterkt door PCR met behulp van een plasmide dat het CYP27B1 cDNA en een plasmide dat het ALDH1a2 cDNA respectievelijk bevatten (GeneCopoeia). Het versterkte CYP27B1 cDNA fragment met een 5' KOZAK ribosome entry sequence werd gekloond in de pRRL-SIN.cPPt.PGKGFP.WPRE lentivirale vector (Addgene). Het resulterende construct werd aangeduid als lenti-CYP-GFP. Het versterkte ALDH1a2 cDNA fragment werd gekloond in de lenti-CYP-GFP om de GFP te vervangen en werd aangeduid als lenti-CYP-ALDH. Dit bicistronische plasmide exprimeert CYP27B1 onder controle van de SFFV promotor en ALDH1a2 onder controle van de PGK promotor.</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat#25030081</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolysaccharide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# L3755</td><td></td></tr><tr><td>Muur GM-CSF</td><td>Peprotech</td><td>Cat# 315-03</td><td></td></tr><tr><td>Muur IL-4</td><td>Peprotech</td><td>Cat# 214-14</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# NIST2186II</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# S9888</td><td></td></tr><tr><td>Naalden</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# 14-841-02</td><td></td></tr><tr><td>Niet-essentiële aminozuren</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat#: 11140076</td><td></td></tr><tr><td>pCMVR8.74</td><td>Addgene</td><td>Plasmid# 22036</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline/Streptomycine</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat#15140148</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Balanced Solution (PBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat#: 20012027</td><td></td></tr><tr><td>PMD2G</td><td>Addgene</td><td>Plasmid# 12259</td><td></td></tr><tr><td>Polypropyleenbuis, 15 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# AM12500</td><td></td></tr><tr><td>Polypropyleenbuis, 50 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# AM12502</td><td></td></tr><tr><td>Protamine sulfaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# P3369</td><td></td></tr><tr><td>Konijn polyklonaal IgG isotype controle</td><td>Abcam</td><td>Cat# ab171870</td><td></td></tr><tr><td>Radioimmunoassay voor 1,25(OH)2D meting</td><td>Heartland Assays</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640-medium, geen glutamine</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# 21870076</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat#: 11360070</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend XTR Centrifuge</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# 75004521</td><td></td></tr><tr><td>Steriele celfilters, 40 mm</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# 07-201-430</td><td></td></tr><tr><td>Steriele opslagflessen, 500 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# CLS431432</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo augmentatie van gut-homing regulatoire t cell inductie

In Vivo Augmentation of Gut-Homing Regulatory T Cell Induction

Inflammatoire darmziekte (IBD) is een inflammatoire chronische ziekte in het maagdarmkanaal (DARM). In de Verenigde Staten zijn er ongeveer 1.400.000 IBD patiënten. Het is algemeen aanvaard dat een disgereguleerde immuunrespons op darmbacteriën de ziekte initieert en de mucosale epitheliale barrière verstoort. We hebben onlangs laten zien dat gut-homing Regulatory T (Treg) cellen een veelbelovende therapie voor IBD zijn. Dienovereenkomstig, dit artikel presenteert een protocol voor in vivo augmentatie van gut-homing Treg Cell inductie. In dit protocol zijn dendritische cellen ontworpen voor de productie van lokaal hoge concentraties van twee moleculen de Novo, actieve vitamine D (1,25-dihydroxyvitamin D of 1,25 [OH]2D) en actieve vitamine A (retinoïnezuur of RA). We kozen voor 1,25 (OH)2d en RA op basis van eerdere bevindingen waaruit blijkt dat 1,25 (Oh)2D de expressie van regelgevende moleculen kan induceren (bijv. Forkhead Box P3 en interleukine-10) en dat Ra de expressie van gut-homing-receptoren in T-cellen kan stimuleren. Om dergelijke engineered dendritische cellen te genereren, gebruiken we een lentivirale vector om dendritische cellen te doorgeven om twee genen te overdrukken. Een gen is de cytochroom P450 familie 27 subfamilie B lid 1 die codeert 25-hydroxyvitamin D 1α-hydroxylase, die fysiologisch katalyseert de synthese van 1,25 (OH)2D. Het andere gen is de aldehyde dehydrogenase 1 familie lid a2 die codeert voor retinaldehyde dehydrogenase 2, die fysiologisch de synthese van RA katalyseert. Dit protocol kan worden gebruikt voor toekomstig onderzoek naar gut-homing Treg cellen in vivo.

