Fantomy symulujące tkanki do oceny potencjalnych zastosowań obrazowania fluorescencyjnego w bliskiej podczerwieni w chirurgii raka piersi

Chirurgia oszczędzająca pierś (BCS), po której następuje radioterapia, jest standardowym leczeniem u pacjentek z rakiem piersi T_{1-T 2} ^1,2. Niedokładności w śródoperacyjnej ocenie rozległości operacji skutkują dodatnim marginesem chirurgicznym u 20 do 40% pacjentów, którzy przeszli BCS, co wymaga dodatkowej interwencji chirurgicznej lub radioterapii^3,4,5. Chociaż rozległa resekcja sąsiedniej zdrowej tkanki piersi może zmniejszyć częstotliwość dodatnich marginesów chirurgicznych, utrudni to również wyniki kosmetyczne i zwiększy choroby współistniejące^6,7. Dlatego potrzebne są nowe techniki, które zapewnią śródoperacyjne informacje zwrotne na temat lokalizacji guza pierwotnego i zakresu operacji. Obrazowanie optyczne, w szczególności obrazowanie fluorescencyjne w bliskiej podczerwieni (NIRF), może zmniejszyć częstotliwość dodatnich marginesów chirurgicznych po BCS, dostarczając chirurgowi narzędzia do przed- i śródoperacyjnej lokalizacji guza w czasie rzeczywistym. Niedawno nasza grupa poinformowała o pierwszym badaniu na ludziach obrazowania fluorescencyjnego ukierunkowanego na nowotwór u pacjentek z rakiem jajnika, wykazując wykonalność tej techniki do wykrywania guzów pierwotnych i przerzutów do otrzewnowej z wysoką czułością⁸. Jednak przed przystąpieniem do badań klinicznych u pacjentek z rakiem piersi można już ocenić przedklinicznie za pomocą fantomów wykonalność różnych zastosowań obrazowania NIRF ukierunkowanych na nowotwór w BCS.

Poniższy protokół badawczy opisuje zastosowanie obrazowania NIRF w symulujących tkankowo fantomach piersi zawierających fluorescencyjne inkluzje symulujące nowotwór⁹. Fantomy stanowią niedrogie i wszechstronne narzędzie do symulacji przed- i śródoperacyjnej lokalizacji guza, resekcji guza w czasie rzeczywistym pod kontrolą NIRF, oceny stanu marginesu chirurgicznego i wykrywania choroby resztkowej. Galaretowate fantomy mają właściwości elastyczne podobne do tkanki ludzkiej i mogą być cięte za pomocą konwencjonalnych narzędzi chirurgicznych. Podczas symulowanego zabiegu chirurgicznego chirurg kieruje się informacjami dotykowymi (w przypadku wyczuwalnych palpacyjnie) oraz oględzinami pola operacyjnego. Ponadto stosuje się obrazowanie NIRF, aby zapewnić chirurgowi śródoperacyjną informację zwrotną w czasie rzeczywistym na temat zakresu operacji.

Należy podkreślić, że obrazowanie NIRF wymaga użycia barwników fluorescencyjnych. Idealnie byłoby, gdyby stosowano barwniki fluorescencyjne, które emitują fotony w zakresie widma bliskiej podczerwieni (650 - 900 nm), aby zminimalizować absorpcję i rozpraszanie fotonów przez cząsteczki fizjologicznie obfite w tkanki (np. hemoglobina, lipidy, elastyna, kolagen i woda)^10,11. Co więcej, autofluorescencja (tj. wewnętrzna aktywność fluorescencyjna w tkankach spowodowana reakcjami biochemicznymi w żywych komórkach) jest zminimalizowana w zakresie widma bliskiej podczerwieni, co skutkuje optymalnymi stosunkami guza do tła¹¹. Poprzez sprzężenie barwników NIRF z ugrupowaniami ukierunkowanymi na nowotwór (np. przeciwciałami monoklonalnymi), można uzyskać ukierunkowane dostarczanie barwników fluorescencyjnych do zastosowań w obrazowaniu śródoperacyjnym.

