Bioluminescencyjny ortotopowy model progresji raka trzustki

Rak trzustki jest czwartą najczęstszą przyczyną zgonów związanych z rakiem, z 5-letnim wskaźnikiem przeżycia wynoszącym 4-6%. ^1,2 Tylko 15% pacjentów jest diagnozowanych na tyle wcześnie, aby kwalifikować się do operacji, a u >80% tych pacjentów dochodzi do nawrotów nowotworów. ^3,4 Gemcytabina jest stosowana w leczeniu gruczolakoraka trzustki, jednak chemiooporność jest powszechna i często lek ma niewielki wpływ na przeżycie całkowite. ⁵ Pilnie potrzebne są nowe strategie farmakologiczne w leczeniu raka trzustki. Ich rozwój zależy od znacznie lepszego zrozumienia kluczowych etapów progresji choroby, które mogą być wrażliwe na interwencję terapeutyczną.

Modele ortotopowe raka trzustki naśladują kluczowe aspekty choroby ludzkiej, co czyni je idealnymi narzędziami do badania biologii raka trzustki. ^6-9 W przeciwieństwie do testów komórkowych in vitro dotyczących zachowania komórek raka trzustki i podskórnych modeli in vivo raka trzustki, modele ortotopowe umożliwiają badanie interakcji komórek nowotworowych z mikrośrodowiskiem trzustki. Kinetyka progresji choroby jest wysoce odtwarzalna w modelach ortotopowych i występuje w krótkim czasie (tygodnie), co sprawia, że dobrze nadają się do badań przedklinicznych nowych środków terapeutycznych. Jest to przeciwieństwo modeli transgenicznych, w których początek choroby występuje w dłuższym i bardziej zmiennym przedziale czasowym (od miesięcy do 1 roku). ¹⁰ W przypadku stosowania z bardziej agresywnymi liniami komórkowymi, ortotopowe modele raka trzustki mają wzorce spontanicznych przerzutów podobne do tych obserwowanych u pacjentów. ⁸ Ekspresja bioluminescencyjnych genów reporterowych, takich jak lucyferazy świetlika, ułatwia podłużne monitorowanie wzrostu guza, rozprzestrzeniania się przerzutów, nawrotu i odpowiedzi na leki. ^6,11

Tutaj opisujemy ortotopowy model raka trzustki, który wykorzystuje Matrigel do miejscowego dostarczania komórek i obrazowania bioluminescencyjnego in vivo do nieinwazyjnego monitorowania progresji guza. Ten ortotopowy model raka trzustki umożliwia nieinwazyjną analizę progresji choroby i odpowiedzi na interwencje terapeutyczne w modelach syngennych lub ksenoprzeszczepach.

Demonstrowany protokół jest wykonywany pod kierunkiem i zgodą komitetu ds. opieki i użytkowania zwierząt w instytucji autora. Wszystkie eksperymenty są przeprowadzane zgodnie ze wszystkimi odpowiednimi wytycznymi, przepisami i agencjami regulacyjnymi.

1. Przekształcanie linii komórkowych raka trzustki

1. Transdukuj komórki raka trzustki w celu ekspresji lucyferazy, jak opisano wcześniej. Wykorzystuje się tu ^12,13 linii komórkowych raka trzustki Panc-1 i Capan-1 transdukowanych lucyferazy świetlika.

Uwaga: Można również użyć lucyferazy Renilla lub lucyferazy bakteryjnej.

2. Przygotowanie komórek raka trzustki

1. Hodowla transdukowała komórki raka trzustki do 70% zlewania się.
2. Podnieś komórki trzustki i upewnij się, że żywotność jest większa niż 90%.
3. Zawiesić w stężeniu 2 x 10⁷ komórek/ml w mieszaninie 3:2 schłodzonego roztworu soli fizjologicznej buforowanej Matrigel:Phosphate (PBS).
4. Zawiesinę komórek Matrigelu należy przechowywać na lodzie przed wstrzyknięciem do trzustki.

Uwagi: Aby zapewnić szybkie zestalenie Matrigel, zmniejsz objętość PBS, aby uwzględnić objętość osadu komórkowego. Z Matrigelem należy obchodzić się przez cały czas za pomocą lodowatych narzędzi i strzykawek, aby zapobiec zestaleniu się przed wstrzyknięciem. Sugerowana liczba komórek jest wskazówką i powinna być określona empirycznie dla każdej linii komórkowej.

3. Przygotowanie myszy

1. Znieczulić mysz za pomocą wziewnego 2-3% izofluranu. Określ głębokość znieczulenia na podstawie braku odruchu pedałowania na delikatne uszczypnięcie palca
.
2. Nałóż lubrykant na oczy, aby zapobiec wysuszeniu.
3. Umieść mysz na plecach na poduszce grzewczej o temperaturze 37 °C i delikatnie obróć mysz, aby podnieść lewą stronę brzucha.
4. Przygotuj brzuch z 10% roztworem jodu powidonu.

Uwagi: Zamiast znieczulenia wziewnego można użyć znieczulenia iniekcyjnego. Post przedoperacyjny nie jest konieczny.

4. Laparotomia

1. Za pomocą sterylnych narzędzi chirurgicznych wykonać 1,5 cm nacięcie w skórze około 1 cm w lewo od linii środkowej.
2. Wykonaj 1,5 cm nacięcie w leżącym poniżej mięśniu brzucha.
3. Zlokalizuj śledzionę za pomocą kleszczy i delikatnie usuń śledzionę z jamy brzusznej. Zabezpiecz śledzionę wzdłuż sterylnego wacika, aby odsłonić leżącą pod spodem trzustkę.
4. Zlokalizuj ogon trzustki przylegający do śledziony.
5. Za pomocą strzykawki insulinowej 29 G 0,3 ml wstrzyknąć 20 μl zawiesiny komórek Matrigelu do trzustki.
6. Po wstrzyknięciu należy przytrzymać strzykawkę w trzustce przez 30-60 sekund, aż Matrigel zastygnie. Ten ważny krok minimalizuje wyciek komórek.
7. Sprawdzić miejsce wstrzyknięcia, aby upewnić się, że nie doszło do wycieku.
8. Przywróć śledzionę i trzustkę do jamy brzusznej.

