Pierwotna hodowla miocytów serca dorosłego szczura

Część I. Przygotowanie do operacji

1. Dzień przed operacją na szczurach upewnij się, że wszystkie roztwory są przygotowane, ale nie dodawaj jeszcze żadnych enzymów. A, B i bufor do płukania powinny być przefiltrowane pod kątem sterylności przed przechowywaniem. Wszystkie powinny być przechowywane w temperaturze 4 °C.
2. 6-dołkowe płytki do hodowli tkankowych należy również dzień wcześniej posiać 10-20 μg/ml lamininy w 2 ml 1XSFM i przechowywać w temperaturze 37 °C w inkubatorze_CO2
.
3. W dniu zabiegu należy przygotować narzędzia chirurgiczne, sterylizując zacisk, nożyczki i kleszcze 70% etanolem i pozostawić do wyschnięcia na ręczniku papierowym.
4. Strzykawka o pojemności 1 ml wypełniona 0,5 ml roztworu heparyny (90 j./ml) jest gotowa
.
5. Teraz dobrą praktyką jest mycie aparatu perfuzyjnego poprzez przepuszczenie przez 70% etanolu, używając pompy perystaltycznej w odwrotnej kolejności. Po zakończeniu płukania etanolem przepłukać aparat wodą podwójnie destylowaną, a na koniec spłukać buforem A. Przepływ jest zbierany w zlewce umieszczonej w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
6. Aby przygotować oczyszczony aparat perfuzyjny, należy napełnić prawą probówkę strzykawki 40 ml buforu A, a lewą probówkę strzykawki 40 ml buforu B.
7. Zalać rurkę perfuzyjną do końcówki cewnika, pozwalając buforowi A przepływać przez aparat. Uzupełnić strzykawkę do buforu A do poziomu 40 ml. Po wykonaniu tego kroku upewnij się, że w rurce nie ma uwięzionych pęcherzyków powietrza.
8. Teraz zamknij zawór odcinający strzykawki buforu A i powtórz proces z buforem B, tak aby rurka perfuzyjna była teraz zalana buforem B.
9. Na koniec aparat perfuzyjny pozostawia się z otwartym zaworem odcinającym buforu B, ale z zatrzymaniem przepływu za pomocą regulatora na linii dożylnej.
10. Wylać przepływowy bufor do zlewki zbiorczej.
11. Ostatnią rzeczą, którą należy zrobić przed operacją, jest dodanie wymaganych enzymów do roztworu podstawowego, a następnie przefiltrowanie roztworu enzymatycznego tak, jak inne roztwory zostały przefiltrowane dzień wcześniej. Po przefiltrowaniu roztwór ten można pozostawić w temperaturze pokojowej.

Część II. Sekcja serca szczura

1. Zgodnie ze standardowym protokołem należy poddać szczura eutanazji izofluranem w komorze gazowej.
2. Wysterylizuj obszar nacięcia na klatce piersiowej 70% etanolem.
3. Otwórz klatkę piersiową za pomocą nożyczek i odsłoń serce.
4. Wstrzyknąć do lewej komory 0,5 ml roztworu heparyny (90 j./ml).
5. Usuń serce z nienaruszoną dużą częścią aorty, umieść w lodowatym buforze B.

