Metody in vitro Hodowla organoidowa pierwotnych guzów jelita grubego myszy

Komórki nabłonka jelitowego namnażają się i przewracają w niezwykłym tempie, wyprzedzając wszystkie inne tkanki w ciele kręgowców ^2,3. Dzielące się komórki, w tym jelitowe komórki macierzyste (ISC) i komórki amplifikujące tranzyt, różnicują się w komórki wydzielnicze (kubkowe, Paneth i enteroendokrynne) lub enterocyty ³. ISC znajduje się u podstawy krypty. Komórki Panetha schodzą na dno krypt i są długowieczne, podczas gdy inne linie migrują w górę do kosmków ^3,4. W tym przypadku komórki są wystawione na działanie treści jelitowej, w tym mikrobioty, i są wydalane z końcówek kosmków w wyniku mechanizmu apoptotycznego wywołanego przez anoikis. Chociaż w okrężnicy brakuje kosmków i komórek Panetha, mechanizm utrzymania homeostazy jest podobny ⁴.

Szlak sygnałowy Wnt został uznany za odgrywający kluczową rolę w proliferacji jelit i utrzymaniu ISC ⁴. Delecja czynnika transkrypcyjnego TCF4, efektora dalszej sygnalizacji Wnt, prowadzi do utraty jelitowych komórek macierzystych, a następnie rozpadu tkanki ⁵. Podobnie, transgeniczna ekspresja inhibitora Wnt DKK1 zmniejsza proliferację nabłonka i wyczerpuje linie komórek wydzielniczych ⁶. I odwrotnie, nadekspresja agonisty Wnt R-spondyny-1 indukuje silną i szybką proliferację komórek krypty jelitowej ⁷.

Biorąc pod uwagę znaczenie sygnalizacji Wnt dla homeostazy jelit, mutacje szlaku Wnt są często obserwowane w raku jelita grubego ⁸. Rak jelita grubego jest trzecią najczęstszą przyczyną zgonów z powodu raka w Stanach Zjednoczonych ⁹. Nadmierne spożycie czerwonego mięsa i alkoholu, zmniejszona aktywność fizyczna oraz mutacje dziedziczne i somatyczne są uważane za czynniki ryzyka raka jelita grubego ^10,11. Gen gruczolakowatej polipowatości jelita grubego (Apc), kluczowy czynnik sygnalizacyjny Wnt, jest zmutowany u większości pacjentów z rodzinnym, sporadycznym i związanym z zapaleniem jelita grubego rakiem jelita grubego ^12,13. W raku jelita grubego obserwuje się również mutacje innych czynników zaangażowanych w szlak sygnałowy Wnt, w tym Axin2 i β-kateniny ^14,15. Jednak nadal brakuje dokładnego mechanizmu i skutecznej terapii raka jelita grubego. Aby ułatwić badanie mechanizmów molekularnych raka jelita grubego, ustalono linie komórkowe ludzkiego raka jelita grubego reprezentujące różne etapy progresji raka od łagodnego do agresywnego typu komórek ^16-18. Dostępne są również linie komórkowe raka jelita grubego myszy o różnych właściwościach przerzutowych ^19,20. Niemniej jednak komórki pierwotne lub hodowle organoidów są preferowane w stosunku do przekształconych linii komórkowych, ponieważ ściśle naśladują stan in vivo i generują bardziej istotne fizjologicznie dane ²¹. Większość linii komórkowych pochodzących z raka jelita grubego rośnie jako monowarstwa przyczepiona do płytki lub jako zawiesiny komórek, pozbawione orientacji wierzchołkowo-podstawno-bocznej i ścisłych połączeń między komórkami. Również normalne i nowotworowe komórki nabłonka jelitowego in vivo przechodzą spontaniczną formę apoptozy zwaną anoikis, gdy zróżnicowane komórki docierają do końców kosmków i są zrzucane ²². Cechy te są trudne do odtworzenia w liniach komórkowych, ale są ważne w procesie rozwoju raka jelita grubego ²³. Cechy te są zachowane w organoidach pierwotnych. Ponadto hodowle organoidów nowotworowych zapewniają skuteczny system oceny autonomicznych funkcji genów nowotworu w porównaniu z badaniami in vivo. Manipulacja genetyczna jelita in vivo jest czasochłonnym procesem, głównie poprzez tworzenie myszy transgenicznych i/lub nokautowych przy użyciu sterowników specyficznych dla jelit. Jednak organoidy nowotworowe są łatwo podatne na manipulacje genetyczne za pośrednictwem wirusa, a zatem są doskonałym narzędziem do oceny precyzyjnych mechanizmów molekularnych. Wykazano, że pierwotne hodowle organoidów guzów jelitowych są wykonalną i skuteczną techniką. Pierwotna hodowla komórek jelitowych może stworzyć funkcjonalne organoidy jelitowe o strukturze krypty kosmków in vitro z pojedynczej dorosłej komórki macierzystej Lgr5 + ²⁴. Organoidy te można przeszczepić i wszczepić w uszkodzoną tkankę okrężnicy w celu regeneracji ²⁵. Dalsza adaptacja warunków hodowli umożliwiła uzyskanie podobnych organoidów nabłonkowych z okrężnicy myszy oraz ludzkiego jelita cienkiego i okrężnicy ¹. W przypadku pierwotnej normalnej hodowli nabłonka jelita grubego niezbędne jest podstawowe podłoże hodowlane, a także czynniki wzrostu, w tym EGF, Noggin, R-spondyna i Wnt3a, podczas gdy podstawowa pożywka hodowlana i EGF są wystarczające do wzrostu pierwotnych organoidów guza okrężnicy ^{myszy 1}. Tutaj opisujemy szczegółowy protokół izolacji, hodowli i generowania organoidów guza jelita grubego.

