Hodowla pierwotna kardiomiocytów dorosłego szczura

Podsumowanie

W niniejszej pracy opisaliśmy typowy sposób izolacji i hodowli dorosłych miocytów serca szczura. Do trawienia i izolacji pojedynczych miocytów wykorzystuje się kolagenazę oraz proteazę. Miocyty hodowane zgodnie z tym protokołem spełniają większość wymagań eksperymentalnych.

Streszczenie

Kultury pierwotne komórek serca dorosłych gryzoni stanowią istotny system modelowy w badaniach nad układem sercowo-naczyniowym. Niemniej jednak, uzyskanie stabilnych i żywotnych kultur miocytów dorosłych może być dla wielu badaczy krokiem ograniczającym tempo prac i stanowiącym wyzwanie techniczne. W niniejszej pracy opisaliśmy protokół pozyskiwania wysokiej wydajności miocytów serca dorosłego szczura, które zachowują żywotność w kulturze przez kilka dni. Serce zostaje wyizolowane i poddane perfuzji kolagenazą oraz proteazą w warunkach niskiego stężenia Ca²⁺Warunki izolacji pojedynczych miocytów. Ca²⁺komórki odporne na Ca²⁺ uzyskuje się poprzez stopniowe zwiększanie stężenia pozakomórkowego Ca²⁺²⁺stężenie w trzech kolejnych etapach płukania. Komórki są filtrowane, resuspendowane w pożywce hodowlanej i wysiewane na szkiełka pokryte lamininą. Miocyty hodowane zgodnie z tym protokołem pozostają żywotne do czterech dni i nadają się do większości eksperymentów, w tym do elektrofizjologii, biochemii, obrazowania oraz biologii molekularnej.

Protokół

Część I. Przygotowanie do operacji

1. Dzień przed operacją szczura należy upewnić się, że wszystkie roztwory zostały przygotowane, jednak nie należy jeszcze dodawać enzymów. Bufory A, B oraz bufor płuczący powinny zostać przefiltrowane w celu zapewnienia sterylności przed przechowywaniem. Wszystkie bufory należy przechowywać w temperaturze 4 °C.
2. 6-dołkowe płytki do hodowli tkankowej muszą zostać pokryte lamininą w stężeniu 10-20 μg/mL w 2 mL 1XSFM również dzień wcześniej i powinny być przechowywane w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO₂.
3. W dniu operacji należy przygotować instrumenty chirurgiczne, sterylizując zacisk, nożyczki i pęsetę 70% etanolem, a następnie pozostawić je do wyschnięcia na ręczniku papierowym.
4. Należy przygotować strzykawkę 1 mL wypełnioną 0,5 mL roztworem heparyny (90 U/ml).
5. Zalecaną praktyką jest teraz wypłukanie aparatury perfuzyjnej poprzez przepłukanie jej 70% etanolem, używając pompy perystaltycznej w trybie wstecznym. Po zakończeniu płukania etanolem, należy przepłukać aparaturę wodą dwukrotnie destylowaną, a na koniec buforem A. Przepływ jest zbierany do zlewki umieszczonej w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
6. Aby przygotować oczyszczoną aparaturę perfuzyjną, należy napełnić prawą rurkę strzykawki 40 mL buforu A, a lewą rurkę strzykawki 40 mL buforu B.
7. Należy odpowietrzyć przewody perfuzyjne aż do końcówki cewnika, pozwalając na przepływ buforu A przez aparaturę. Napełnić ponownie strzykawkę z buforem A do poziomu 40 mL. Po tym kroku należy upewnić się, że w przewodach nie pozostały pęcherzyki powietrza.
8. Następnie należy zamknąć zawór kurka strzykawki z buforem A i powtórzyć proces z buforem B, tak aby przewody perfuzyjne zostały teraz wypełnione buforem B.
9. Na koniec aparaturę perfuzyjną pozostawia się z otwartym zaworem kurka buforu B, ale z zatrzymanym przepływem za pomocą regulatora na linii kroplówki.
10. Należy wylać przepłukany bufor ze zlewki zbiorczej.
11. Ostatnią czynnością przed operacją jest dodanie wymaganych enzymów do roztworu stokowego, a następnie przefiltrowanie roztworu enzymów w taki sam sposób, w jaki przefiltrowano pozostałe roztwory dzień wcześniej. Po przefiltrowaniu roztwór ten można pozostawić w temperaturze pokojowej.

Część II. Disekcja serca szczura

1. Zgodnie ze standardowym protokołem uśmierć szczura za pomocą izofluranu w komorze gazowej.
2. Zdezynfekuj miejsce nacięcia na klatce piersiowej 70% etanolem.
3. Otwórz klatkę piersiową za pomocą nożyczek i odsłoń serce.
4. Wstrzyknij do lewej komory 0,5 mL roztworu heparyny (90 U/mL).
5. Wyjmij serce wraz z zachowanym dużym fragmentem aorty i umieść w lodowatym buforze B.