Część III. Izolacja miocytów

1. Typowe serce szczura powinno dawać dużą frakcję miocytów w kształcie pręcików (w przeciwieństwie do martwych zaokrąglonych komórek), jeśli poniższa procedura jest prawidłowo przestrzegana.
2. Aby rozpocząć, zaciśnij aortę do cewnika. Końcówka cewnika nie powinna być wciskana zbyt głęboko w serce, aby zapewnić dobre ukrwienie serca przez tętnicę wieńcową.
3. Po zaciśnięciu przywiąż aortę do cewnika za pomocą szwu.
4. Następnie otwórz regulator linii dożylnej, aby umożliwić szybkie kapanie (~60 kropli/min) i pozwól buforowi B wypłukać serce.
5. Podczas płukania buforem B użyj małych nożyczek i kleszczyków, aby usunąć przedsionki i tkankę tłuszczową lub płucną przylegającą do serca.
6. Po zakończeniu buforu B przełącz przepływ na bufor A.
7. Podczas gdy bufor A może płynąć przez 5 minut, kilka małych zadań powinno zostać szybko wykonanych.
8. Najpierw ogrzej roztwór enzymu w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
9. Na koniec, gdy bufor A zostanie wyczerpany ze strzykawki (ale nadal obecny w rurce), załaduj 50 ml roztworu enzymu do strzykawki A aparatu perfuzyjnego
10. Teraz konieczne jest odrzucenie całego przepływu ze zlewki zbiorczej w łaźni wodnej (przez pipetowanie), aż roztwór enzymatyczny przetopi serce.
11. Gdy tylko roztwór enzymatyczny przeniknie do serca, aktywuj pompę perystaltyczną, która jest ustawiona na przenoszenie roztworu enzymu ze zlewki zbiorczej w celu uzupełnienia strzykawki A.
12. Pozwól, aby roztwór enzymu przepływał przez serce przez 10 minut. Gdy serce trawi się, zaczyna wyglądać na wzdęte.
13. Dodać 37,5 μl 0,1 M CaCl₂ do roztworu enzymu w strzykawce A, aby uzyskać skuteczne stężenie 0,1 mM^Ca2+.
14. Po 10 minutach zwiększyć stężenie wapnia do 0,2 mM, dodając dodatkowe 50 μl 0,1 M CaCl₂ do strzykawki A i pozwól perfuzji postępować przez kolejne 10 minut.
15. Odciąć komory i przenieść do małej sterylnej zlewki zawierającej 20 ml roztworu enzymu.
16. W zlewce zwiększyć stężenie wapnia do 0,4 mM, dodając 40 dodatkowych μl 0,1 M CaCl₂.
17. Delikatnie zmiel serce na 10 lub więcej kawałków za pomocą małych sterylnych nożyczek.
18. Inkubować zlewkę przez 5 minut w temperaturze 37 °C, delikatnie kołysząc.
19. Dodać 40 ml 0,1 M CaCl₂, aby uzyskać skuteczne stężenie 0,6 mM Ca²⁺ i delikatnie rozetrzeć kawałki serca plastikową pipetą transferową 3-5 razy.
20. Po inkubacji przez dodatkowe 5 minut w temperaturze 37 °C, dodać 40 ml 0,1 M CaCl₂ i delikatnie rozcierać jak poprzednio.
21. Oddziel strawione pojedyncze miocyty od niestrawionej tkanki łącznej za pomocą filtracji przez sterylną siatkę 500 μm.
22. Pozwól komórkom osiąść w probówce o pojemności 50 ml przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
23. Odrzucić supernatant za pomocą pipety do przenoszenia.
24. Delikatnie zawieś komórki w buforze do mycia #1 i pozwól komórkom osiąść przez 10-20 minut w temperaturze pokojowej.
25. Podczas gdy komórki osiadają, weź małą porcję i wykorzystaj ten czas jako okazję do oceny jakości i żywotności komórek w zawiesinie pod odwróconym mikroskopem. Dobry preparat będzie zawierał wysoki odsetek (>80%) komórek przypominających pręciki z wyraźnymi prążkami.
26. Gdy komórki osiądną, wyrzuć supernatant i delikatnie ponownie zawieś komórki w buforze płuczącym #2. Pozwól komórkom osiągnąć w temperaturze pokojowej, co powinno ponownie zająć 10-20 minut, i wyrzuć supernatant.
27. Powtórz proces mycia jeszcze raz za pomocą buforu do płukania #3, a komórki będą gotowe do hodowli.

Część IV. Hodowla komórek miocytów

1. Delikatnie zawiesić komórki w 5% pożywce Surowica. Przed przeniesieniem komórek na płytki do hodowli tkankowych należy umyć płytki 1x SFM. Przenieś komórki o żądanej gęstości i inkubuj w inkubatorze do hodowli tkankowych CO₂ przez 3-5 godzin.
2. Przełącz nośnik na 1x SFM.
3. Komórki mogą być hodowane przez okres do czterech dni i wykorzystywane w razie potrzeby do eksperymentów.

Część V. Reprezentatywne wyniki/Wynik

Pod odwróconym mikroskopem powinno być więcej niż 70% żywych miocytów serca, jeśli protokół jest wykonany poprawnie.

Tabela 1: Przepis na roztwór dla 1 L 10X Ca²⁺-free KH Buffer:

Tabela 2: Przepis na roztwór dla 1 L Buffera A:

Dodaj 1,98 g glukozy do 100 ml buforu 10X KH i doprowadź do końcowej objętości 1 L. Dostosuj osmolarność do stanu bliskiego fizjologii (~300) za pomocą glukozy. Doprowadzić do pH 7,4 za pomocą NaOH.

Tabela 3: Przepis na roztwór dla enzymatycznych

Tabela 4: Przepis na roztwór dla 25X BDM/Tauryna/BSA (B/T/B)

Tabela 5: Przepis na roztwór dla buforu B i płuczących

Tabela 6: Przepis na roztwór dla pożywek hodowlanych

A critical step is the speed with which the isolated heart is hung up on the perfusion system. The length of the enzymatic digestion period may be a little different for each rat. The adjustment depends on how soft the heart becomes after the regular period of digestion. The slowly recovery of Ca²⁺ after enzyme digestion is essential for obtaining Ca²⁺-tolerant healthy cells.

For guinea pig, the protocol is the same except hyaluronidase is used instead of Protease XIV. Typically, we find the that initial percentage of living cells is lower for guinea pig compared to rat, although they survive just as long in culture.