Ponieważ ludzkie oko jest niewrażliwe na światło w zakresie bliskiej podczerwieni, do obrazowania NIRF wymagane jest bardzo czułe urządzenie do kamery. Do tej pory opracowano kilka systemów obrazowania NIRF do użytku śródoperacyjnego¹². W obecnym badaniu wykorzystaliśmy niestandardowy system obrazowania NIRF, który został opracowany do zastosowań śródoperacyjnych we współpracy z Uniwersytetem Technicznym w Monachium. System pozwala na jednoczesną akwizycję obrazów kolorowych i fluorescencyjnych. Aby poprawić dokładność obrazów fluorescencyjnych, wdrożono schemat korekcji dla zmian natężenia światła w tkance. Szczegółowy opis jest dostarczony przez Themelis i wsp.¹³

1. Tworzenie silikonowych form do inkluzji symulujących guz

1. Zbieraj stałe przedmioty o pożądanym kształcie i rozmiarze, które mogą służyć jako modele do inkluzji symulujących nowotwór, np. koraliki lub kulki.
2. Dokładnie oczyść modele guza. Aby zapewnić łatwe wyjęcie z formy silikonowej, modele guzów można spryskać sprayem zapobiegającym przywieraniu lub pokryć cienką warstwą wazeliny lub wosku pszczelego.
3. Umieść każdy model w osobnym cienkościennym kwadratowym (plastikowym) pudełku o gładkiej powierzchni. W razie potrzeby przymocuj model do dolnej części pudełka, aby utrzymać go na miejscu. Użyj pudełka, które jest nieco większe niż sam model guza, aby uniknąć marnowania nadmiernych ilości silikonu.
4. Wlej wymaganą ilość składnika silikonowego A do miski i dodaj składnik silikonowy B w stosunku wagowym 10:1. Dokładnie wymieszaj oba składniki. Opcjonalnie można użyć pompy próżniowej do usunięcia pęcherzyków powietrza z mieszanki silikonowej.
5. Delikatnie wlej mieszankę silikonu do plastikowego pudełka, aby zapobiec uwięzieniu pęcherzyków powietrza. Mieszankę silikonową należy przetworzyć w ciągu 45 minut, aby uzyskać optymalne rezultaty.
6. Pozwól mieszaninie silikonu zestalić się przez co najmniej 6 godzin przed przecięciem formy i usunięciem modelu guza. Opcjonalnie silikonową formę można przyciąć w zygzakowaty wzór, aby umożliwić jej czyste dopasowanie. Maksymalną wytrzymałość silikonu uzyskuje się po 3 dniach.

2. Utwórz roztwór soli fizjologicznej buforowany trisem

1. Stwórz roztwór soli fizjologicznej buforowany Tris (TBS), dodając 6,1 g (50 mM) Tris i 8,8 g (150 mM) NaCl do 800 ml wody dejonizowanej.
2. Dodać 1,0 g (15 mmol) NaN₃, aby zablokować natlenienie hemoglobiny (kroki 3.3 i 4.4) i zahamować rozwój bakterii. UWAGA: NaN₃ jest ciężką trucizną. Może to być śmiertelne w kontakcie ze skórą lub po połknięciu. Toksyczność tego związku jest porównywalna do toksyczności rozpuszczalnych cyjanków alkalicznych, a dawka śmiertelna dla dorosłego człowieka wynosi około 0,7 g. Zawsze postępuj zgodnie z instrukcjami bezpieczeństwa dostarczonymi przez producenta.
3. Dostosuj pH do 7,4 i doprowadź objętość do 1,000 ml wodą dejonizowaną.