Uwaga: Uważaj, aby nie przebić grzbietowej strony trzustki, która może być cienka.

5. Zamknięcie ściany brzucha

1. Zamknij mięśnie brzucha myszy wchłanialnym plecionym szwem 4-0 za pomocą okrągłej igły za pomocą ciągłego ściegu.
2. Zamknij zewnętrzną skórę niewchłanialnym szwem monofilamentowym 6-0 za pomocą igły tnącej za pomocą ściegu ciągłego.
3. Wyjąć mysz z wziewnego środka znieczulającego i wstrzyknąć podskórnie 0,05-0,1 mg/kg buprenorfiny.
4. Pozwól myszy dojść do siebie w klatce umieszczonej na poduszce grzewczej o temperaturze 37 °C ze swobodnym dostępem do jedzenia i wody. Jeśli myszy wykazują oznaki bólu, takie jak garbienie się lub ograniczona ruchomość, buprenorfinę można podawać co 12 godzin przez okres 36 godzin.
5. Po wygojeniu się rany (7-10 dni) znieczulij mysz i usuń szwy zewnętrzne.

6. Bioluminescencyjne śledzenie progresji raka trzustki

1. Znieczulić mysz za pomocą wziewnego izofluranu.
2. Wstrzyknąć 150 mg/kg D-lucyferyny przez żyłę ogonową.
3. Umieść mysz w systemie obrazowania bioluminescencyjnego i uchwyć obrazy w świetle białym i bioluminescencji, jak opisano wcześniej. ^14,15
4. Wyjmij mysz z wziewnego środka znieczulającego i pozwól jej dojść do siebie w domowej klatce.

Uwaga: Obrazowanie bioluminescencyjne jest nieinwazyjne i może być przeprowadzane okresowo w celu zbadania kinetyki wzrostu guza. Aby zobrazować guz w ogonie trzustki, ważne jest, aby położyć mysz na jego lewej stronie, tak aby guz był skierowany w stronę kamery. Obrazowaliśmy raz w tygodniu z częstotliwością zwiększoną do trzech razy w tygodniu przed eksperymentalnym punktem końcowym przy użyciu systemu obrazowania Lumina II (Perkin-Elmer, dawniej Caliper Life Sciences) z oprogramowaniem Living Imaging 4.3.1 z binningiem 4, FOV 12.5, F-stop 1, ekspozycja 1 - 60 s (określona na podstawie najwyższej ekspozycji bez nasycenia pikseli).

Ta metoda opisuje ortotopowy model raka trzustki za pomocą procedur chirurgicznych, w tym indukcji znieczulenia, laparotomii, wstrzykiwania komórek rakowych do Matrigel i zamykania brzucha (Rysunek 1A). Wstrzyknięte komórki tworzą pęcherzyk na powierzchni trzustki (ryc. 1B). Progresję raka trzustki można nieinwazyjnie monitorować za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego in vivo w celu śledzenia proliferacji i rozprzestrzeniania się komórek rakowych (ryc. 2). Przerzuty do wątroby wskazano na podstawie obserwacji bioluminescencji w wątrobie podczas resekcji chirurgicznej (ryc. 2) i potwierdzono ex vivo za pomocą histologii (ryc. 4B). Guzy pierwotne wycięto wraz z ogonem trzustki i śledzioną po 6 tygodniach od implantacji. Dynamika wzrostu guza w tym ortotopowym modelu iniekcji jest powtarzalna i bardzo przypomina kinetykę modeli przeszczepów ortotopowych raka trzustki (ryc. 3). Wzrost guza w trzustce jest miejscowo inwazyjny i daje przerzuty do narządów, w tym do wątroby (ryc. 4).

Rysunek 1. Ortotopowy mysi model progresji raka trzustki. A) i. Znieczuloną mysz mocuje się za pomocą taśmy, a brzuch jest dezynfekowany. ii. Po laparotomii podłużnej śledziona i ogon trzustki są delikatnie uzewnętrzniane i utrzymywane na miejscu na sterylnym waciku. iii. Komórki nowotworowe trzustki osadzone w Matrigelu są wstrzykiwane do ogona trzustki. iv. Brzuch jest zamknięty w dwóch warstwach. B) Powiększony obraz przedstawiający zewnętrzną śledzionę i trzustkę. Wstrzyknięte komórki tworzą bąbelek (grot strzałki). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Rysunek 2. Obrazowanie bioluminescencyjne ortotopowego guza trzustki (A) dziesięć dni po wstrzyknięciu, (B) 31 dni po wstrzyknięciu i (C) pięć dni po resekcji guza.

Rysunek 3. Wzrost pierwotnego guza in vivo linii komórkowych Panc-1 i Capan-1 monitorowano w czasie (dni po wstrzyknięciu) za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego (n = 4). Kinetyka wzrostu guza po wstrzyknięciu komórek guza trzustki zanurzonych w Matrigel jest podobna do modeli ortotopowych wykorzystujących przeszczep fragmentów guza trzustki.

Rysunek 4. Wybarwione hematosyliną i eozyną skrawki (A) pierwotnego guza trzustki Panc-1 i (B) przerzutów do wątroby z pierwotnego guza trzustki Panc-1. * Miejscowa inwazja komórek raka trzustki do otaczającego narządu.

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.