DC-CYP-ALDH cellen uitgedrukt significant toegenomen hoeveelheid 1α-hydroxylase. Om te bepalen of DC-CYP-ALDH-cellen die zijn gegenereerd uit Bmdc's een significant toegenomen hoeveelheid van 1α-hydroxylase uitmaakten, werden Bmdc's met het Lenti-CYP-ALDH-virus in de met beenmerg afkomstige DC-CYP-ALDH-cellen (BMDC-CYP-ALDH-cellen). Vervolgens werden de BMDC-CYP-ALDH-cellen onderzocht op de uitdrukking van 1α-hydroxylase door FACS. Uit onze gegevens bleek dat de cellen van het BMDC-CYP-ALDH in vergelijki...

Hier presenteren we een protocol voor in vivo vergroting van gut-homing regulatoire T Cell inductie. In dit protocol zijn dendritische cellen ontworpen om lokaal hoge concentraties van de actieve vitamine D (1,25-dihydroxyvitamin D of 1,25 [OH]2d) en de actieve vitamine A (retinoïnezuur of RA) de Novo te produceren.

In vivo augmentatie van gut-homing regulatoire T Cell inductie

Inflammatory bowel disease (IBD) is an inflammatory chronic disease in the gastrointestinal tract (GUT). In the United States, there are approximately 1.4 ...

Dit protocol beschrijft een potentieel nieuwe therapeutische strategie die gemakkelijk kan worden gewijzigd voor menselijke toepassingen. Deze techniek verbetert direct de inductie van darm-homing regulerende T-cellen in perifere lymfeweefsels en kan zelfs in zeer pro-inflammatoire omgevingen stabiel worden geïmplementeerd. Deze technieken kunnen ook worden gebruikt om de rol van actieve vitamine D en vitamine A binnen het perifere immuunsysteem te onderzoeken.Deze visuele demonstratie geeft stapsgewijze instructies voor het genereren van hoogwaardige ontworpen dendritische cellen die cruciaal zijn voor het succes van deze techniek. Begin met het zaaien van een keer 10 tot de zeven 293T cellen in 20 milliliter CM-10-D cel cultuur medium in 150 door 25 millimeter kweekplaten voor een 24-uurs incubatie bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide. Voeg de volgende dag 1,62 milliliter vers bereide tweevoudig geconcentreerde HBS-oplossing, 9,5 microgram enveloppe plasmid, 17,5 microgram verpakkingsplasmid en 27 microgram van de LENTI-CYP-ALDH plasmid toe aan een conische buis van 50 milliliter.Breng het uiteindelijke volume van de buisinhoud tot 3,0375 milliliter met water, gevolgd door de

in-vivo-augmentation-of-gut-homing-regulatory-t-cell-induction

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Concurrerende homing experimenten toelaten om rechtstreeks de beoordeling van de trekkende eigenschappen van twee verschillende celpopulaties in een muis. Hier hebben we illustreren deze procedure door het vergelijken van de migratie van ex vivo gegenereerde gut-tropische versus niet-gut tropische T-cellen.

Concurrerende Homing Testen om de Gut-tropische T-cel-migratie Study

Murine beenmergtransplantatie is een veel gebruikte techniek om immunologische mechanismen voor graft-versus-host ziekte bij mensen bestuderen. De mogelijkheid om T-cel mensenhandel patronen te...

Inductie van Graft-versus-host ziekte en<em&gt; In Vivo</em&gt; T-cel monitoren door gebruik van een MHC-matched muizenmodel

Wij beschrijven een werkwijze voor het regulerende, geheugen naïeve T-cellen van een menselijke bloed donoren. Gepolariseerde Tregs kan worden vergeleken met andere subgroepen in verschillende genetische en functionele toepassingen met genetische homogeniteit, zoals onderdrukking assay ook hier beschreven.