3. Tworzenie inkluzji fluorescencyjnych

1. Dodaj 2 g agarozy do 50 ml TBS z kroku 2. Wyższa temperatura topnienia agarozy w porównaniu z żelatyną (krok 4.2) zapobiegnie rozpuszczaniu się wtrąceń i wyciekaniu barwnika fluorescencyjnego po umieszczeniu w stopionej żelatynie. Opcjonalnie ilość dodanej agarozy można zmienić na 1 lub 3 g, aby uzyskać odpowiednio bardziej miękkie lub wyczuwalne palpacyjnie inkluzje guza.
2. Podgrzej zawiesinę agarozy za pomocą kuchenki mikrofalowej, aż do osiągnięcia temperatury wrzenia. Dokładnie wymieszaj, aż agaroza całkowicie się rozpuści.
3. Dodać 1,1 g (17 μmol) hemoglobiny i 5 ml 20% intralipidu rozpuszczonego w 50 ml TBS do mieszaniny agarozy pod ciągłym mieszaniem, aby upodobnić charakterystykę optyczną otaczającej tkanki fantomowej piersi (krok 4).
4. Dodać 20,0 mg (25,8 μmol) barwnika fluorescencyjnego zieleni indocyjaninowej do 83,8 ml wody dejonizowanej. Upewnij się, że barwnik jest całkowicie rozpuszczony.
5. Odpipetować 5,0 ml z tego roztworu i dodać go do mieszaniny agarozy, aby uzyskać końcowe stężenie 14 μM. Opcjonalnie, w razie potrzeby, można użyć innych barwników fluorescencyjnych niż ICG o ich optymalnym stężeniu.
6. Delikatnie napełnij silikonowe foremki utworzone w kroku 1 gorącą mieszanką agarozy za pomocą strzykawki (Rysunek 1A). Powtarzaj ten proces, aż wszystkie formy zostaną wypełnione.
7. Pozwól inkluzjom fluorescencyjnym zestalić się w temperaturze pokojowej przez około jedną godzinę. Chroń inkluzje przed światłem, przykrywając całą formę folią aluminiową.
8. Po zestaleniu delikatnie otwórz formę i wyciśnij wtrącenie (Rysunek 1B). Opcjonalnie za pomocą końcówki strzykawki nanieść małe krople stopionej mieszaniny agarozy na powierzchnię wtrącenia. Powtarzając ten proces kilka razy w tym samym miejscu, można utworzyć małe ostrogi nowotworowe, aby symulować guzy naciekające.
9. Chroń inkluzje agarozy przed światłem i odwodnieniem, zawijając je w folię aluminiową i przechowuj w wilgotnym pojemniku do przechowywania w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: Użycie niższych lub wyższych stężeń barwnika fluorescencyjnego niż znane optimum stężenia spowoduje zmniejszenie intensywności sygnału fluorescencyjnego. Pozornie sprzeczne z intuicją zmniejszenie intensywności sygnału wraz ze wzrostem stężenia barwnika powyżej optymalnego stężenia barwnika fluorescencyjnego jest spowodowane zjawiskiem znanym jako hartowanie. Przy ocenie maksymalnej głębokości penetracji barwnika fluorescencyjnego w fantomach obowiązkowe jest zastosowanie optymalnego stężenia.

