Przygotowanie rusztowań fibrynowych 3D do zastosowań w hodowlach komórek macierzystych

Uwagi przed rozpoczęciem protokołu: Fibrynogen jest białkiem pochodzącym z krwi, dlatego przed jego użyciem należy ukończyć odpowiednie szkolenie bezpieczeństwa. Ten protokół wymaga 2 dni na ukończenie, więc odpowiednio dopasuj czas pożądanych kultur łodyg, aby były gotowe do siewu. Jeśli chodzi o obliczenie, ile fibrynogenu należy odważyć, trzy 35-milimetrowe szalki Petriego z buforowaną solą fizjologiczną tris (TBS, pH 7,4) zawierające 110-130 mg fibrynogenu rozpuszczonego w 3 ml TBS wystarczą do wytworzenia 1 24-dołkowej płytki zawierającej 400 μl rusztowań fibrynowych w każdym dołku.

1. Dzień pierwszy: Przygotowanie roztworów fibrynogenu i nocna dializa

1. Wyjmij liofilizowany fibrynogen z lodówki i pozostaw na 20 minut, aby osiągnął temperaturę pokojową.
2. Dodaj 3 ml buforowanej soli fizjologicznej Tris (TBS) do każdej szalki Petriego o średnicy 35 mm. Każda płytka fibrynogenu daje od 2 do 3 ml roztworu fibrynogenu o stężeniu od 12 do 20 mg / ml, a całkowitą ilość potrzebnego fibrynogenu można obliczyć na podstawie tych przybliżeń.
3. Odważyć około 100-130 mg fibrynogenu (Fg) i rozsypać na powierzchni TBS znajdującego się w każdym naczyniu. Odczekaj 5 minut, aż fibrynogen zacznie przechodzić do roztworu. Przykryj szalkę Petriego pokrywką.
4. Inkubować szalki Petriego w temperaturze 37°C przez 2 godziny, aby fibrynogen mógł w pełni wejść do roztworu TBS.
5. Rurka do dializy na mokro (odcięta 7000 MW) z TBS. Złóż dolny koniec rurki i zamknij koniec rurki za pomocą zacisku do dializy.
6. Odpipetować roztwory fibrynogenu z szalek do rurki do dializy. Złóż górny koniec i zamknij za pomocą zacisku do dializy.
7. Umieścić rurkę dializacyjną zawierającą roztwór fibrynogenu w 4-litrowym pojemniku TBS. Wymieszać roztwór za pomocą płytki mieszającej ustawionej na niską prędkość (100 obr./min).
8. Dializuj roztwór przez noc na mieszance przez co najmniej 12 godzin. W tym czasie rozwiązanie TBS nie musi być zmieniane.

2. Dzień 2: Polimeryzacja rusztowań fibrynowych i wysiewanie komórek macierzystych na rusztowania

Wszystkie kroki opisane dla tego procesu powinny być wykonywane w sterylnym kapturze do hodowli tkankowych, ponieważ te rusztowania będą obsiane kulturami komórek macierzystych.