1. Izolacja guza jelita grubego i dysocjacja komórek

1. Guzy jelit można wyizolować z dowolnego sporadycznego lub indukowanego leczeniem modelu raka jelita grubego. Myszy powinny zostać poddane eutanazji za pomocą CO₂ . Okrężnice są następnie zbierane, przepłukiwane zimną solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i otwierane wzdłużnie. Zidentyfikuj obszary zawierające guzy za pomocą mikroskopu stereoskopowego, wypreparuj nożyczkami i umyj zimnym PBS.
2. Fragmenty jelit zawierające guzy inkubować w buforze chelatacyjnym EDTA (2 mM EDTA, 5,6 mmol/L Na₂HPO₄, 8,0 mmol/L KH₂PO₄, 96,2 mmol/L NaCl, 1,6 mmol/L KCl, 43,4 mmol/L sacharozy, 54,9 mmol/L D-sorbitol, 0,5 mmol/L DL-ditiotreitol w wodzie destylowanej) przez 60 minut na lodzie.
3. Po chelatacji większość normalnych komórek nabłonka jelitowego zostanie odłączona, podczas gdy komórki nowotworowe pozostaną przyczepione do mezenchymy. Odessać bufor chelatacyjny zawierający normalne komórki nabłonka i jeszcze raz przemyć resztki guza 5 ml zimnego buforu chelatacyjnego.
4. Odessać bufor chelatacyjny, przemyć fragmenty guza 5 ml zimnego 1x PBS.
5. Odessać 1x PBS, inkubować fragmenty guza w buforze trawiennym (2,5% płodowej surowicy bydlęcej, 1 jednostka/ml penicyliny, 1 μg/ml streptomycyny i 2,5 ng/ml amfoterycyny B, 200 U/ml kolagenazy typu IV, 125 μg/ml dypazy typu II w zmodyfikowanym pożywce Dulbecco's Eagle Medium) przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.
6. Pozwól fragmentowi guza osiąść pod normalną grawitacją przez 1 minutę i zbierz supernatant do 15 ml probówki sokoła. Zawiesinę zawiesiny jednokomórkowej zawiesiny guza osadzać przez odwirowanie przy 200 x g przez 3 minuty i przemyć raz 5 ml PBS, odwirowując przy 200 x g przez 3 minuty.

2. Posiew guza jelita

1. Ponownie zawiesić osad komórek nowotworowych za pomocą 500 μl PBS, policzyć izolowane pojedyncze komórki nowotworowe za pomocą hemocytometru.
2. Osadzać komórki nowotworowe przez wirowanie przy 200 x g przez 3 minuty i ponownie zawiesić je w 5 mg/ml Matrigel na lodzie i płytce na 24-dołkowych płytkach w ilości 15 000 komórek na 50 μl Matrigel na dołek.
3. Pozostawić Matrigel do polimeryzacji przez 15 minut w temperaturze 37 °C i dodać 500 μl/studzienkę podstawowej pożywki hodowlanej (1 jednostka/ml penicyliny, 1 μg/ml streptomycyny i 2,5 ng/ml amfoterycyny B, 10 mmol/L HEPES, 2mM Glutamax, 1x suplement N2, 1x suplement B27, 1 mmol/L N-acetylocysteiny w Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/F12) zawierających 50 ng/ml mysiego EGF.

3. Utrzymanie ustalonych organoidów

1. Zmieniaj podstawową pożywkę hodowlaną zawierającą EGF co 2 dni i pasaż organoidów 1:5 raz w tygodniu.
2. W celu pasażowania zastąp pożywkę hodowlaną świeżą podstawową pożywką hodowlaną. Mechanicznie rozbić organoidy i Matrigel za pomocą pipety P1000 z odciętymi końcówkami i przenieść do probówki Falcon o pojemności 15 ml. Dalsza dysocjacja mechaniczna odbywa się za pomocą polerowanej ogniowo pipety Pasteura.
3. Przemyć zdysocjowane organoidy 5 ml podstawowej pożywki hodowlanej i odwirować przy 200 x g przez 2 min.
4. Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad za pomocą Matrigel i dodać pożywkę hodowlaną, jak opisano powyżej.

