Transdukcja retrowirusowa receptorów limfocytów T w mysich komórkach T

1. Przygotuj konstrukt retrowirusowy

1. Subklonuj gen receptora komórek T (TCR) będący przedmiotem zainteresowania do wektora retrowirusowego (Figura 1, przykładowe wektory pMSG⁷, pMIGII^5,8, pMXs z Cellbiolabs). Gen łańcucha α i β TCR powinien znajdować się na tym samym wektorze pod kontrolą tego samego promotora, aby zapewnić równą ekspresję. Jeśli interesującym nas TCR jest człowiek, domeny stałe człowieka muszą zostać zastąpione domenami stałymi myszy⁹. Z naszych obserwacji wynika, że pełnowymiarowe ludzkie TCR nie ulegają stabilnej ekspresji na mysich limfocytach T.
2. Przygotuj wysokiej jakości plazmidowe DNA za pomocą zestawu Qiagen Maxi Prep Kit lub podobnego produktu. Stężenie plazmidu powinno wynosić około 1 μg/μl.

2. Transfekcja i izolacja limfocytów T

Dzień -1 (Komórki do pakowania płyt)

1. Usunąć retrowirusowe komórki pakujące Platinum-E (Plat-E, Cellbiolabs) za pomocą trypsyny-EDTA i zneutralizować za pomocą pożywki DMEM.
2. Odwirować komórki przy 1000 x g przez 5 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w pożywce DMEM.
3. Określ liczbę komórek i rozcieńcz komórki w temperaturze 0,6x10⁶/ml. Umieścić 10 ml zawiesiny komórkowej na 10-milimetrowej płytce do hodowli tkankowej pokrytej polilizyną i hodować przez noc w inkubatorze komórkowym w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ .

Dzień 0 (Transfekcja)

4. Następnego ranka zbadaj komórki pod mikroskopem świetlnym. Komórki powinny być w około 80% zlewające się.
5. Delikatnie wyjmij nośnik z płyty. Umyj komórki raz 1x PBS i dodaj 10 ml wstępnie podgrzanej, świeżej pożywki DMEM bez penicyliny-streptomycyny (Pen/Strep).
   (Uwaga: pióro/paciorkowiec może zakłócać transfekcję)
6. Przygotuj kompleks transfekcyjny.
   
   Przygotuj mieszankę A i B w następujący sposób:
   
   Mieszanka A: DNA plazmidu 9 μg Plazmid pomocniczy pCL-Eco 6,3 μg OptiMEM 1,5 ml   Mieszanka B: Lipopfectime 2000 60 μL OptiMEM 1,5 ml
   Inkubować A i B oddzielnie przez 5 minut w temperaturze pokojowej
   
   Delikatnie wymieszaj A i B i inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej, aby utworzyć kompleks transfekcyjny.
7. Powoli wlej mieszaninę (łącznie 3 ml) do komórek Plat-E. Delikatnie kołysz płytką w przód iw tył, aby równomiernie rozprowadzić mieszaninę transfekcji.
8. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C/5% CO₂ w inkubatorze komórkowym.
9. Po 6-8 godzinach zastąp pożywkę 10 ml świeżej pożywki DMEM (z Pen/Strep) do produkcji wirusa.

Płytka pokryta przeciwciałami

10. Mysie limfocyty T muszą zostać aktywowane przed transdukcją wirusa. Istnieje wiele sposobów aktywacji limfocytów T. Tutaj używamy przeciwciał anty-CD3e i anty-CD28 związanych z płytką. Przygotować mieszaninę przeciwciał składającą się z 1 μg/ml anty-CD3e i 2 μg/ml anty-CD28 w sterylnym PBS.
11. Dozować 250 μl mieszaniny przeciwciał do każdego dołka 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Płytka może być powlekana przez noc w temperaturze 4 °C lub 2 godziny w temperaturze 37 °C.

Przygotowanie jednokomórkowej zawiesiny ze śledziony myszy

12. Zbierz śledzionę myszy i przenieś na pożywkę RPMI.
13. Umieść śledzionę w sitku do komórek. Rozgnieć śledzionę tłokiem strzykawki na 5 cm płytce do hodowli tkankowej. Wypłucz komórki z sitka komórkowego sterylnym PBS.
14. Wirówka 1000 xg, 5 min.
15. Odrzucić supernatant. Zawiesić osad komórkowy w buforze lizującym ACK (2 ml na śledzionę). Inkubować 2 do 3 minut w temperaturze pokojowej. Dodaj pożywkę RPMI do 20 ml i odwiruj 1000 xg przez 5 minut.
16. Odrzucić supernatant. Zawiesić osad komórkowy w sterylnym PBS. Określić liczbę komórek i odwirować 1000 xg przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Przystąpić do izolacji limfocytu T.

