Generowanie eksplantatu zwoju korzenia grzbietowego i zdysocjowanej hodowli komórkowej

1. Eksplantacyjna hodowla DRG od dorosłej myszy

1. Umieść zebrany DRG na szalce Petriego o średnicy 35 mm zawierającej 3 ml lodowatej pożywki bez surowicy (SFM).
2. Przenieś każdą pojedynczą DRG na suchą szklaną szalkę Petriego i pod mikroskopem chirurgicznym oczyść i odetnij nadmiar włókien i tkanki łącznej nadal przyczepionych do DRG za pomocą ostrza. DRG jest łatwo rozpoznawalny jako wybrzuszona, przezroczysta struktura wzdłuż białego nerwu rdzeniowego / korzenia. Naczynia krwionośne często znajdują się wokół DRG.
3. Umieść oczyszczony DRG na nowej szalce Petriego zawierającej lodowato zimne podłoże SFM.
4. Rozcieńczyć galaretowatą mieszaninę białek (patrz tabela materiałów) w lodowato zimnym SFM (1:1).
5. Umieść DRG ex vivo w 12-dołkowych płytkach wstępnie pokrytych 10/20 μl galaretowatej mieszaniny białek i umieść je w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 na 30-60 minut.
6. Delikatnie dodaj 1,5-2 ml SFM do systemu hodowlanego, aby pokryć cały eksplant i utrzymać eksplantaty w warunkach hodowli (37 °C i 5% CO2).
   nuta: Jest to krytyczny krok, ponieważ DRG jest zakotwiczony w szklanych naczyniach tylko przez spolimeryzowaną galaretowatą mieszaninę białek. Czas polimeryzacji i umiejętności pipetowania mają kluczowe znaczenie dla uniknięcia unoszenia się na wodzie.
7. Zmieniaj podłoże do uprawy DRG co 72 godziny i pozwól DRG rosnąć tak długo, jak to konieczne.

2. Izolowanie neuronów jednokomórkowych od DRG

1. Umieścić cały zebrany DRG w sterylnej probówce o pojemności 1,5 ml z 1,2 ml pożywki F12 zawierającej 1,25 mg/ml kolagenazy dożylnej i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 45 minut. Powtarzać ten krok przez kolejne 45 minut po pierwszej inkubacji.
2. Traktować eksplantaty 2 ml pożywki F12 zawierającej trypsynę (0,025%) przez 30 minut bezpośrednio po zabiegu kolagenazy dożylnej w temperaturze 37 °C i 5% CO2.
3. Inkubować z 2 ml pożywki F12 zawierającej płodową surowicę bydlęcą (FBS; 33%) w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 15 minut.
4. Umyj eksplantaty trzykrotnie 2 ml pożywki F12 i przystąp do mechanicznej dysocjacji za pomocą szklanej pipety, aż podłoże stanie się mętne.
   nuta: Procedura ta polega na pobraniu od zwierzęcia czystego/przyciętego DRG, jak wyjaśniono w poprzednim rozdziale. Podczas wykonywania mechanicznej dysocjacji eksplantatów należy zachować ostrożność i nie używać nadmiernej siły, ponieważ może to prowadzić do rozlania i utraty materiału roboczego.
5. Przefiltruj zdysocjowaną kulturę komórkową przez filtr 0,22 μm, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia i nadmiar tkanki łącznej. Odwirować przefiltrowany lizat komórkowy w temperaturze (2 500 x g) przez 2 minuty.
6. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 500 μl podłoża neurobazalnego zawierającego suplement do hodowli neuronów (1x), mieszaninę antybiotyków (1x), L-glutaminian (0,5 mM) i czynnik wzrostu nerwów (5 μg/ml) (patrz tabela materiałów).
7. Umieścić zdysocjowane komórki na szkiełkach pokrytych lamininą (50 μg/ml; patrz Tabela Materiałów) z preferowaną gęstością komórek. Określ gęstość komórek za pomocą licznika komórek.
   nuta: Posialiśmy ogniwa po 25 000 ogniw/szkiełko okładkowe. Technika ta pozwala na dysocjację zarówno neuronów, jak i komórek satelitarnych gleju. Komponent glejowy współhodowany z neuronami pseudounipolarnymi odgrywa kluczową rolę w przetrwaniu neuronów.