Test rozgałęzień glikogenu w celu zmierzenia stopnia rozgałęzienia glikogenu

1. Jakościowa ocena rozgałęzień glikogenu

1. Przygotować nasycony roztwór chlorku wapnia, dodając 74,5 g bezwodnego chlorku wapnia do ~40 ml wody i mieszając. Dodaj trochę więcej wody i kontynuuj mieszanie. Uzupełnić objętość do 100 ml wodą i kontynuować mieszanie, aż CaCl₂ całkowicie się rozpuści.
2. Przygotować zapas roboczy odczynnika barwnego jod/CaCl₂ przez zmieszanie 50 μl roztworu podstawowego KI/jodu z 13 ml nasyconego roztworu CaCl₂ w probówce o pojemności 15 ml. Dobrze wymieszać i przechowywać w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem. W tych warunkach roztwór jest stabilny przez co najmniej 1 tydzień.
3. Wyznaczanie rozgałęzień
   1. W probówce o pojemności 1,5 ml połącz 650 μl odczynnika barwiącego jod/CaCl₂ ze 100 μl wody i dokładnie wymieszaj. Przenieść roztwór do jednorazowej kuwety z metakrylanu.
      nuta: Roztwór w kuwecie powinien być przezroczysty i bladożółty
   .
   2. Umieść w spektrofotometrze i, pracując w trybie skanowania długości fali, zbierz widmo tła od 330 nm do 800 nm.
   3. W probówce o pojemności 1,5 ml połącz 650 μl roboczego odczynnika barwiącego jod/CaCl₂ z 50 μg glikogenu ostrygowego. Doprowadzić końcową objętość do 750 μl wodą i dokładnie wymieszać. Przenieść roztwór do jednorazowej kuwety z metakrylanu.
      nuta: Roztwór w kuwecie powinien być klarowny i mieć głęboki pomarańczowo-brązowy kolor.
4. Umieścić w spektrofotometrze i zebrać widmo absorpcyjne od 330 nm do 800 nm.
5. Powtórzyć kroki od 1.3.3 do 1.4 z 50 μg amylopektyny i 30 μg amylozy.
   nuta: Próbka amylopektyny powinna być żółto-zielona, a próbka amylozy powinna być zielono-niebieska. Obie próbki powinny być czyste. Powstałe barwne kompleksy są stabilne, bez zmian widma absorpcji, przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
6. Aby uzyskać wskazanie rozgałęzionej struktury niescharakteryzowanej próbki glikogenu, należy połączyć od 25 μg do 50 μg glikogenu z 650 μl roboczego odczynnika barwiącego jod/CaCl₂. Postępować jak powyżej, doprowadzając objętość do 750 μl wodą, dokładnie mieszając i przenosząc do kuwety z metakrylanu.
   nuta: Próbka glikogenu powinna mieć kolor od żółtego/pomarańczowego do pomarańczowego/brązowego, w zależności od stopnia rozgałęzienia (długości łańcuchów zewnętrznych) obecnego glikogenu. Ponownie, próbka powinna być czysta.
7. Zbierz widmo absorpcyjne.