4. Przechowywanie i odzyskiwanie ustalonych organoidów

1. W przypadku długotrwałego przechowywania organoidy należy zamrozić w płynie_N2, które są stabilne przez co najmniej 2 lata. W celu zamrożenia organoidów należy rozbić za pomocą pipety P1000 z odciętymi końcówkami i przenieść do probówki sokoła o pojemności 15 ml.
2. Przemyć zdysocjowane organoidy 5 ml podstawowej pożywki hodowlanej i odwirować przy 200 x g przez 2 min.
3. Wyrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad za pomocą zmodyfikowanego podłoża Dulbecco Eagle Medium (DMEM) zawierającego 20% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 10% dimetylosulfotlenku (DMSO).
4. Przenieś komórki do krioprobówek o pojemności 1,5 ml, a następnie umieść probówki w pojemniku do zamrażania Nalgene Mr. Frosty i przechowuj w zamrażarce o temperaturze -80 °C, aby osiągnąć szybkość chłodzenia -1 °C/min. Po całonocnej inkubacji przenieść probówki do cieczy_N2.
5. W celu odzysku, zamrożone organoidy są szybko rozmrażane w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, przemywane podstawową pożywką hodowlaną, odwirowywane, ponownie zawieszane w Matrigel i hodowane w warunkach opisanych powyżej.

5. Ekstrakcja RNA, ekstrakcja białek i immunohistochemia

1. Ekstrakcja RNA: Komórki są zbierane w sposób opisany powyżej w celu przejścia. RNA jest izolowane za pomocą zestawu do izolacji RNA PicoPure^TM zgodnie z instrukcjami producenta.
2. Ekstrakcja białka: Osady komórkowe zbiera się w sposób opisany powyżej i poddaje lizie w 100 μl buforu do testów radioimmunoprecypitacyjnych (RIPA; 50 mmol/L Tris-HCl pH 7,5, 150 mmol/L NaCl, 2 mmol/L EDTA, 1% NP-40, 0,1% SDS) z 1x inhibitorem proteazy.
3. Immunohistochemia: Odessać pożywkę do hodowli komórkowych, przenieść organoidy nowotworowe za pomocą pipety P1000 z końcówkami odciętymi do krioformy i natychmiast zamrozić w pożywce do zamrażania tkanek (O.C.T.) z suchym lodem. Zamrożone skrawki zostały przecięte na 7 μm i wybarwione zgodnie z wcześniejszym opisem ²⁶.

Przebieg czasowy formowania się organoidu guza jelita grubego u trzymiesięcznej myszy Apcmin/+ jest pokazany na rysunku 1. W dniu 0 pojedyncze komórki można było zaobserwować kilka godzin po posiewie (ryc. 1A). W dniu 1 można było zaobserwować ocalałe komórki nabłonka guza jelita grubego z jądrami opornymi na leczenie. W 3 dniu rozmiar komórek podwoił się. W 6 dniu rozmiar organoidu zwiększył się ponad dziesięciokrotnie i wykazywał oznaki apoptozy w środku. W 14 dniu orgnoidy wyrosłyby na nieregularne przedziały (ryc. 1B). Tutaj mieliśmy 39,33 ± 22,05 organoidów / dobrze uformowanych w warunkach trawienia 200 U / ml kolagenazy przez 2 godziny, w porównaniu z brakiem organoidów powstałych w warunkach trawienia 75 U / ml kolagenazy przez 30 minut w tym badaniu (ryc. 1C).

Aby pokazać, że ten model hodowli organoidów może być użyty do badań funkcjonalnych, na rysunku 2 pokazano barwienie immunofluorescencyjne β-kateniny, integralnego składnika szlaku sygnałowego Wnt. Dodatnio wybarwione komórki dla β-kateniny znajdują się w zewnętrznych warstwach organoidu, co potwierdziło wzorzec wzrostu z centralnym światłem zaproponowany przez grupę 24 dr Cleversa.

Rysunek 1. Pokazano reprezentatywną formację organoidową pochodzącą z guza jelita grubego pobranego od trzymiesięcznej myszy Apcmin/+ hodowaną przez (A) 0, 1, 3, 6 i (B)14 dni. (C) Pomyślne tempo tworzenia organoidów w dwóch różnych warunkach trawienia kolagenazy.

Rysunek 2. Pokazano barwienie immunofluorescencyjne β-kateniny dla organoidów pochodzących z guza jelita grubego pobranego od trzymiesięcznej myszy Apcmin/+. Do barwienia jąder używano dichlorowodorku 4',6-dimidino-2-fenyloindolu (DAPI).

Nie mamy nic do ujawnienia.