Kokultura 3D komórek raka płuc z CAF: system modelowy in vitro do badania progresji guza

1.Pasażowanie i hodowla komórek TUM622 i CAF w hodowlach 2D

1. Pasażowanie i hodowla komórek TUM622
   1. Ciepła pożywka hodowlana 3D i odczynniki do dysocjacji komórek (patrz tabela materiałów) dla komórek TUM622 w temperaturze 37 °C.
   2. Pasaż komórek TUM622 przy 80% zbiegu w kolbach 2D. Zwykle dzieje się to 1 tydzień po pasażu.
   3. Wyrzucić starą pożywkę z kolby T75 i przemyć raz 6 ml buforu HEPES. Należy unikać pipetowania bezpośrednio na komórki.
   4. Odessać bufor HEPES. Dodaj 4 ml trypsyny/EDTA (0,25 mg/ml, patrz tabela materiałów) w celu szybkiego spłukania i wyrzuć trypsynę/EDTA.
   5. Dodać 2 ml trypsyny/EDTA i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Wyjąć kolby z inkubatora i postukać w kolby, aby poluzować komórki bez tworzenia pęcherzyków powietrza, a następnie zwrócić kolby do inkubatora na dodatkowe 5 minut
      nuta: Długotrwała ekspozycja na trypsynę nieodwracalnie uszkodzi komórki i zmieni ich fenotyp, dlatego zaleca się ograniczenie czasu ekspozycji komórek na trypsynę.
   6. Upewnij się, że komórki odłączyły się i zdysocjowały pod mikroskopem świetlnym (4x lub 10x). Dodać 4 ml buforu neutralizacyjnego (bufor TNS) (patrz informacje o odczynniku do subkultur w Tabeli materiałów), a następnie 10 ml pożywki 3D (patrz Tabela materiałów).
   7. Delikatnie pipetuj w górę i w dół, aby jeszcze bardziej zdysocjować komórki za pomocą pipety o pojemności 10 ml. Przenieść zawiesinę przez sitko o pojemności 40 μm do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
   8. Policz liczbę komórek za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.
   9. Nasiona 0,8 x 10⁶ komórek/kolba T75 w 20 ml pożywki hodowlanej 3D (patrz tabela materiałów).
   10. Karm komórki co drugi dzień, zastępując połowę zużytej pożywki świeżą pożywką.
2. Pasażowanie i hodowla CAF
   1. Przejście CAF, gdy komórki osiągają zbieg. Zwykle dzieje się to po 5 dniach hodowli z podziału 1:2.
   2. Przygotuj pożywkę CAF za pomocą pożywki podstawowej RPMI z 20% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą, 1% L-glutaminą i 1% penicyliną/streptomycyną. Podgrzać podłoże do temperatury 37 °C.
   3. W kolbie T75 przepłukać CAF solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), a następnie dodać 2 ml trypsyny/EDTA i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
   4. Obserwować pod mikroskopem świetlnym, aby upewnić się, że komórki uległy dysocjacji w kolbie (4x lub 10x). Jeśli nie, przedłuż inkubację o kolejne 2-3 minuty.
   5. Gdy komórki odłączą się i zdysocjują, dodaj 10 ml pożywki hodowlanej 3D, aby zneutralizować trypsynę/EDTA i kilkakrotnie pipetuj w górę iw dół, aby dalej dysocjować CAF.
   6. Przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i wirować w temperaturze 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
   7. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w odpowiedniej objętości pożywki 3D (patrz tabela materiałów) i umieścić w dwóch nowych kolbach T75.

