In vivo (in vivo) Obrazowanie bioluminescencyjne guzów sutka z wykorzystaniem spektrum IVIS

Podsumowanie

Komórki nowotworowe sutka wyrażające lucyferazy są wszczepiane podskórnie myszom i wizualizowane za pomocą obrazowania optycznego do monitorowania wzrostu i rozwoju guza nieinwazyjnie w badaniu podłużnym.

Streszczenie

4T1 mysie komórki guza sutka mogą być wszczepione podskórnie u myszy nu/nu, aby utworzyć wyczuwalne guzy w ciągu 15 do 20 dni. Ten system modelowania guza ksenoprzeszczepu jest cenny dla przedklinicznej oceny in vivo przypuszczalnych związków przeciwnowotworowych.

Linia komórkowa 4T1 została zaprojektowana tak, aby konstytutywnie wyrażać gen lucyferazy świetlika (lucyferazy2). Kiedy myszom z guzami 4T1-luc2 wstrzykuje się lucyferynę, guzy emitują wizualny sygnał świetlny, który można monitorować za pomocą czułego systemu obrazowania optycznego, takiego jak IVIS Spectrum. Strumień fotonów z guza jest proporcjonalny do liczby komórek emitujących światło, a sygnał można zmierzyć w celu monitorowania wzrostu i rozwoju guza. IVIS jest skalibrowany, aby umożliwić bezwzględną ocenę ilościową sygnału bioluminescencyjnego, a badania podłużne mogą być przeprowadzane przez wiele miesięcy i na kilku rzędach wielkości sygnału bez uszczerbku dla wyniku ilościowego.

Wzrost guza może być monitorowany przez kilka dni za pomocą bioluminescencji, zanim rozmiar guza stanie się wyczuwalny lub mierzalny tradycyjnymi metodami fizycznymi. To szybkie monitorowanie może zapewnić wgląd we wczesne zdarzenia w rozwoju guza lub prowadzić do krótszych procedur eksperymentalnych.

Śmierć komórek nowotworowych i martwica spowodowana niedotlenieniem lub leczeniem farmakologicznym jest wcześnie sygnalizowana przez zmniejszenie sygnału bioluminescencyjnego. Tej śmierci komórki może nie towarzyszyć zmniejszenie wielkości guza, mierzone środkami fizycznymi. Zdolność do dostrzeżenia wczesnych zdarzeń martwicy nowotworu ma znaczący wpływ na dobór i rozwój środków terapeutycznych.

Ilościowe obrazowanie wzrostu guza za pomocą IVIS zapewnia precyzyjne określenie ilościowe i przyspiesza proces eksperymentalny w celu uzyskania wyników.

Protokół

Szeroka gama linii komórkowych raka wyrażających lucyferazy może być wykorzystana do badań przedklinicznych na modelach mysich.

Te komórki są dostarczane jako wolna od patogenów zamrożona kultura, która łatwo rośnie w standardowych podłożach bez potrzeby stosowania znaczników selekcyjnych.

W naszym eksperymencie użyjemy linii komórkowej mysiego guza sutka 4T1-luc2, która wyraża gen lucyferazy, który służy jako optyczny wskaźnik ekspresji genu lub nowotworu in vivo. Użyjemy ekspresji lucyferazy do nieinwazyjnego śledzenia wzrostu guza pierwotnego, ale można je również wykorzystać do lokalizacji i monitorowania zmian przerzutowych.

Aktywność lucyferazy musi być sprawdzona przed wstrzyknięciem, a w tym celu zbierana jest 90% zlewająca się kolba przez trypsynizację, a następnie zliczana.

50 000 komórek jest następnie dozowanych do pojedynczego dołka płytki do mikromiareczkowania i przeprowadzane są seryjne rozcieńczenia. Lucyferynę dodaje się do studzienek w stężeniu 150 ug na ml i inkubuje przez 2 minuty. Mikropłytkę można zobrazować w IVIS lub czytniku płytek luminescencyjnych w celu określenia poziomów ekspresji. Ta linia komórkowa wyraża do 6500 fotonów na sekundę na komórkę, ale każdy poziom ekspresji powyżej 500 fotonów na sekundę na komórkę może być z powodzeniem zobrazowany in vivo.

Teraz, gdy mamy komórki o optymalnej aktywności, możemy przejść do etapu iniekcji podskórnej.

Aby ułatwić optymalne wykrycie nowotworu, używamy atymicznego szczepu myszy nude z obniżoną odpornością. Przed wstrzyknięciem zwierzęta są znieczulane w celu uzyskania efektu głębokiego znieczulenia.