Część III. Izolacja miocytów

1. Typowe serce szczura powinno dostarczyć wysoką frakcję prętowatych miocytów (w przeciwieństwie do martwych, zaokrąglonych komórek), jeśli poniższa procedura zostanie właściwie przestrzegana.
2. Na początek zacisnąć aortę na cewniku. Końcówka cewnika nie powinna być wprowadzona zbyt głęboko do serca, aby zapewnić dobrą perfuzję serca przez tętnicę wieńcową.
3. Po zaciskaniu przywiązać aortę do cewnika za pomocą szwu.
4. Następnie otworzyć regulator linii dożylnej, aby uzyskać szybkie tempo kapania (~60 kropli/min), i pozwolić, aby Bufor B wypłukał serce.
5. Podczas płukania Buforem B użyć małych nożyczek i pincety, aby usunąć przedsionki oraz wszelką tkankę tłuszczową lub płucną przylegającą do serca.
6. Po zakończeniu płukania Buforem B przełączyć przepływ na Bufor A.
7. Podczas 5-minutowego przepływu Buforu A należy szybko wykonać kilka mniejszych czynności.
8. Najpierw ogrzać roztwór enzymu w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C.
9. Na koniec, gdy Bufor A zostanie wyczerpany ze strzykawki (ale wciąż znajduje się w drenach), napełnić strzykawkę A aparatu do perfuzji 50 mL roztworu enzymu.
10. Należy teraz odpipetować cały płyn przepływowy z zlewki zbiorczej w kąpieli wodnej, aż do momentu, gdy roztwór enzymu zacznie perfundować serce.
11. Gdy tylko roztwór enzymu zacznie perfundować serce, uruchomić pompę perystaltyczną, która jest skonfigurowana do przenoszenia roztworu enzymu ze zlewki zbiorczej w celu uzupełnienia strzykawki A.
12. Pozostawić roztwór enzymu w przepływie przez serce przez 10 min. W miarę trawienia serce zaczyna wyglądać na obrzęknięte.
13. Dodać 37,5 μL 0,1 M CaCl₂ do roztworu enzymu w strzykawce A, aby uzyskać efektywne stężenie 0,1 mM Ca²⁺.
14. Po 10 minutach zwiększyć stężenie wapnia do 0,2 mM, dodając dodatkowe 50 μL 0,1 M CaCl₂ do strzykawki A, i kontynuować perfuzję przez kolejne 10 minut.
15. Odciąć komory i przenieść je do małej sterylnej zlewki zawierającej 20 mL roztworu enzymu.
16. W zlewce zwiększyć stężenie wapnia do 0,4 mM, dodając kolejne 40 μL 0,1 M CaCl₂.
17. Ostrożnie posiekać serce na 10 lub więcej kawałków za pomocą małych sterylnych nożyczek.
18. Inkubować zlewkę przez 5 minut w temperaturze 37 °C przy delikatnym kołysaniu.
19. Dodać 40 mL 0,1 M CaCl₂, aby uzyskać efektywne stężenie 0,6 mM Ca²⁺, i delikatnie triturować kawałki serca plastikową pipetą transferową 3-5 razy.
20. Po dodatkowej 5-minutowej inkubacji w 37 °C dodać 40 mL 0,1 M CaCl₂ i delikatnie triturować jak poprzednio.
21. Oddzielić strawione pojedyncze miocyty od niestrawionej tkanki łącznej poprzez filtrację przez sterylne sito o oczkach 500 μm.
22. Pozostawić komórki do osadzenia w probówce 50 ml przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
23. Usunąć nadosad za pomocą pipety transferowej.
24. Delikatnie resuspendować komórki w Buforze Płuczącym #1 i pozostawić komórki do osadzenia na 10-20 min w temperaturze pokojowej.
25. Podczas osadzania komórek pobrać małą alikwot i wykorzystać ten czas na ocenę jakości i żywotności komórek w zawiesinie pod mikroskopem odwróconym. Dobry preparat będzie charakteryzował się wysokim odsetkiem (>80%) komórek prętowatych z wyraźnymi prążkami.
26. Po osadzeniu komórek usunąć nadosad i delikatnie resuspendować komórki w Buforze Płuczącym #2. Pozostawić komórki do osadzenia w temperaturze pokojowej, co ponownie powinno zająć 10-20 minut, i usunąć nadosad.
27. Powtórzyć proces płukania jeszcze raz z użyciem Buforu Płuczącego #3; komórki będą wtedy gotowe do hodowli.

Część IV. Hodowla komórkowa miocytów

1. Komórki należy delikatnie resuspendować w pożywce z 5% surowicą. Przed przeniesieniem komórek na płytki do hodowli tkankowej, płytki należy przemyć 1x SFM. Przenieść komórki z pożądaną gęstością i inkubować w inkubatorze do hodowli tkankowej z CO₂ przez 3-5 godzin.
2. Zmienić pożywkę na 1x SFM.
3. Komórki można hodować do czterech dni i wykorzystywać w eksperymentach zgodnie z potrzebami.

Część V. Reprezentatywne wyniki/efekty

Przy prawidłowym wykonaniu protokołu, pod mikroskopem odwróconym powinno być widocznych ponad 70% żywych miocytów serca.

