Beoordeling van mitochondriale gezondheid in kankergeassocieerde fibroblasten geïsoleerd uit 3D meercellige longtumorenferoïden

Dit protocol benadrukt het belang van de tumormicro-omgeving bij het activeren van de kanker-geassocieerde fibroblasten of CAF. Het zou een uitstekend in vitro model kunnen zijn om fenotypische kenmerken te bestuderen. De belangrijkste beperkingen in de CAF-biologie liggen in de beperkte beschikbaarheid van CAF uit primaire tumorbiopsiemonsters.

Deze techniek kan dus worden gebruikt om verschillende aspecten van de CAF-biologie te bestuderen. Deze studie toont afwijkende kruisproductie en mitochondriale disfunctie geassocieerd met CAF-activering die leidt tot een slechte tumorprognose. De toepassing van deze methode zou nuttig zijn voor het beoordelen van de trauma-interacties van de tumor, met name CAF-activering en mitochondriale gezondheid.

Om de nieuwe medicijndoelen te verkennen. Individuen moeten ervaring hebben met celprocedures voordat ze deze techniek uitvoeren. De visuele demonstratie van deze techniek zal het mogelijk maken om de kritieke stappen te begrijpen bij het isoleren van de CAF-populatie van de tumorsferoïden en downstream-toepassingen om CAF-biologie te bestuderen.

Miss Leena Arora, Miss Moyna Kalia en Mrs. Soumyajit Roy, assistenten van mijn lab voeren de experimenten uit. Om te beginnen met het kweken van menselijke longadenocarcinoom A549 en menselijke longfibroblast MRC-5-aanhangcellen in DMEM en menselijke monocyten THP-1-cellen in RPMI volledig groeimedium in T25-kolven bij 37 graden Celsius in een bevochtigde kamer met 5% koolstofdioxide.

Na drie dagen, bij 80 tot 85% celconfluentie, wast u de A549- en MRC-5-cellen gedurende één minuut met één milliliter PBS. Oogst vervolgens de cellen door ze te incuberen met 500 microliter 0,25% trypsine EDTA-oplossing gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius. Voeg vervolgens onmiddellijk vier milliliter volledig groeimedium toe om het trypsine te inactiveren.

Verzamel de celsuspensie in een buis van 15 milliliter en pelleteer deze gedurende vijf minuten op 125 x g. Verwijder het supernatant en resuspenseer de cellen in een vijf milliliter compleet groeimedium. Om meercellige tumorsferoïden vast te stellen, telt u A549-, MRC-5- en THP-1-celnummers met behulp van een celteller voor één millilitervolume.

Bereid na het tellen de celsuspensie in een verhouding van 5:4:1 en vul het volume aan tot één milliliter met volledige DMEM. Plaats vervolgens een druppel van 25 microliter celsuspensiemengsel op de afdekking van een kweekschaal van 90 millimeter. Vul de bodem van de schaal met 10 milliliter steriel water.

Keer het deksel voorzichtig om over de met water gevulde hydratatiekamer en plaats het gerecht drie dagen in een celkweekincubator. Controleer op dag vier de sferoïden onder de microscoop. Als u afbeeldingen wilt verkrijgen, schakelt u de aan/uit-schakelaar in.

Plaats de 90 millimeter cultuurschaal op het podium en selecteer de 10 x vergroting. Pas de lenzen aan en onderzoek de cellen om de celaggregatie en proliferatie te analyseren. Druk op de knoppen vastlopen en opslaan om de afbeelding vast te leggen.

Vervang na beeldvorming het groeimedium door voorzichtig 20 microliter medium uit elke druppel te halen met een vers medium. Schakel voor live-dead imaging Ctr advanced in, dat is switch één, dan de CPU en wacht tot het softwaresysteem opstart. Wanneer u opstart, plaatst u de schotel van 90 millimeter met sferoïden op het podium van de omgekeerde fluorescerende microscoop.

Observeer en leg vervolgens beelden vast met een vergroting van 10 x door de fluorescentieoptie in de software te selecteren en de FITC voor het calceïne- en Texas Red-kanaal te selecteren. Selecteer vervolgens de optie, live en bekijk de afbeelding. Pas de fluorescentie-intensiteit aan voor de juiste optimalisatie en klik op de veilige knop.

Verzamel 200 tumoren, sferoïden elk op dag zeven en 10 met behulp van een pipet van één milliliter en een buis van 15 milliliter. Pelleteer vervolgens de sferoïden door centrifugering bij 125 x g gedurende vijf minuten en adem het supernatant voorzichtig op. Was de sferoïden met 200 microliter PBS, centrifugeer opnieuw en gooi het supernatant weg.

Voeg 400 microliter 0,25% trypsine EDTA-oplossing toe voor sferoïde desintegratie en incubeer gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius. Voer krachtig pipetteren uit voor volledige desintegratie van de sferoïden. Neutraliseer het trypsine door één milliliter compleet DMEM-groeimedium toe te voegen.