4. Tworzenie fantomów piersi

1. Zaopatrz się w formę w kształcie miseczki do stworzenia fantomów piersi o pożądanej wielkości i objętości, np. szklanej lub plastikowej miski. Forma powinna mieć gładką powierzchnię, aby zapobiec przywieraniu żelatyny do formy. Objętość formy wynosząca 500 ml stworzy fantomy piersi o wystarczającej wielkości.
2. Aby stworzyć fantom piersi o objętości 500 ml, dodaj 50 g żelatyny 250 nalot do 500 ml TBS (krok 2). Podgrzać zawiesinę żelatynową do temperatury 50 °C przy ciągłym mieszaniu.
3. Gdy żelatyna całkowicie się rozpuści, pozwól mieszaninie żelatyny stopniowo ostygnąć i utrzymuj ją w stałej temperaturze 35 °C w gorącej łaźni wodnej.
4. Przy ciągłym mieszaniu dodać odpowiednio 5,5 g (85 mmol) hemoglobiny bydlęcej i 25 ml intralipidu 20%, aby zasymulować odpowiednio wchłanianie i rozpraszanie fotonów w tkance.
5. Schładzać formę w kształcie miseczki w temperaturze 4 °C przez co najmniej 1 godzinę. Następnie wlej mieszaninę żelatyny do formy do poziomu odpowiadającego z góry określonej głębokości inkluzji symulującej guz agarozy (ryc. 1C). Pozostawić mieszaninę żelatyny do zestalenia się w temperaturze 4 °C przez 30 minut do jednej godziny.
6. Po zestaleniu należy umieścić symulujący guz fluorescencyjny wtrącenie agarozy na powierzchni fantomu i tymczasowo utrwalić inkluzję za pomocą małej igły. W jednym fantomie piersi można zawrzeć maksymalnie trzy inkluzje fluorescencyjne symulujące nowotwór. Należy zachować wystarczającą przestrzeń (co najmniej 5 cm) między poszczególnymi inkluzjami symulującymi guz (ryc. 1D).
7. Wlej pozostałą część ciepłej mieszaniny żelatyny do pozostałej objętości formy, co pozwoli na przyleganie obu warstw bez tworzenia artefaktów załamania. Zaznacz położenie fluorescencyjnych wtrąceń symulujących guz na formie. Pozwolić, aby fantom zestalił się O/N w temperaturze 4 °C.
8. Po zestaleniu się usuń igły używane do tymczasowego utrwalenia inkluzji i delikatnie wyjmij fantom piersi z formy (ryc. 1E). Chroń fantom piersi przed światłem i odwodnieniem, zawijając go w folię aluminiową i przechowuj w wilgotnym pojemniku do przechowywania w temperaturze 4 °C.

Rycina 1. Sekwencyjne etapy tworzenia fantomów piersi zawierających fluorescencyjne inkluzje symulujące nowotwór. Po wytworzeniu form silikonowych o pożądanym kształcie i rozmiarze, foremki wypełnia się stopioną mieszaniną agarozy za pomocą strzykawki (A). W obecnym badaniu wyprodukowano inkluzje symulujące guz o różnej wielkości i kształcie (B). Następnie cienką warstwę stopionej mieszanki żelatyny wlewa się do specjalnie zaprojektowanej powlekanej drewnianej formy na piersi (C). Po zestaleniu inkluzje symulujące guz są umieszczane, tymczasowo utrwalane i pokrywane kolejną warstwą stopionej mieszaniny żelatyny (D). Po zastygnięciu fantom piersi delikatnie wyjmuje się z formy (E). Fantom może być następnie zastosowany do symulacji różnych zastosowań obrazowania NIRF (F). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