Tabela 1: Przepis na roztwór 1 L 10X buforu KH pozbawionego Ca²⁺:

	masa	stężenie końcowe
NaCl	68.96 g	1180 mM
KCl	3.58 g	48 mM
HEPES	59.58 g	250 mM
K2HPO4	2.85 g	12.5 mM
MgSO4	3.08 g	12.5 mM

Tabela 2: Skład roztworu dla 1 L buforu A:

Dodać 1,98 g glukozy do 100 mL 10X buforu KH i dopełnić do końcowej objętości 1 L. Dostosować osmolalność do warunków zbliżonych do fizjologicznych (~300) za pomocą glukozy. Dostosować pH do 7,4 za pomocą NaOH.

-	Masa	Stężenie końcowe
10X KH Buffer	100 mL	100 ml
Glukoza	1.98 g	11 mM
Dopełnić do 1 L
Dopełnić do pH 7.4 za pomocą NaOH
Dostosować osmolarność do warunków zbliżonych do fizjologicznych (~300) za pomocą glukozy.

Tabela 3: Receptura roztworów dla buforów enzymatycznych

	masa	Stężenie końcowe
Collagenase Type II	25 mg	0.05% (w/v)
Protease XIV	10 mg	0.02% (w/v)
BDM	0.025 g	5 mM
Karnityna	0.020 g	2 mM
Tauryna	0.031 g	5 mM
Kwas glutaminowy	0.020 g	2 mM
0.1 M CaCl2	12.5 uL	25 uM
Bufor A		Uzupełnić do 50 ml

Tabela 4: Skład roztworu 25X BDM/Taurine/BSA (B/T/B)

	masa	Stężenie końcowe
BDM	0.076 g	125 mM
Tauryna	0.094 g	125 mM
BSA		0.1% (w/v)
Bufor A		Uzupełnić do 6 mL

Tabela 5: Skład roztworów dla buforu B oraz buforów do płukania

Bufor:	B	#1	#2	#3
Dodać:
0.5 M CaCl2	0.4 mL	0.1 mL	0.125 mL	0.15 mL
Stężenie końcowe CaCl2	1 mM	1 mM	1.25 mM	1.5 mM
25X B/T/B	---	2 mL	2 mL	2 mL
Bufor A do objętości końcowej	200 mL	50 mL	50 mL	50 mL

Tabela 6: Skład pożywki do hodowli

2X Pożywka bezsurowicza (SFM)
		Stężenie końcowe
		(po rozcieńczeniu)
Karnityna	0.099 g	10 mM (5 mM)
Tauryna	0.063 g	10 mM (5 mM)
Kreatyna	0.075 g	10 mM (5 mM)
Antybiotyk/Antymykotyk	0.5 ml	1% (0.5%) (v/v)
Media 199	45 mL	Uzupełnić do 50 mL
1X SFM
		Stężenie końcowe
2X SFM	25 mL	1X
Media 199		Uzupełnić do 50 mL
1X Pożywka z 5% surowicą
		Stężenie końcowe
2X SFM	25 mL	1X
FBS	2.5 mL	5% (v/v)
Media 199		Uzupełnić do 50 mL

Dyskusja

Kluczowym etapem jest szybkość, z jaką wyizolowane serce zostaje zawieszone w systemie perfuzyjnym. Długość okresu trawienia enzymatycznego może się nieco różnić dla każdego szczura. Korekta zależy od tego, jak miękkie staje się serce po standardowym czasie trawienia. Powolna regeneracja Ca²⁺ po trawieniu enzymatycznym jest niezbędna do uzyskania zdrowych komórek tolerujących Ca²⁺.

W przypadku świnki morskiej protokół jest taki sam, z wyjątkiem zastosowania hialuronidazy...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
NaCl	Sigma-Aldrich	S6191
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
K2HPO4	Sigma-Aldrich	P9666
MgSO₄4	Fluka	63068
Glukoza	Sigma-Aldrich	G7021
CaCl22	Sigma-Aldrich	C7902
Sód heparyny	Sigma-Aldrich	H4784
Kolagenaza typu II	Worthington Biochemical	LS004176
Proteaza XIV	Sigma-Aldrich	P5147
Monoksym 2,3-butanodionu (BDM)	Sigma-Aldrich	B0753
Karnityna	Sigma-Aldrich	C9500
Tauryna	Sigma-Aldrich	T0625
Kwas glutaminowy	Sigma-Aldrich	G1501
BSA	Sigma-Aldrich	A3294
Kreatyna	Sigma-Aldrich	C3630
Antybiotyk	Cellgro	30-009-CI
Pożywka 199	GIBCO, by Life Technologies	11150
FBS (płodowa surowica bydlęca)	Hyclone	SH30071.03
Laminina	BD Biosciences	354232
kąpiel wodna	Fisher Scientific	15-462-5
chemiczna pompa o zmiennym przepływie	Fisher Scientific	15-077-67
płytka hodowlana 6-dołkowa	Corning	3516