Centrifugeer vervolgens de sferoïde suspensie en gooi het supernatant weg voordat de pellet in één milliliter volledig DMEM-medium resuspendeert. Tel het totale aantal cellen zoals aangetoond. Voor de isolatie van cancer-associated fibroblasten of CAFs van de tumorsferoïden, resuspensie 1 x 10 tot de zevende cellen in 80 microliter koude magnetische geactiveerde celsortering of MACS-buffer.

Voeg 20 microliter anti-fibroblast microbeads toe aan de celsuspensie, meng goed door zachtjes op de buis te tikken en deze gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur te broeden. Was na incubatie de cellen met één milliliter koude MACS-buffer. Vervolgens centrifugeer en aspirateer het supernatant voordat de pellet wordt geresuspendeerd in 500 microliter MACS-buffer.

Voor magnetische op kralen gebaseerde celscheiding bereidt u de MACS-kolom voor door deze te spoelen met drie milliliter MACS-buffer. Plaats de celsuspensie in de kolom en verzamel de doorstroom met de niet-gelabelde celpopulatie. Was vervolgens de kolom driemaal met drie milliliter MACS-buffer voordat u deze uit de separator verwijdert.

Plaats vervolgens de kolom op de verzamelbuis. Verzamel de anti-fibroblast microbead gelabelde cellen door vijf milliliter MACS-buffer toe te voegen en de zuiger stevig in de kolom te duwen. Centrifugeer de gelabelde cellen voordat u verder gaat met downstream-toepassingen.

Tel het aantal geïsoleerde CAFs en gebruik ongeveer 6 x 10 tot de vierde cellen voor flowcytometrieanalyse. Was de cellen eenmaal met PBS, centrifugeer en aspirateer het supernatant. Voeg vervolgens 100 microliter celpermeabilisatiebuffer toe en incubeer de cellen gedurende 30 minuten op vier graden Celsius met intermitterende vortexing om een enkele celsuspensie te behouden.

Nogmaals, na centrifugatie en resuspendatie van de cellen in permeabilisatiebuffer, voeg twee microliter APC-geconjugeerd anti-humaan alfa-SMA-antilichaam toe en incubeer gedurende 45 minuten bij vier graden Celsius. Voeg na incubatie een milliliter permeabilisatiebuffer en centrifuge toe om overtollig antilichaam te verwijderen. Resuspendeer de pellet in 400 microliter permeabilisatiebuffer voor flowcytometrie.

Selecteer ACTA2-positieve cellen na het onderscheiden van de populaties van cellen op basis van hun voorwaartse en zijwaartse spreiding. Het selecteren van de singletpopulatie gevolgd door het selecteren van de ACTA2-positieve cellen die verschijnen als een enkele piek op het histogram met één parameter. De ontwikkeling van meercellige tumorsferoïden en levend-dood analyse worden hier getoond.

Op dag zeven waren sferoïden compact en stijf met een diameter van ongeveer 260 micron. Op dag 10 hadden sferoïden een diameter van 480 micron. In de levensvatbaarheidstest van cellen werd een afname van propidiumjodidefluorescentie en een toename van calceïne-AM-fluorescentie van dag zeven tot dag 10 waargenomen.

Hypoxische kleuring onthulde een hypoxische kern in het midden van de dag 10 sferoïden. Bovendien werd upregulatie van E-cadherine en Mki-67 genexpressie met de toename van dagen van tumorsferoïde vorming waargenomen. CAFs geïsoleerd vanaf dag 10 tumorsferoïden waren ongeveer 69% ACTA2-positief.

De CAFs vertoonden drievoudige upregulatie in ACTA2 en tienvoudig in collageen type 1 alfa 2 keten in vergelijking met de MRC-5 fibroblasten. Een significante toename van ROS-niveaus op dag 10 tumorsferoïden werd waargenomen in vergelijking met dag zeven, wat de mogelijke betrokkenheid van ROS-generatie bij CAF-activering suggereert. Een significante toename werd waargenomen in cellulaire ROS-niveaus in CAFs, geïsoleerd vanaf dag zeven en dag 10 tumorsferoïden.

Bovendien werd een verandering van mitochondriaal membraanpotentiaal waargenomen door JC-1-kleuring. Een inductie van GLUT1- en MCT4-genexpressie werd waargenomen in CAFs in vergelijking met normale fibroblasten. Significante inductie van lactaatdehydrogenase, cytochroom C-oxidase en succinaatdehydrogenase-enzymactiviteit werd waargenomen in CAFs in vergelijking met normale fibroblasten.

Een verhouding van 5:4:1 van A549-, MRC-5- en THP-1-cellen moet worden gebruikt voor de succesvolle ontwikkeling van 3D-meercellige tumorsferoïden. Fibroblastpopulatie is van cruciaal belang voor de stijfheid van de tumorsferoïden. Vergelijkbaar met kationoplossing en karakterisering, kan men deze tumorsferoïde ook gebruiken om tumorgeassocieerde macrofaagcelpopulatie te verkrijgen, die medeplichtig is aan tumorprogressie.

Deze sferoïde analyse zou ons helpen te begrijpen hoe kankercellen gekruiste fibroblast betrokken zijn bij de activering van de CAFs, en kan ook worden gebruikt om de mitochondriale specifieke kandidaat-geneesmiddelen te controleren.