Analiza naprawy pęknięcia podwójnej nici DNA (DSB) w komórkach ssaków

W tym protokole opisujemy metodę analizy naprawy DNA DSB za pomocą chromosomalnie zintegrowanych konstruktów reporterowych^1,2, gdzie DSB są indukowane in vivo przez przejściową ekspresję rzadkiej endonukleazy tnącej I-SceI³. Zintegrowany test ma tę zaletę, że analizuje naprawę DSB w kontekście chromosomalnym. Protokół ten wymaga jednak przedłużonego pasażowania komórek, co może być problematyczne podczas pracy z komórkami pierwotnymi.

Alternatywnym podejściem jest test pozachromosomalny, w którym konstrukty reporterowe są trawione in vitro za pomocą endonukleaz I-SceI lub HindIII, a następnie transfekowane do komórek jako liniowe DNA. Protokół testu ekstrachromosomalnego⁴ jest podobny do testu zintegrowanego opisanego poniżej, z następującymi modyfikacjami. W przypadku testu pozachromosomalnego należy pominąć integrację konstruktów reporterowych i zamiast tego współtransfekować komórki za pomocą 0,5 μg plazmidu reporterowego NHEJ zlinearyzowanego in vitro za pomocą I-SceI lub HindIII i 0,1 μg pDsRed2-N1 jako kontroli transfekcji. Do testu HR kotransfekcja 2 μg plazmidu reporterowego HR zlinearyzowanego za pomocą I-SceI lub HindIII i 0,1 μg pDsRed2-N1. Przeanalizuj komórki za pomocą FACS trzy dni po transfekcji. Test pozachromosomalny pozwala na analizę naprawy DSB w pierwotnych izolatach, unikając rozległego pasażowania komórek i ułatwiając analizę wielu linii komórkowych.

1. Konstrukcje reporterskie dla NHEJ i HR

^Kaseta reporterska NHEJ 5 zawiera gen GFP z zmodyfikowanym intronem 3 kb z genu Pem1 (GFP-Pem1). Intron Pem1 zawiera egzon adenowirusowy otoczony sekwencjami rozpoznającymi endonukleazy HindIII i I-SceI (ryc. 1a) do indukcji DSB. Miejsca I-SceI są w orientacji odwróconej. I-SceI ma niepalindromiczną sekwencję rozpoznawania, stąd dwa odwrócone miejsca generują niezgodne końce DNA (ryc. 1c). Niekompatybilne końcówki DNA najlepiej naśladują naturalnie występujące DSB. Nienaruszona kaseta NHEJ jest GFP ujemna, ponieważ ekson adenowirusowy zakłóca GFP ORF. Po indukcji DSB przez I-SceI ekson adenowirusowy jest usuwany, a NHEJ przywraca funkcję genu GFP (ryc. 2). Unikalną cechą tego reportera NHEJ jest to, że może on wykrywać szerokie spektrum zdarzeń NHEJ, ponieważ intron może tolerować delecje i insercje.

^Kaseta reportera HR 1 (Rysunek 1b) jest również oparta na GFP-Pem1. W kasecie HR pierwszy ekson GFP-Pem1 zawiera delecję 22 pz połączoną z insercją trzech miejsc restrykcyjnych, I-SceI/HindIII/I-SceI. Usunięcie gwarantuje, że GFP nie może zostać odtworzona przez zdarzenie NHEJ. Dwa miejsca I-SceI są w orientacji odwróconej, tak że trawienie I-SceI pozostawia niekompatybilne końce (ryc. 1c). Po pierwszej kopii GFP-Pem1 następuje pierwszy ekson i intron GFP-Pem1 bez promotora/bez ATG. Nienaruszony konstrukt jest GFP-ujemny. Po indukcji DSB przez trawienie I-SceI funkcjonalny gen GFP jest odtwarzany przez wewnątrzcząsteczkową lub międzycząsteczkową konwersję genu między dwiema zmutowanymi kopiami pierwszego eksonu GFP-Pem1. Ponieważ w drugiej kopii genu GFP brakuje pierwszego kodonu ATG i drugiego eksonu, krzyżowanie lub wyżarzanie jednoniciowe nie przywróci aktywności GFP. Taka konstrukcja pozwala na wyłączne wykrywanie konwersji genów, która jest dominującym szlakiem HR w komórkach ssaków (ryc. 3).