Następnie wstrzykniemy do 250 000 komórek w 100ul PBS wstrzykniętych podskórnie w bok. Załaduj komórki do strzykawki o pojemności 1 ml i przymocuj igłę o rozmiarze 26. Delikatnie unieś skórę kleszczami, aby zrobić "namiot" i wstrzyknij komórki u podstawy. Nowo wstrzyknięte komórki można natychmiast zobrazować. Podczas każdej sesji obrazowania podaje się łącznie 150 mg lucyferyny na kg masy ciała w dwóch wstrzyknięciach do jamy otrzewnej.

W tym badaniu, zwierzęta są obrazowane 10 minut po wstrzyknięciu Lucyferyny, aby zapewnić stały strumień fotonów. Pokażemy Ci to w następnym kroku. Kinetyka lucyferyny może się różnić z dnia na dzień. W tym konkretnym modelu pomiar 10 minut po wstrzyknięciu lucyferyny dał wynik w zakresie 15% zmienności.

W naszym eksperymencie użyjemy systemu obrazowania in vivo IVIS Spectrum, który wykorzystuje urządzenie sprzężone z ładunkiem wstecznym, schłodzone do temperatury -90°C, aby osiągnąć maksymalną czułość. Aby zapewnić obsługę bezwzględnej oceny ilościowej, system mierzy ciemny ładunek w czasie przestoju i uruchamia autokalibrację podczas inicjalizacji. Aby rozpocząć obrazowanie, należy zainicjować system IVIS (jednym kliknięciem) i ustawić parametry obrazowania dla eksperymentu.

Wybierz pole widzenia dla liczby zwierząt, które są obrazowane. W instrumencie można utrzymać do 5 zwierząt za pomocą zintegrowanego kolektora znieczulającego. Etap jest w stałej temperaturze 37°C, aby utrzymać temperaturę ciała zwierząt. Port EKG służy do monitorowania stanu zdrowia zwierząt podczas stresujących zabiegów.

W oprogramowaniu Living Image, czas ekspozycji, przysłona i grupowanie pikseli mogą być zoptymalizowane w oparciu o poziom ekspresji linii komórkowej. Ustawienia te można zmienić w dowolnym momencie eksperymentu bez wpływu na wynik ilościowy.

IVIS uzyskuje fotograficzny obraz zwierzęcia w białym świetle i ilościowy sygnał bioluminescencyjny lub fluorescencyjny, który jest nakładany na obraz.

Sygnał bioluminescencyjny jest wyrażony w fotonach na sekundę i wyświetlany jako mapa intensywności. Wyświetlanie obrazu jest regulowane w celu zapewnienia optymalnego kontrastu i rozdzielczości obrazu bez wpływu na ocenę ilościową.

Luminescencja komórek może być mierzona w miejscu wstrzyknięcia za pomocą narzędzia do badania obszaru zainteresowania. Dane pomiarowe są wyświetlane w tabeli wraz ze wszystkimi parametrami eksperymentalnymi odnoszącymi się do przechwytywania obrazu, które można zapisać lub wyeksportować do analizy

Wiele obrazów może być pozyskiwanych i porównywanych w badaniach podłużnych obejmujących sekundy lub miesiące, w zależności od charakteru eksperymentu. Będziemy mierzyć strumień fotonów z guza w czasie zero i monitorować przez 4 tygodnie z obrazowaniem w odstępach dwutygodniowych.

Strumień fotonów z guza jest proporcjonalny do liczby żywych komórek wyrażających lucyferazy, więc bioluminescencja koreluje bezpośrednio z wielkością guza.

Po 5 dniach od implantacji guz nie jest jeszcze wyczuwalny, ale komórki można określić ilościowo za pomocą bioluminescencji i widać, że guz aktywnie rośnie. Na tym etapie sygnał bioluminescencji jest znacznie silniejszy. Czas ekspozycji, przysłonę i grupowanie pikseli można regulować tak, aby obraz był wyraźny, a aparat nie był nasycony. IVIS automatycznie kompensuje zmiany w zbieraniu światła, dzięki czemu pomiary te można porównać z tymi zebranymi wcześniej i później w eksperymencie.

Po 7 dniach od implantacji guzy są po raz pierwszy wyczuwalne, a pomiar bioluminescencji już wygenerował dane z 7 dni.

Po 28 dniach od implantacji, guzy stają się martwicze, a komórki zaczynają obumierać. Wielkość guza oszacowana za pomocą pomiaru suwmiarką nie zmienia się znacząco, ale luminescencja guza zmniejszy się, co wskazuje na śmierć komórki.

Pomiary suwmiarki i pomiary bioluminescencji mogą być kontynuowane aż do osiągnięcia humanitarnego punktu końcowego. Martwica guza spowodowana niedotlenieniem lub schematami leczenia będzie wskazywana przez zmniejszoną bioluminescencję, nawet jeśli nie zmniejszą one masy guza.