2. Posiewanie komórek TUM622 w macierzy zewnątrzkomórkowej do hodowli 3D

1. Dzień przed eksperymentem rozmrozić fiolki z matrycą błony podstawnej w lodówce o temperaturze 4 °C przez noc. Plastikowe pipety (2 ml) i końcówki schłodzić w temperaturze -20 °C przez noc.
   nuta: Nie wszystkie partie macierzy błony podstawnej mają taką samą zdolność do wspierania wzrostu 3D komórek TUM622. Dlatego konieczne jest nabycie i przetestowanie wielu partii macierzy błony podstawnej w celu zidentyfikowania tych, które wspierają silne tworzenie acini. Zwykle wymaga to wyższego stężenia białka (16-18 mg/ml) w matrycy.
2. W dniu eksperymentu w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C należy umieścić ciepłą pożywkę hodowlaną 3D, bufor HEPES, trypsynę/EDTA i bufor neutralizujący trypsynę (TNS). Bezpośrednio przed założeniem kultury wyjmij rozmrożoną matrycę błony podstawnej z lodówki i umieść fiolkę na lodzie.
3. Schłodzić płytki do hodowli tkankowych na metalowej chłodziarce platformowej umieszczonej na lodzie. Umieść probówki wirówkowe na metalowym stojaku chłodzącym na lodzie.
4. Korzystając z komórek TUM622 uzyskanych w kroku 1.1.7, oblicz żądaną liczbę komórek potrzebnych do posiewu. Zazwyczaj potrzeba 15 000-30 0000 komórek na dołek 24-dołkowej płytki. Niższa gęstość jest bardziej odpowiednia do obrazowania i kwantyfikacji, podczas gdy wyższa gęstość jest preferowana podczas pobierania komórek do ekstrakcji RNA lub western blot.
5. Przenieść zawiesinę komórek do schłodzonej probówki wirówkowej (każda probówka zawiera komórki do trzykrotnego posiania) i odwirować w temperaturze 300 x g w wirówce kubełkowej do zawieszania w temperaturze 4 °C przez 5 minut.
6. Ostrożnie odessać supernatant pipetą zasysającą przymocowaną do niefiltrowanej końcówki (20 μl), pozostawiając około 100 μl pożywki w probówce (jako wskazówkę należy użyć oznaczeń na probówce).
7. Delikatnie postukaj w bok rurki, aby usunąć i oddzielić granulkę przed powrotem do stojaka chłodzącego.
8. Używając wstępnie schłodzonych pipet o pojemności 2 ml, delikatnie wymieszaj matrycę, pipetując kilka razy w górę i w dół, utrzymując fiolkę w kontakcie z lodem. Pipetować z równą i umiarkowaną prędkością, aby podczas tej procedury do matrycy nie zostały wprowadzone pęcherzyki.
9. Przenieść odpowiednią objętość matrycy do każdej probówki wirówkowej. W przypadku posiewu trzykrotnego na płytce 24-dołkowej dodaj 1,1 ml macierzy membrany podstawnej do każdej probówki.
10. Używając wstępnie schłodzonych końcówek, odpipetuj matrycę w każdej probówce w górę i w dół około 10 razy, aby uzyskać jednolitą zawiesinę komórek.
11. Przenieść 310 μl zawiesiny komórek/matryc do każdego dołka wstępnie schłodzonej płytki 24-dołkowej. Pipetę umieszcza się pod kątem 90° do powierzchni płytki, a zawiesinę dodaje się do środka studzienki. Zawieszenie powinno się rozłożyć i przykryć całą studnię bez konieczności przechylania płyty.
12. Aby ułatwić dalszą analizę immunofluorescencyjną, umieść zawiesinę komórki/matrycy równolegle w szkiełkach z 2-dołkową komorą. Przenieść 100 μl zawiesiny komórek/matryc do środka studzienki z 2-dołkowym szkiełkiem komorowym (patrz Tabela materiałów). Dzięki temu matryca może tworzyć strukturę przypominającą kopułę o znacznie mniejszej objętości.
13. Włożyć płytkę i komorę z powrotem do inkubatora do hodowli tkankowych i inkubować przez 30 minut, aby umożliwić zestalenie się matrycy. Zbadaj płytkę/szkiełko pod mikroskopem świetlnym, aby upewnić się, że pojedyncze komórki są równomiernie rozmieszczone w matrycy (4x lub 10x).
14. Dodaj 1 ml wstępnie podgrzanej pożywki 3D do każdego dołka i 1,5 ml pożywki 3D do każdego dołka szkiełka komorowego, a następnie włóż je z powrotem do inkubatora.

3. 3D Kokulturacja komórek TUM622 i CAF w macierzy zewnątrzkomórkowej

1. Przygotować zawiesiny komórkowe TUM622 i CAF zgodnie z sekcją 2.
2. Policz gęstość komórek CAF, pobierając 10 μl zawiesiny komórek i mieszając ją z 10 μl błękitu trypanowego.
3. Dodać 10 μl mieszaniny do każdej z dwóch komór na hememytometrze, aby policzyć i obliczyć gęstość komórek.
   nuta: CAF mają nieregularne kształty i mogą nie być dokładnie zliczane na automatycznym liczniku komórek.
4. Współosadzanie komórek TUM622 i CAF w macierzy błony podstawnej
   1. Na podstawie informacji o gęstości komórek oblicz żądaną liczbę komórek używanych do powlekania. CAF są wysiewane w stosunku 2:1 komórek TUM622. Na przykład dla 30 000 wysianych komórek TUM622 60 000 CAF jest osadzonych.
   2. Przenieś odpowiednią objętość TUM622 oraz zawiesinę komórek CAFs do tej samej probówki wirówkowej i postępuj zgodnie z krokami 2.5-2.11 w celu posiewu na płytki 24-dołkowe. W celu immunofluorescencji przenieś 60 μl mieszaniny TUM622/CAFs do szkiełek komorowych, jak opisano w kroku 2.12).
5. Hodowla TUM622 z nałożonymi CAF w macierzy błony podstawnej (patrz tabela materiałów)
   1. Skonfiguruj monokulturę TUM622 zgodnie z krokami 2.5-2.13.
   2. Przenieś dwukrotność liczby zawiesiny CAF (w porównaniu z liczbą wysianych komórek TUM622) do probówki wirówkowej i wiruj przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
   3. Odessać supernatant i ponownie zawiesić CAF w 1 ml pożywki hodowlanej 3D.
   4. Przenieś 1 ml zawiesiny CAFs do studzienki zawierającej osadzone komórki TUM622.