Wywoływanie penetrującego urazowego uszkodzenia mózgu u dorosłych much Drosophila

1. Penetrujące urazowe uszkodzenie mózgu (PTBI; Rysunek 1)

1. Sortuj nowo zamknięte muchy F1. Młode samce należy wybierać w ciągu 6 godzin po eklozji. Umieść te samce w czystych fiolkach zawierających pokarm, z 40 lub mniej muchami w każdej fiolce.
   UWAGA: Najłatwiej to osiągnąć w godzinach porannych, znieczulając muchy na CO₂ i identyfikując dorosłe samce, które nadal mają smółkę (widoczną jako ciemnozielonkawa plama przez ścianę brzucha) w swoich wnętrznościach.
2. Odkażaj szpilki Minutien (patrz Tabela materiałów) przez co najmniej 5 minut, umieszczając ~100 szpilek w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml wypełnionej 70% etanolem.
3. Zdezynfekuj podkładkę CO₂ i pędzel, rozpylając 70% etanolu i wytrzyj do sucha czystą, niestrzępiącą się chusteczką. Gdy narzędzia są czyste i suche, przenieś 40 lub mniej posortowanych samców F1 z powrotem na czystą podkładkę.
4. Podziel samce F1 na 2 grupy na podkładce muchowej. Jedna grupa będzie służyć jako kontrola, nieranne muchy. Druga grupa eksperymentalna zostanie poddana PTBI.
5. Za pomocą kleszczy wyciągnij 4-5 nowych kołków Minutien z probówki mikrowirówki i umieść je w pobliżu krawędzi podkładki CO₂. Pod lunetą sekcyjną wybierz prostą szpilkę Minutien z ostrym końcem.
   UWAGA: Użycie pojedynczej pinezki Minutien w eksperymencie zmniejszy zmienność. Ponownie użyj ostrych szpilek. Umieść uszkodzone lub tępe kołki w osobnej probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 70% etanolu w celu bezpiecznej utylizacji.
6. W przypadku pracy z muchami ze standardowego krzyża należy włączyć lampę z diodą elektroluminescencyjną (LED) mikroskopu stereoskopowego wyposażoną w odpowiednie filtry wzbudzenia i emisji białka zielonej fluorescencji (GFP). Pozwala to na wzbudzenie przy 440-460 nM i umożliwia wizualizację 500-560 nM.
   UWAGA: Dzięki tej lampie i zestawowi filtrów, ciała komórkowe ciała grzyba będą fluoryzować na zielono przez naskórek głowy (Rysunek 1C). Dla much perma-twin lub much o innych genotypach, standardowy oświetlacz światła białego do mikroskopu stereoskopowego może być użyty do wizualizacji punktów orientacyjnych na naskórku głowy w celu ukierunkowania urazu ciała grzyba (Rysunek 1C).
7. Za pomocą kleszczy podnieś i przytrzymaj wybraną przypinkę Minutien w jednej ręce (dla osób praworęcznych jest to zwykle prawa ręka), a pędzel w drugiej (zwykle lewej) ręce. Wybierz muchę z grupy eksperymentalnej i ustaw muchę tak, aby mieć widok grzbietowy torebki głowy z głową muchy po prawej stronie. Umieść szczoteczkę na przedniej stronie grzbietowej klatki piersiowej i delikatnie dociśnij, aby ustabilizować muchę.
8. Wyceluj końcówką szpilki Minutien w korpusy komórkowe ciała grzyba po prawej stronie głowy i przebij torebkę głowy. Jeśli używasz punktów orientacyjnych, celuj w naskórek głowy grzbietowej między oczkami a grzbietową krawędzią oka (Rysunek 1).
9. Po zakończeniu urazu za pomocą pędzla delikatnie odepchnij głowę od szpilki Minutien.
10. Jeśli używasz mózgu do RNA-Seq lub qRT-PCR, wykonaj drugi uraz po lewej stronie głowy.
11. Powtórz kroki 2.8-2.10, aby zranić wszystkie muchy w grupie eksperymentalnej.
12. Gdy wszystkie muchy zostaną zranione, umieść kontrolę i zranione muchy w oznakowanych, oddzielnych fiolkach zawierających pokarm. Połóż fiolki poziomo (tj. na bokach), podczas gdy muszki dochodzą do siebie po znieczuleniu i podczas późniejszego leżakowania, aby zapobiec złapaniu much w pokarm.
13. Standardowe muchy krzyżowe należy umieszczać w temperaturze 25 °C, a muchy perma-twin w temperaturze 30 °C, aby się zestarzały.
14. W przypadku much w wieku dłuższym niż 24 godziny należy umieszczać je na czystym pokarmie co 1-2 dni.

Rycina 1: Penetrujące urazowe uszkodzenie mózgu (PTBI) do dorosłego dorosłego rdzenia centralnego Drosophila. (A) Schemat zewnętrznej części głowy dorosłego muchy. To jest widok z przodu. Tak więc prawa strona zwierzęcia znajduje się po lewej stronie widza. (B) Schemat wnętrza głowy dorosłego osobnika Drosophila z trajektorią uszkodzenia zaznaczoną kolorem szarym. To jest widok a posteriori. Tak więc na tym obrazie i na kolejnych rysunkach prawa strona mózgu znajduje się po prawej stronie. Centralny mózg PTBI wpływa na wiele struktur mózgu, w tym ciało grzyba (zielony) i tkanki poza mózgiem, w tym ciało tłuszczowe (niebieskie) i hemocyty (czerwone). CB = centralny obszar mózgu. OL = obszar płata nerwu wzrokowego. (C) Widok grzbietowy żywej dorosłej głowy, w której ciała grzybów (groty strzał) są znakowane zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP). Jest to "genotyp standardowy" (szczegóły w tekście). Protokół PTBI w sposób powtarzalny powoduje uszkodzenie ciał grzybów.