5. Ustaw system kamer NIRF

1. System kamer NIRF do zastosowań śródoperacyjnych jest wymagany do symulacji celowanego obrazowania NIRF w chirurgii raka piersi. Obecnie dostępnych jest kilka systemów obrazowania NIRF do śródoperacyjnego obrazowania NIRF w czasie rzeczywistym do użytku badawczego. Chociaż istnieją pewne różnice między tymi urządzeniami, wszystkie zawierają źródło światła wzbudzającego (do wzbudzania fluorescencyjnych inkluzji guza) oraz bardzo czułe urządzenie obrazujące do wykrywania emitowanych fotonów.
2. Upewnij się, że używasz źródła światła wzbudzającego o wystarczającej długości fali. W przypadku inkluzji symulujących guz zawierających ICG należy użyć źródła światła wzbudzającego (np. lasera), które emituje fotony o długości fali od 750 do 800 nm. W przypadku stosowania alternatywnego barwnika fluorescencyjnego długość fali wzbudzenia należy dostosować zgodnie z instrukcjami producenta.
3. W przypadku, gdy system kamer NIRF zawiera filtr emisyjny do odfiltrowywania niepożądanych sygnałów tła, upewnij się, że używany jest właściwy filtr. W przypadku inkluzji symulujących guz zawierających ICG należy użyć filtra emisyjnego o długości fali od 800 do 850 nm. Alternatywne barwniki fluorescencyjne mogą wymagać różnych filtrów emisyjnych, w zależności od instrukcji producenta.
   UWAGA: Upewnij się, że długości fal wzbudzenia i emisji nie nakładają się na siebie, aby zapobiec przesyceniu obrazów. Ponadto może być konieczne dostosowanie czasu akwizycji obrazu w celu uzyskania optymalnych obrazów fluorescencyjnych. W przypadku głęboko osadzonych inkluzji fluorescencyjnych lub słabych sygnałów fluorescencyjnych czas akwizycji obrazu może zostać wydłużony nawet o kilka sekund do minut. W przypadku wtrąceń powierzchniowych lub silnych sygnałów fluorescencyjnych czas akwizycji można skrócić do kilku ms, aby umożliwić obrazowanie fluorescencyjne z szybkością wideo w czasie rzeczywistym.

6. Symulacja zastosowań obrazowania NIRF w chirurgii raka piersi

1. Wyjmij fantom piersi symulujący tkankę z pojemnika i umieść go na płaskiej, niefluorescencyjnej powierzchni. Następnie umieść urządzenie do obrazowania NIRF nad fantomem piersi, pozostawiając wystarczającą odległość roboczą do wycięcia inkluzji symulujących guz.
2. Zlokalizuj symulujące guz włączenie fluorescencyjne za pomocą obrazowania NIRF i/lub badania palpacyjnego piersi fantomowej. W przypadku, gdy nie można wykryć sygnału fluorescencyjnego, inkluzja jest albo umieszczona zbyt głęboko w fantomie, aby można było ją wykryć, albo należy wydłużyć czas akwizycji obrazu.
3. Po zlokalizowaniu inkluzji należy naciąć pierś fantomową i usunąć inkluzję symulującą guz pod nadzorem NIRF w czasie rzeczywistym przy użyciu konwencjonalnych narzędzi chirurgicznych. Alternatywnie, inkluzję można wyciąć, kierując się wyłącznie oględzinami i badaniem palpacyjnym fantomu piersi, aby symulować standard opieki.
4. Bezpośrednio po usunięciu inkluzji symulującej guz należy zobrazować jamę chirurgiczną pod kątem pozostałej aktywności fluorescencyjnej wskazującej na niewystarczające wycięcie.
5. W przypadku pozostałej aktywności fluorescencyjnej należy wyciąć pozostałość inkluzji zgodnie z bezpośrednimi wytycznymi NIRF, aż nie pozostanie żaden sygnał fluorescencyjny.
6. Zobrazuj wycięte fragmenty fantomowe, aby zasymulować makroskopową ocenę stanu marginesów pod kontrolą NIRF. W tym celu należy pokroić tkankę fantomową na blaszki o średnicy 3 - 5 mm i odpowiednio zobrazować płytki. Sygnał fluorescencyjny docierający do marginesów chirurgicznych wskazuje na istnienie dodatnich marginesów chirurgicznych.

Wyniki tego badania zostały wcześniej zgłoszone gdzieindziej 9.

Nasze dane pokazują, że obrazowanie NIRF może być stosowane do wykrywania fluorescencyjnych inkluzji symulujących guz w fantomach piersi symulujących tkanki, symulując operację oszczędzania piersi pod kierunkiem NIRF u pacjentek z rakiem piersi. Korzystając z naszego modelu fantomowego, stwierdziliśmy, że śródoperacyjna lokalizacja guza, resekcja guza pod kontrolą NIRF, śródoperacyjna ocena marginesów jamy chirurgicznej i wykrywanie choroby resztkowej są możliwe (ryc. 2). Krótko mówiąc, wyprodukowano w sumie cztery piersi fantomowe, z których każda zawierała dwie inkluzje fluorescencyjne o różnych wymiarach i/lub morfologii (Tabela 1).