2. Integracja konstruktów reporterowych z genomem

1. Wykonaj wysokiej jakości preparat plazmidu reporterowego NHEJ lub HR. Aby uzyskać najlepsze wyniki, użyj Qiagen Endo Free Kit. Zmierzyć stężenie i czystość plazmidu przez absorbancję przy 260/280 nm.
2. Linearyzować 10 μg plazmidu reporterowego przez trawienie za pomocą 50 U NheI w 50 μl (całkowita objętość reakcji) przez 6 godzin w inkubatorze o temperaturze 37°C (nie używać suchego bloku, aby zapobiec parowaniu). Oczyść DNA z roztworu trawiącego za pomocą zestawu Qiagen QiaexII Kit, eluuj DNA do 20 μl 10 mM Tris-HCl pH 8,0. Zmierzyć stężenie i czystość DNA przez absorbancję przy 260/280 nm. Zwykle podczas oczyszczania tracisz 20-30% DNA. Potwierdź plon i trawienie, umieszczając małą porcję (2 μl) na żelu wraz z niestrawionym konstruktem reporterowym. Oczyszczona linearyzacja konstrukcji reporterowej może być przechowywana w temperaturze 20°C.
3. Przygotowując się do transfekcji, doprowadź komórki do najlepszych warunków wzrostu. Jeśli zaczynasz od zamrożonej fiolki, podziel komórki dwukrotnie przed transfekcją. Jeśli zaczynasz od płytki zlewających się komórek, podziel je raz.
4. Hoduj komórki do 70-80% zbieżności (zwykle dwa dni, jeśli są posiane 5x10 5 komórek/płytkę 100 mm, dla normalnych ludzkich fibroblastów). Kluczowe znaczenie dla najlepszej wydajności transfekcji ma doprowadzenie komórek do wzrostu logarytmicznego. Aktywnie rosnąca kultura zawiera komórki w stadium M (widziane jako zaokrąglone komórki przyczepione do powierzchni).
5. Transfekcję komórek za pomocą Amaxa Nucleofector należy wykonać zgodnie z zaleceniami producenta. W przypadku fibroblastów użyj roztworu NHDF i programu U20. Do transfekcji zbierz komórki z dwóch płytek o średnicy 100 mm (~2x10⁶ komórek). Bardzo ważne jest, aby nie przesadzić z trypsynizacją komórek. Przestań trypsynizację, gdy tylko 80% komórek oderwie się od płytki. Ponownie zawiesić komórki w roztworze NHDF. Komórki są wrażliwe na roztwór NHDF, dlatego zminimalizuj czas inkubacji i delikatnie wymieszaj komórki. Transfekować komórki 0,5 μg zlinearyzowanego konstruktu reporterowego. Te warunki transfekcji, gdy są stosowane z normalnymi ludzkimi fibroblastami, powodują integrację pojedynczej kopii konstruktu reporterowego dla większości integrantów.
6. Wybierz komórki z chromosomalnie zintegrowanymi konstruktami reporterowymi, dodając 1 mg / ml genetycyny (G418) 24 godziny po transfekcji. Kontynuuj selekcję przez 7-10 dni.
7. Wybierz kolonie odporne na G418 (możesz wybrać pojedyncze kolonie lub połączyć odporne klony). Rozwiń kulturę do około pięciu płytek o średnicy 100 mm. Zamrozić trzy płytki do wykorzystania w przyszłości i rozszerzyć pozostałe dwie płytki do żądanej liczby komórek (zwykle dziesięć płytek 100 mm wystarcza na pięć transfekcji).
8. Gdy komórki osiągną 70-80% konfluencji (dwa dni po posianiu 5x10⁵ komórek na 100 mm płytki dla fibroblastów), komórki są gotowe do transfekacji plazmidem z ekspresją I-SceI.

