Pupal en volwassen injecties voor RNAi en CRISPR Gen editing in Nasonia vitripennis

Onderzoek naar niet-canonische insectenmodellen, zoals parasitaire wespen, is beperkt omdat embryonale micro-injectie erg uitdagend is. Onze methode omzeilt dit probleem en maakt plaatsspecifieke en erfelijke mutaties in de kiemcellen mogelijk. Het injecteren van poppen of volwassen vrouwtjes is snel en elimineert de behoefte aan dure apparatuur of gespecialiseerde training die nodig is om succesvolle embryonale micro-injecties te bereiken.

Deze techniek zal het mogelijk maken dat gespecialiseerde laboratoria die geen toegang hebben tot dure apparatuur functionele studies kunnen uitvoeren in welke insectensoort ze ook als model gebruiken. Na optimalisatie kan deze methode worden gebruikt om de functionele genetica van veel andere genen in Nasonia te bestuderen. We denken ook dat deze methode kan worden gebruikt om nucleïnezuren te leveren voor genetische transformatie van Nasonia of andere insecten.

Begin door ongeveer 20 gepaarde vrouwtjes afzonderlijk in kleine glazen reageerbuisjes te plaatsen die met katoen zijn afgesloten. Voeg twee S.bullata-gastheerders per buisje toe en houd de wespen gedurende twee tot drie dagen op 25 graden Celsius en 30% relatieve luchtvochtigheid met een lichtdonkercyclus van 12:12. Na twee tot drie dagen verwijder je voorzichtig de vrouwtjes met een fijnpuntige borstel om continue overpositie en een synchronie in de ontwikkeling van het nageslacht te voorkomen.

Verwijderde vrouwtjes kunnen optioneel opnieuw worden gehuisvest of worden bewaard bij vijf graden Celsius gedurende maximaal een maand. Houd de geparasiteerde gastheer gedurende zeven dagen op 25 graden Celsius en 30% relatieve luchtvochtigheid met een lichtdonkercyclus van 12:12 als de gewenste injectiefase witte poppen vereist, gedurende 13 dagen als de vereiste ontwikkelingsfase zwarte poppen zijn, of 14 dagen voor jonge, net uitgekomen volwassenen. Wanneer de gewenste fase is bereikt, kraak het poppencocon open met een dissectie-naald om N.vitripennis-poppen en volwassenen te herstellen.

Bereid een glazen plaatje voor door in het midden een lijntje schoollijm aan te brengen. Verspreid de lijm met de dissectie-naald om een dikke laag te verkrijgen, die zal worden gebruikt om de poppen uit te lijnen. Laat de lijm ongeveer twee minuten drogen voordat je de poppen overbrengt.

Gebruik onder een dissectiemicroscoop een dissectie-naald om lijm op de achterkant van het hoofd van de pop aan te brengen. Bevestig de pop aan de lijmstrook op het plaatje met de buik naar boven. Lijn 20 tot 30 poppen zij aan zij op het plaatje uit.

Plaats het plaatje met de poppen en een petrischaaltje om de lijm gedurende ongeveer 10 minuten te laten drogen. Voordat je begint met injecteren, test je de hechting van de poppen aan de lijm door ze voorzichtig met de dissectie-naald te duwen. Als de meeste poppen losraken, bereid je een nieuw plaatje voor.

Alternatief kun je alle losse poppen verwijderen en doorgaan met het injecteren van degenen die goed aan het plaatje zijn bevestigd. Laad een capillaire glazen buis in een naaldtrekker en trek naalden volgens de instructies van de fabrikant. Laad de naald met vijf microliter van het voorbereide injectiemengsel met behulp van microloader-pipetpunten.

Open de naald door de punt op een oppervlak van twee overlappende plaatjes te schuiven. Alternatief open je de punt van de naald met een paar fijne pincetten om een scherpe rand te creëren. Plaats het plaatje met de uitgelijnde poppen onder een dissectiemicroscoop en steek dan de naald in de injectiebuis van de femtojet en draai de gripkop vast.

Kijkend naar de naald onder de microscoop, zet de femtojet aan en stel de compensatiedruk en injectiedrukparameters in door de draaiknoppen te draaien. Breng de naald voorzichtig tussen het tweede en derde zichtbare buiksegmenten met een verticale hoek van ongeveer 30 graden in. Injecteer met een continue stroom totdat de hele buik groen wordt in het geval van poppen in het witte stadium of totdat de buik in omvang toeneemt in het geval van zwarte poppen.

Stop met injecteren wanneer het duidelijk is dat de buik geen vloeistof meer kan opnemen of wanneer de vloeistof uit het lichaam begint te stromen. Beweeg voorzichtig naar de volgende pop en herhaal deze stappen. Breng het plaatje met de geïnjecteerde poppen over naar een petrischaaltje.

Dek de schaal af met het deksel en plaats deze op 25 graden Celsius tot het verschijnen van de wesp. Voor de bereiding van volwassenen, scheid groepen van 20 ongetrouwde vrouwtjes in een schone kleine reageerbuis met een fijne verfkwast. Plaats een glazen plaatje op ijs en lijn de vrouwtjes zij aan zij op het koude plaatje met de buik omhoog onder een dissectiemicroscoop.

Laad een naald met de ribonucleoproteïnoplossing met behulp van een microloading-tip en steek de naald in de connector-pack van de afzuigingsbuisassemblage. Ondersteun de vrouwtjes van de andere kant met stompe dissectie-naalden, terwijl je langzaam in de buik injecteert. Vermijd contact met de legbuis.

Dit zal deze cruciale reproductieve structuur ernstig beschadigen. Breng de naald voorzichtig tussen het tweede en derde zichtbare buiksegmenten met een verticale hoek van ongeveer 30 graden in. Injecteer de oplossing in de buik van de vrouwtjes, stoppen wanneer er geen vloeistof meer kan binnenkomen of wanneer lekkage van overtollige oplossing wordt waargenomen.

Beweeg voorzichtig naar de volgende vrouwtje en herhaal deze stappen. Wanneer je klaar bent, breng je voorzichtig een enkele geïnjecteerde vrouwtje over naar een nieuw buisje met één gastheer met behulp van een verfkwast. Laat ze ongeveer een uur op kamertemperatuur herstellen, bevestig overleving en breng de buisjes terug naar de kweekincubator.

Na het uitkomen van volwassenen uit de geïnjecteerde poppen, plaats je enkele wespen in een glas dat is afgesloten met katoen en steek je één S.bullata-gastheer in. Voor CRISPR/Cas9