Genereren van Induced regulatoire T-cellen uit primaire menselijke naïef en geheugen T-cellen

Genereren van T-lymfocyten van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen geeft een alternatieve aanpak van het gebruik van embryonale stamcellen voor T-cel-gebaseerde immunotherapie. De werkwijze blijkt dat door een...

Geregisseerd Differentiatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen naar T lymfocyten

Hier presenteren we een protocol om colonontsteking bij muizen te induceren door adoptieve overdracht van syngeneïsche CD4+CD45RBhigh T-cellen naar ontvangers zonder T- en B-cellen. Klinische en histopathologische kenmerken bootsen inflammatoire darmziekten bij mensen na. Deze methode maakt de studie van de initiatie van colonontsteking en de progressie van de ziekte mogelijk.

Inductie van Muriene darmontsteking door adoptieve overdracht van effector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Hoog</sup&gt; T cellen in immunodeficiënte muizen

We presenteren hier een methode om functionele antigeen (Ag)-specifieke regulatoire T-cellen (Tregs) te ontwikkelen uit geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) voor immunotherapie van auto-immuun artritis in een muismodel.

Ontwikkeling van stamcel-afgeleide Antigeen-specifieke regulatoire T-cellen tegen auto-immuniteit

Dit protocol beschrijft de reproduceerbare productie en fenotypering van mens veroorzaakte regulerende T-cellen (iTregs) van naïeve CD4 + T-cellen in vitro. Verschillende protocollen voor FOXP3 inductie mogelijk maken voor de studie van specifieke iTreg fenotypes verkregen met de respectieve protocollen.

In vitro differentiatie van humane CD4 + FOXP3 + geïnduceerde regulatoire T-cellen (iTregs) van naïeve CD4 + T cellen met behulp van een TGF-β-bevattende Protocol

Dit artikel beschrijft een nieuwe methode voor het genereren van tumor antigeen-specifieke geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige Thymus emigants (iTE) door een driedimensionaal (3D) Thymus cultuur systeem. iET zijn een homogene deelverzameling van T-cellen die nauw verwant zijn aan naïeve T-cellen met de capaciteit voor proliferatie, Geheugenvorming en tumor onderdrukking.

Een driedimensionaal Thymic cultuur systeem voor het genereren van Murine geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige tumor antigen-specifieke Thymic emigranten

We beschrijven hier een flow Cytometry-based in vivo doden assay die het mogelijk maakt onderzoek van immunodominance in chemo T lymfocyten (CTL) Reacties op een model tumor antigeen. Wij bieden voorbeelden van hoe deze elegante assay kan worden gebruikt voor mechanistische studies en voor de effectiviteit van geneesmiddelen testen.

Maatwerk in vivo chemo tests om Immunodominance in tumor-specifieke CD8+ T Cell responsen te bestuderen

In dit protocol wordt een darmmicrobiota-antigeenspecifiek T-cel adoptief transfer colitismodel beschreven. CD4+ T-cellen worden geïsoleerd uit CBir1 TCR transgene muizen. Deze zijn specifiek voor een immunodominant darmmicrobiota-antigeen CBir1 flagellin, dat wordt overgedragen in ontvangende Rag1-/- muizen, wat leidt tot darmontsteking.

Inductie van darmontsteking door adoptieve overdracht van CBir1 TCR transgene CD4 + T-cellen naar immunodeficiënte muizen

Dit protocol beschrijft de in vivo herprogrammering van muizenkankercellen tot type 1 dendritische-achtige cellen binnen de tumormicro-omgeving door middel van geforceerde expressie van de transcriptiefactoren PU.1, IRF8 en BATF3.

Kanteerbare in vivo herprogrammering van tumorcellen tot type 1 conventionele dendritische celachtige cellen

Leer hoe je de inductie van darm-homende regulatoire T-cellen versterkt via geëngineerde dendritische cellen. Deze methode werkt zelfs in sterk pro-inflammatoire omgevingen en is aanpasbaar voor humane toepassingen.

In vivo augmentatie van gut-homing regulatoire T Cell inductie

Meer video's verkennen