1. Usunąć roztwór fibrynogenu z rurki dializacyjnej i umieścić w stożkowej probówce o odpowiedniej wielkości (15 ml lub 50 ml).
2. Przefiltruj roztwór fibrynogenu za pomocą filtra strzykawkowego 5,0 μm, aby usunąć duże zanieczyszczenia z roztworu. W zależności od objętości roztworu, do przetworzenia całego roztworu może być konieczne użycie wielu filtrów.
3. Sterylny roztwór fibrynogenu przefiltrować filtrem 0,22 μm do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Używając pipety o odpowiednim rozmiarze, określ objętość przefiltrowanego roztworu fibrynogenu do późniejszego wykorzystania podczas wykonywania obliczeń. W zależności od objętości roztworu, do przetworzenia całego roztworu może być konieczne użycie wielu filtrów.
4. Zmierzyć absorbancję roztworu fibrynogenu przy długości fali 280 nm za pomocą spektrofotometru. Współczynnik rozcieńczenia 50 jest często konieczny do uzyskania absorbancji poniżej 1.
5. Obliczyć stężenie białka obecnego w roztworze fibrynogenu, stosując następujące równanie: [Fibrynogen w mg/ml] = (Współczynnik rozcieńczenia A₂₈₀ ×) ÷ 1,55, gdzie 1,55 jest współczynnikiem ekstynkcji przy A₂₈₀ dla ludzkiego fibrynogenu ¹³. Następnie obliczyć ilość TBS potrzebną do rozcieńczenia stężenia roztworu do 11,1 mg/ml fibrynogenu w oparciu o początkową objętość. Końcowe stężenie białka w rusztowaniach fibrynowych po polimeryzacji wyniesie 10 mg/ml.
6. Otrzymać sterylne roztwory trombiny i chlorku wapnia. Najpierw dodaj 15 μl roztworu trombiny (stężenie: 40 U/ml - końcowe stężenie w rusztowaniu wyniesie 2 U/ml) po prawej stronie każdej studzienki w pierwszym rzędzie płytki 24-dołkowej. Następnie dodaj 15 μl 50 mM roztworu chlorku wapnia po lewej stronie każdej studzienki. Na koniec dodaj 270 μl roztworu fibrynogenu do płytki. Potrząśnij płytką z boku na bok, a następnie potrząśnij tyłem do przodu, aby zapewnić wymieszanie roztworów.
7. Pozwól rządowi zawierającemu mieszaniny polimeryzować przez 5 minut w temperaturze pokojowej. W miarę polimeryzacji rusztowania stają się bardziej nieprzezroczyste.
8. Powtarzaj kroki 2.6 i 2.7, aż do polimeryzacji żądanej liczby rusztowań fibrynowych.
9. Po ostatniej 5-minutowej inkubacji umieść płytki w inkubatorze o temperaturze 37°C, aby umożliwić pełną polimeryzację rusztowań.
10. Po zakończeniu godzinnej inkubacji następnym krokiem jest obsianie rusztowania ciałami embrionalnymi. Za pomocą pipety o pojemności 20 μl wybierz pojedynczy korpus zarodka i umieść go na środku rusztowania fibrynowego. Sprawdź pod mikroskopem, czy każda studzienka zawiera pojedyncze ciało zarodkowe.
11. Dodać 5 μl roztworu trombiny (stężenie: 40 U/ml) i 5 μl 50 ml 50 mM roztworu chlorku wapnia na wierzch każdego ciała zarodka, a następnie 90 μl roztworu fibrynogenu do każdej studzienki. Roztwór powinien tworzyć pęcherzyk otaczający ciała zarodkowe.
12. Umieść płytkę z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37°C na dodatkową godzinę, aby zapewnić polimeryzację.
13. Po inkubacji dodać 1 ml odpowiedniej pożywki do hodowli komórkowych do każdego dołka i umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37°C.

3. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 1 pokazuje schemat widoku z boku indywidualnej studni zawierającej system hodowli rusztowań fibrynowych 3D z ciałem zarodka. Rycina 2A przedstawia reprezentatywne obrazy indukowanych przez myszy pluripotencjalnych komórek macierzystych hodowanych na warstwach żywiących mysie embrionalne fibroblasty. Komórki te są następnie indukowane do tworzenia ciał embrionalnych, agregatów komórek zawierających progenitory nerwowe, przy użyciu 8-dniowego protokołu leczenia kwasem retinowym (Figura 2B), jak opisano wcześniej ¹⁴, podczas gdy Rysunek 3 pokazuje pojawienie się ciała zarodka pochodzącego z iPS po 3 dniach hodowli w rusztowaniach fibrynowych 3D. Podobne wyniki uzyskano już wcześniej przy użyciu embrionalnych komórek macierzystych ^{myszy 7}. Ponadto metoda ta została wykorzystana do hodowli ciał zarodkowych pochodzących z iPS wytworzonych przy użyciu innego protokołu obejmującego kwas retinowy i purmorfaminę ¹⁵ wewnątrz rusztowań fibrynowych 3D, demonstrując wszechstronność tego systemu hodowli.

Rysunek 1. Schemat przedstawiający widok z boku pojedynczej studni zawierającej rusztowanie 3D fibrynowe obsiane ciałem zarodka.

Rysunek 2. Hodowla i różnicowanie pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS) indukowanych przez myszy. Aby zróżnicować te komórki w fenotypy neuronalne, komórki iPS są hodowane w zawiesinie w celu wytworzenia agregatów komórek zwanych ciałami embrionoidalnymi (EB). Te EB są następnie traktowane kwasem retinowym w celu wywołania różnicowania neuronalnego, a protokół ten był wcześniej stosowany do indukowania różnicowania neuronalnego embrionalnych komórek macierzystych. A) Niezróżnicowana kolonia mysich komórek iPS hodowana na warstwie żywiciela fibroblastów embrionalnych myszy. B) Ciała zarodkowe pochodzące z mysich komórek iPS w hodowli zawiesinowej pobranej w 8 dniu po leczeniu kwasem retinowym w celu wywołania różnicowania neuronalnego. Podziałka wynosi 100 μm.

Rysunek 3. Przykładowe wyniki ciała zarodka iPS myszy po 3 dniach hodowli w rusztowaniu 3D fibryny. Komórki zaczęły migrować i różnicować się wewnątrz rusztowania fibrynowego. Podziałka wynosi 500 μm.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.