Fluorescencyjne inkluzje symulujące guz zostały usunięte chirurgicznie z pierwszego i drugiego fantomu piersi za pomocą konwencjonalnych narzędzi chirurgicznych. Wycięcie inkluzji przeprowadzono za pomocą badania palpacyjnego i oględzin pola operacyjnego. Chirurg został poproszony o operację piersi fantomowej do czasu całkowitego usunięcia inkluzji symulujących nowotwór. Następnie zastosowano dostosowaną kamerę fluorescencyjną do skanowania jamy operacyjnej w poszukiwaniu pozostałych sygnałów fluorescencyjnych. W przypadku niepełnego wycięcia, na co wskazuje silny pozostały sygnał fluorescencji, chirurg został poproszony o wycięcie pozostałości inkluzji zgodnie z wytycznymi NIRF w czasie rzeczywistym. Zarówno w fantomie #1, jak i #2 wycięcie jednego z dwóch inkluzji symulujących guz było niekompletne, o czym świadczy silny pozostały sygnał fluorescencyjny pochodzący z jamy operacyjnej. W przypadku niepełnego wycięcia po pierwszej próbie chirurgicznej, chirurg wykrył i wyciął resztki inkluzji pod kierunkiem NIRF podczas tego samego zabiegu (tzw. teranostycznego). Ponowne wycięcie pod bezpośrednim nadzorem NIRF skutkowało całkowitym usunięciem pozostałości inkluzji przy drugiej próbie chirurgicznej we wszystkich przypadkach, przy czym nie było potrzeby wycinania dużych objętości tkanki fantomowej.

W trzecim i czwartym fantomie piersi, lokalizacja pod kontrolą NIRF i chirurgiczne usunięcie inkluzji fluorescencyjnych zostało przeprowadzone przy pierwszej próbie chirurgicznej. Zbliżając się do symulujących guz inkluzji fluorescencyjnych, chirurg miał do dyspozycji monitor, na który wyświetlany był sygnał fluorescencyjny w czasie rzeczywistym. W czwartym fantomie piersi inkluzja symulująca guz umieszczona na głębokości 3,0 cm była wykrywalna dopiero po nacięciu tkanki fantomowej na około 1 cm. W trzecim fantomie piersi oba inkluzje symulujące guz zostały radykalnie usunięte podczas pierwszej próby chirurgicznej, podczas gdy usunięcie jednego infiltracyjnego wtrącenia w czwartym fantomie okazało się niekompletne. Reekstrakcja pod bezpośrednią kontrolą NIRF spowodowała całkowite usunięcie pozostałości guza w tym fantomie.

Po operacji, wycięte fragmenty tkanek fantomowych zostały pocięte na 3 mm szkiełka i zobrazowane za pomocą systemu kamer NIRF w celu symulacji makroskopowej oceny ex vivo stanu marginesu chirurgicznego. We wszystkich przypadkach pooperacyjne obrazowanie NIRF wyraźnie przedstawiało granice inkluzji symulujących guz i wskazywało, czy pozostałość guza była obecna na marginesach chirurgicznych (ryc. 2C).

Rysunek 2. Symulacja obrazowania NIRF w fantomach piersi. Symulujące tkanki fantomy piersi zawierające fluorescencyjne inkluzje symulujące guz zastosowano do symulacji śródoperacyjnej lokalizacji guza (A), usuwania guza pod kontrolą NIRF (B) oraz oceny stanu marginesu chirurgicznego pod kontrolą NIRF (C). Zmodyfikowano na podstawie: Pleijhuis et al., EJSO (2011). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1. Przegląd kompozycji fantomowej.
W sumie wyprodukowano 4 fantomy, zawierające dwie infuzje fluorescencyjne symulujące nowotwór, z których każda miała inny rozmiar i kształt.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.