Elektroforeza DNA w żelu agarozowym

Elektroforeza w żelu agarozowym jest techniką powszechnie stosowaną do rozdzielania cząsteczek DNA ze względu na ich wielkość.

Agaroza – polisacharyd pochodzący z czerwonych alg – dodaje się do buforu, takiego jak tris-octan EDTA (TAE) lub tris-boran EDTA (TBE) i rozpuszcza się przez ogrzewanie.

Zwykle 1 gram agarozy rozpuszcza się w 100 mililitrach buforu, tworząc 1% roztwór agarozy, chociaż w zależności od zastosowania można dodawać różne ilości agarozy.

Aby zabarwić żel, do roztworu agarozy często dodaje się barwnik fluorescencyjny, taki jak bromek etydyny. Barwnik interkaluje między zasadami DNA i fluoryzuje pod wpływem światła UV.

Roztwór można następnie wlać do poziomych form. Do odlewu żelowego wprowadza się grzebień, aby stworzyć studzienki, do których można załadować próbki DNA.

Roztwór agarozy pozostawia się w spokoju do zestalenia się w żel.

Żel składa się z cząsteczek agarozy związanych wodorem tworzących porowatą matrycę, przez którą poruszają się cząsteczki DNA.

Próbki DNA miesza się z buforem ładującym i umieszcza na żelu. Bufor ładujący zawiera glicerol, który zwiększa gęstość próbek DNA i pomaga im osiąść na dnie studzienek.

Bufor zawiera również barwniki, takie jak cyjanol ksylenowy i błękit bromofenolowy, które pomagają monitorować postęp migrujących prążków DNA.

Kiedy potencjał elektryczny jest przyłożony na całej długości żelu, ujemnie naładowane DNA migruje w kierunku elektrody dodatniej, przemieszczając się przez warstwy porów agarozy.

Większe cząsteczki DNA poruszają się wolniej przez pory niż mniejsze cząsteczki, co pozwala na oddzielenie cząsteczek w zależności od ich wielkości.

Wielkość porów zależy od stężenia agarozy w roztworze. Im wyższe stężenie agarozy, tym mniejszy rozmiar porów, co pomaga oddzielić krótsze fragmenty DNA.

W świetle UV wybarwione cząsteczki DNA wyglądają jak pasma fluorescencyjne. Położenie prążków można porównać z fragmentami DNA o znanych rozmiarach, zwanymi drabinką DNA.

Pasma drabiny służą jako odniesienie do określenia wielkości interesujących cząsteczek DNA.