3. Indukcja DSB przez przejściową ekspresję endonukleazy I-SceI

1. Transfekcja ~ 2x10⁶ komórek (dwie płytki) logarytmicznie rosnącej kultury z mieszaniną 5 μg plazmidu eksprymującego I-SceI i 0,1 μg pDsRed2-N1 (Clontech) jako kontrola wydajności transfekcji za pomocą Amaxa Nucleofector (użyj roztworu NHDF i programu U20 dla fibroblastów).
2. W tym samym czasie przygotuj trzy kontrole kalibracyjne dla FACS poprzez transfekcję ~2x10⁶ komórek z (i) 5 μg plazmidu eksprymującego EGFP; (ii) 5 μg pDsRed2-N1; (iii) 5 μg plazmidu kontrolnego, który nie wykazuje ekspresji białka fluorescencyjnego (używamy minigenu HPRT kodującego plazmid).
3. Hoduj komórki przez cztery dni, aby zapewnić wystarczającą ilość czasu na ekspresję białek GFP i DsRed.
4. (Opcjonalnie) Trzy dni po transfekcji sprawdzić skuteczność transfekcji i ekspresję białek GFP i DsRed za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu odwróconego z filtrami do wykrywania GFP i DsRed.

4. Analiza komórek GFP+ i DsRed+ za pomocą cytometrii przepływowej

1. Cztery dni po transfekcji pobrano komórki transfekowane I-SceI i komórki kontrolne. Ponownie zawiesić komórki w 500 μl PBS i przenieść komórki do probówek FACS. Na tym etapie bardzo ważne jest, aby zebrać wszystkie komórki i uzyskać komórki o okrągłym kształcie. Aby to osiągnąć, zaleca się stosowanie dłuższego czasu trypsynizacji lub silniejszej trypsyny. Upewnij się, że 99% komórek jest oderwanych od płytki i ma okrągły kształt, obserwując komórki pod mikroskopem. Utrzymuj komórki na lodzie chronione przed światłem (przykryj wiadro z lodem folią). Możliwe jest przechowywanie komórek na lodzie przez kilka godzin. Aby uzyskać najlepsze wyniki, przeanalizuj komórki natychmiast po zbiorach.
2. Skalibruj FACS za pomocą GFP, DsRed i kontroli ujemnych. Dostosuj napięcie i kompensację koloru, aby uwzględnić wszystkie ogniwa fluorescencyjne w analizie (rysunek 4). Należy pamiętać, że intensywność fluorescencji próbek eksperymentalnych będzie niższa niż w próbach kontrolnych.
3. Analizuj komórki transfekowane I-SceI za pomocą FACS. Liczymy co najmniej 20 000 komórek do każdego zabiegu. Aby zapobiec potencjalnym zakłóceniom między fluorescencją GFP i DsRed, zaleca się utrzymanie procentu komórek GFP+ lub DsRed+ poniżej 25%. Jeśli procent komórek DsRed+ lub GFP+ jest wyższy, zmniejsz ilość plazmidu pDsRed2-N1 lub I-SceI. W naszych eksperymentach musieliśmy tylko dostosować ilość plazmidu pDsRed2-N1, ale nie plazmidu I-SceI.
4. Procent komórek GFP+ odpowiada skuteczności naprawy DNA DSB, a procent komórek DsRed+ wskazuje na skuteczność transfekcji. Oblicz względną skuteczność naprawy DNA DSB jako stosunek komórek GFP+ do komórek DsRed+.
5. Naprawione skrzyżowania końcowe mogą być sekwencjonowane w celu sprawdzenia dokładności naprawy. Konstrukty reporterowe zawierają geny replikacji pochodzenia E. coli i geny oporności na kanamycynę (ryc. 1). Umożliwia to uratowanie konstruktów poprzez trawienie genomowego DNA za pomocą enzymu EcoRI, recyrkularyzację i transformację w kompetentne komórki E. coli. Uratowane plazmidy są następnie analizowane przez trawienie restrykcyjne i sekwencjonowanie.