Izolacja i aktywacja mysich limfocytów T

17. Oznacz ogniwa magnetycznie zgodnie z instrukcją produktu (zestaw do izolacji limfocytów T CD8+ firmy Miltenyi Biotec).
18. Umieść kolumnę LS (Miltenyi Biotec) w polu magnetycznym. Zastosuj zawiesinę komórki z etykietą na kolumnie. Zbierz przepływowe (wzbogacone mysie limfocyty T CD8 +). Przemyć kolumnę trzykrotnie 3 ml buforu zgodnie z instrukcją produktu i połączyć z poprzednim przepływem.
19. Wybarwić komórki przeciwciałami anty-CD3e i anty-CD8a i przeanalizować za pomocą cytometrii przepływowej (ryc. 2a). W przypadku typowej separacji można wyizolować ~8-10% wszystkich komórek. ~90% izolowanych komórek to limfocyty T CD8+.
20. Odwirować komórki w temperaturze 1000 xg, 5 min. Odrzucić supernatant. Zawiesić osad komórkowy w podłożu RPMI z rekombinowaną ludzką IL-2 (rhIL2, 20 ng / ml) w 1x10⁶ / ml.
21. Tuż przed dodaniem komórek należy usunąć roztwór przeciwciała z płytki (przygotowany wcześniej w ppkt 2.11). Przepłukać każdą studzienkę sterylnym PBS i usunąć PBS.
22. Dodać 1 ml zawiesiny komórkowej do każdej studzienki. Umieścić płytkę w temperaturze 37°C/5% CO₂ w inkubatorze komórkowym.

3. (Dzień 2 i Dzień 3) Zakażenie aktywowanych limfocytów T

1. Po 2 dniach produkcji wirusa pożywka w płytce komórkowej Plat-E powinna zmienić kolor na żółty. Przenieść supernatant wirusa do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Dodaj 10 ml świeżej pożywki DMEM do płytki w celu dalszej produkcji wirusa (opcjonalnie).
2. Odwirować supernatant wirusa przy 1000 xg przez 5 minut w celu usunięcia resztek komórek. Ostrożnie przenieść supernatant wirusa do nowej probówki. Pozostaw trochę płynu na dnie probówki i nie naruszaj resztek komórek.
3. Zebrać aktywowane limfocyty T z płytki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Określ numer komórki. Zapisz kilka komórek w osobnej probówce, aby użyć ich jako negatywnej (nietransdukowanej) kontroli. Wirować przy 1000 xg przez 5 minut i odrzucić supernatant.
4. Zawiesić osad komórkowy w supernatancie wirusa w stężeniu^10-6 komórek na 1 ml z 20 ng/ml rhIL2 i 10 μg/ml siarczanu protaminy. Dodać 1 ml zawiesiny komórkowej do każdego dołka na płytce 24-dołkowej. Ponownie zawiesić komórki w probówce kontrolnej w pożywce RPMI o tej samej gęstości komórek z tą samą ilością rhIL2 i siarczanu protaminy. Dodaj komórki na tej samej płytce.
5. Owiń talerz folią z tworzywa sztucznego. Wirować przez 90 minut w temperaturze 2000 xg, w temperaturze 32 °C bez hamulca.
6. Po odwirowaniu usuń folię z tworzywa sztucznego. Dodać 1 ml świeżej pożywki RPMI z 20 ng/ml rhIL2 do każdej studzienki. Włóż płytkę z powrotem do inkubatora.
7. (Opcjonalnie) Wyższy poziom ekspresji TCR można osiągnąć poprzez pobranie supernatantu wirusa i powtórzenie procedury infekcji w dniu 3.

4. Rozbudowa komórek i ocena efektywności transdukcji

1. Codziennie badaj transdukowane limfocyty T. W razie potrzeby podziel komórki w proporcjach 1:3 w pożywce RPMI rhIL2. Nie pozwól, aby komórki przerosły (podłoże zmienia kolor na żółty).
2. W dniu 6 lub 7 wybarwić komórki przeciwciałem i tetramerem MHC specyficznym dla TCR, aby ocenić ekspresję TCR na powierzchni komórek T. Użyj nietransdukowanych limfocytów T jako kontroli (ryc. 2c).
3. Transdukowane limfocyty T są gotowe do dalszych zastosowań.

5. Reprezentatywne wyniki

Często korzystne jest oczyszczanie podzbiorów limfocytów T przed transdukcją, chociaż splenocyty mogą być transdukowane bez oczyszczania. Podzbiory limfocytów T o wysokiej czystości można uzyskać za pomocą komercyjnych kulek magnetycznych (ryc. 2a).

Aby ocenić poziom ekspresji TCR na limfocytach T, można użyć przeciwciał specyficznych dla łańcuchów TCR alfa lub beta. Zazwyczaj od 30% do 80% komórek może wyrażać transdukowany TCR (Figura 2b) w zależności od genów TCR i miana wirusa. Tetramer MHC specyficzny dla TCR może być również używany do dalszej weryfikacji funkcjonalnej ekspresji TCR (Figura 2c).

Rysunek 1. Przykład konstruktu genu receptora limfocytów T sklonowanego do wektora retrowirusowego. Geny łańcuchowe alfa i beta o pełnej długości są połączone samorozszczepialnym łącznikiem peptydowym^{2A 8}.

Rysunek 2. Przykład udanej izolacji i transdukcji mysich limfocytów T. (a) Limfocyty T CD8 wyizolowano ze splenocytów przy użyciu zestawu do izolacji limfocytów T CD8a + (Miltenyi Biotec) i wybarwiono przeciwciałami anty-CD3e i anty-CD8a. Wyizolowane limfocyty T CD8 transdukowano peptydem R6C12 TCR specyficznym dla ludzkiego peptydu gp100:209 -217⁴ i barwiono przeciwciałem anty-ludzkim Vbeta 8 (b) i tetramerem HLA-A2kb gp100 (c).

Nie stwierdzono konfliktu interesów.