5. Reprezentatywne wyniki

Typowe wyniki FACS z transfekcji kontrolnych oraz eksperymentów NHEJ i HR są pokazane na rysunkach 4 i 5. Intensywność fluorescencji i liczba komórek fluorescencyjnych będą niższe w komórkach transfekowanych I-SceI zawierających zintegrowane konstrukty NHEJ i HR (Figura 5) w porównaniu z kontrolami (Figura 4) ze względu na różnicę w liczbie kopii konstruktów GFP i DsRed w tych komórkach. Każda komórka w eksperymencie zawiera tylko jedną kopię zintegrowanego konstruktu reporterowego, dlatego udane zdarzenia naprawcze odtworzą gen GFP we frakcji komórek. Transfekcja 0,1 μg pDsRed2-N1 w ludzkich fibroblastach dostarcza około 1 kopii plazmidu na komórkę.

Wydajność NHEJ i HR jest obliczana jako stosunek komórek GFP+/DsRed+. NHEJ jest bardziej wydajnym procesem niż HR w komórkach ludzkich². W ludzkich fibroblastach wydajność NHEJ wynosi zwykle 0,6-1,3, a wydajność HR wynosi 0,05-0,3. Ponieważ wydajność DSB jest mierzona jako stosunek komórek GFP+/DsRed+, zmiany w mieszaninie plazmidów I-SceI i DsRed2-N1 mogą wpływać na wynik. Jakość plazmidu może również wpływać na wyniki poprzez zmianę wydajności transfekcji. Dlatego, aby uzyskać spójne pomiary, ważne jest, aby użyć tej samej mieszanki plazmidów w jednym eksperymencie. Co więcej, na skuteczność naprawy DSB ma wpływ typ komórki, faza cyklu komórkowego i lokalizacja chromosomów zintegrowanych konstruktów.

Rysunek 1. Konstrukty reporterowe do analizy naprawy DNA DSB przez NHEJ (A) i HR (B). (C) Niekompatybilne końce DNA generowane przez trawienie dwóch odwróconych miejsc I-SceI. SD, dawca spawów; SA, akceptor spawów; zacienione kwadraty, miejsca poliadenylacji; Neo/Kana, pojedynczy ORF kontrolowany przez dwa promotory: SV40 nadający oporność na neomycynę w komórkach ssaków; oraz β-laktamaza nadająca oporność na kanamicynę u E. coli; Ori, E. Coli pUC pochodzenie replikacji.

Rysunek 2. Konstrukt reporterowy do analizy NHEJ. W tym konstrukcie gen GFP jest nieaktywny; jednak po wprowadzeniu DSB i pomyślnym NHEJ konstrukcja staje się GFP+. Poniżej pokazany jest produkt naprawczy tego reportera firmy NHEJ.

Rysunek 3. Konstrukt reporterowy do analizy HR przez konwersję genów. Po indukcji DSB przez I-SceI, HR przez konwersję genu (GC) odtwarza aktywny gen GFP. Poniżej przedstawiono produkty naprawy tego reportera przez główne szlaki naprawy DNA: GC, crossing-over (X- nad), wyżarzanie jednopasmowe (SSA) i NHEJ. Produkt naprawczy X-over jest pokazany dla rekombinacji wewnątrzcząsteczkowej, rekombinacja egzamolekularna da ten sam produkt, ale zlokalizowany na jednym chromosomie. Geny wykazujące ekspresję aktywnego białka GFP (GFP+) są oznaczone kolorem zielonym.

Rysunek 4. Kalibracja parametrów do analizy FACS. (A) Fibroblasty transfekowane plazmidem pHPRT, stosowane jako kontrola ujemna w celu wykluczenia komórek autofluorescencyjnych. (B) Fibroblasty transfekowane plazmidem pEGFP, używane do ustawiania bramkowania dla komórek GFP+ (zielony obszar). (C) Fibroblasty transfekowane plazmidem pDsRed2-N1, używane do ustawiania bramkowania dla komórek DsRed+ (czerwony obszar).

Rysunek 5. Typowe wyniki analizy NHEJ (A) i HR (B) w normalnych ludzkich fibroblastach z chromosomalnie zintegrowanymi konstruktami reporterowymi.

Nie stwierdzono konfliktu interesów.