Ortotopowe wstrzyknięcie komórek raka piersi do poduszeczki tłuszczowej sutka myszy w celu zbadania wzrostu guza.

Rak jest bardzo złożoną chorobą, która była przedmiotem badań przez ponad wieki. Rak piersi jest najczęstszym rodzajem raka; Występuje głównie u kobiet, ale sporadycznie może również występować u mężczyzn²⁷. Choroba jest spowodowana głównie utratą mechanizmu kontrolnego rządzącego podziałem komórek, co z kolei prowadzi do nieskończonego wzrostu komórek w organizmie. Zaburzenia te mogą być spowodowane kilkoma mechanizmami: po pierwsze, zdrowe komórki potrzebują sygnałów wzrostu z otaczających komórek, aby się namnażać, podczas gdy komórki rakowe wytwarzają własne czynniki wzrostu i zwiększają ekspresję receptorów czynnika wzrostu, uzyskując w ten sposób wyższą szybkość proliferacji¹; po drugie, komórki nowotworowe są mniej podatne na sygnały antyproliferacyjne⁸; Po trzecie, aby zrównoważyć liczbę komórek w ciele, wymagana jest również śmierć komórki; Jednak komórki rakowe uciekają przed zaprogramowaną śmiercią komórki, zwaną apoptozą¹⁴; Po czwarte, komórki przylegają do macierzy zewnątrzkomórkowych, aby przetrwać, ale komórki nowotworowe mogą rosnąć bez potrzeby przyczepiania się i wykazywać odporność na anoikis¹⁹; po piąte, aktywacja telomerazy omija skracanie telomerów i zapobiega replikacyjnemu starzeniu^{się 21}; wreszcie, co nie mniej ważne, pominięcie kontroli jakości DNA po mitozie skutkuje zmienioną zawartością genetyczną^15,16. Aby zidentyfikować onkogeny lub supresory nowotworów, które odgrywają rolę w tej rozregulowanej proliferacji, kluczowe są eksperymenty ze wzrostem guza u myszy.

Pierwotny wzrost guza na ogół nie jest głównym powodem śmierci. Migracja komórek nowotworowych z miejsca pierwotnego do miejsca wtórnego, zwana przerzutami, jest główną przyczyną zgonów u większości pacjentów z rakiem²². Przerzuty pociągają za sobą inwazję komórek nowotworowych, wynaczynienie, przemieszczanie się przez krążenie, unikanie ataku immunologicznego, wynaczynienia i wzrostu w miejscu wtórnym. Przejście nabłonkowe do mezenchymalnego (EMT) jest kluczowym procesem w przerzutach i obejmuje zmianę profili ekspresji genów, w wyniku czego powstają komórki o większej ruchliwości i inwazyjności, które są warunkiem wstępnym dla komórki przerzutowej¹². Ponieważ proces nowotworowy jest wypadkową kombinacji różnych działań, w tym wzajemnych interakcji między komórkami rakowymi, komórkami zrębu oraz komórkami pro- i przeciwzapalnymi, podejście in vitro do raka często nie zapewnia pełnego wglądu w proces nowotworowy. Podobnie, terapie przeciwnowotworowe wpływające na unaczynienie guza często nie mogą być badane in vitro, dlatego stosowanie metod in vivo jest nieuniknione.

Aby badać progresję raka piersi, opracowano różne metody eksperymentalne. Najczęściej stosowanym modelem jest podskórne wstrzyknięcie komórek raka piersi myszom⁵. W tej konfiguracji eksperymentalnej badacz może wprowadzić szeroki zakres zmian do wybranej linii komórkowej in vitro (tj. regulacja w górę, w dół regulacji białek) i wstrzyknąć komórki pod skórę. Chociaż metoda ta jest prosta, a proces wstrzykiwania jest prosty bez konieczności wykonywania operacji na myszach, miejsce, w którym wstrzykuje się guz, nie reprezentuje lokalnego środowiska guza sutka, a brak tego środowiska może spowodować rozwój raka piersi, który różni się od obserwowanego w patologii człowieka. Po drugie, genetycznie modyfikowane myszy są często wykorzystywane jako narzędzie in vivo do badania progresji raka piersi. W tym modelu ekspresja onkogenu (tj. PyMT, Neu) jest napędzana przez promotor specyficzny dla tkanki sutka, co prowadzi do powstania spontanicznego guza piersi. Ta eksperymentalna konfiguracja jest przydatna do badania aspektu leczenia choroby poprzez wstrzykiwanie leków lub przeciwciał podczas sprawdzania wielkości guza w czasie³. Jednak rozmnażanie tych myszy z innymi szczepami myszy z niedoborem lub mutacją w genie będącym przedmiotem zainteresowania może również dać wgląd w rolę różnych białek we wzroście guza piersi²⁴. Wadą tego modelu jest to, że jest on podatny na różnice w wielkości i liczbie guzów. Co więcej, poziom ekspresji transgenu zależy od miejsca integracji w genomie i może się zmieniać z jednego szczepu myszy na inny⁴. W tym modelu ekspresja transgenu może być osiągnięta przez wszystkie komórki pochodzenia nabłonkowego, podczas gdy w chorobie ludzkiej tylko subpopulacja komórek wyraża onkogen lub obniża poziom supresorów guza²⁶. Aby zbadać przerzuty, komórki raka piersi mogą być również wstrzykiwane dożylnie (model określany jako przerzuty eksperymentalne)²⁵. Jednak to podejście tylko częściowo podsumowuje proces przerzutowy; Omija wymóg inwazji i wewnątrznaczyniowości komórek nowotworowych i zaczyna się od punktu, w którym komórki nowotworowe są łatwo obecne w krążeniu.

W naszej pracy używamy modelu iniekcji ortotopowej do badania udziału interesujących genów w progresji raka piersi¹³. Nadmiernie eksprymujemy białko w ludzkich komórkach raka piersi i wstrzykujemy je do poduszeczki tłuszczowej sutka myszy NOD / SCID gamma (NSG). Metoda ta jest korzystna pod wieloma względami: pozwala na bardzo szybkie i zróżnicowane zmiany genetyczne w wstrzykniętej linii komórkowej, obejmuje cały proces progresji raka piersi od wzrostu guza pierwotnego do przerzutów w patologicznie istotnych miejscach, a także stanowi dobry model eksperymentalny do badania wpływu leczenia terapeutycznego we wczesnych lub późnych stadiach choroby. Ponadto, korzystając z tego modelu, można zbadać rolę białek pochodzących z komórek zrębowych i rakowych w postępie choroby przy użyciu genetycznie zmodyfikowanych myszy lub komórek. Chociaż iniekcje podskórne są łatwiejsze do wykonania, modele ortotopowe powodują powstanie bardziej rakotwórczej i bardziej przerzutowej populacji komórek rakowych. W związku z tym wyniki uzyskane za pomocą wstrzyknięć podskórnych mogą być fałszywie ujemne lub fałszywie dodatnie^6,17, co zachęca do stosowania modeli ortotopowych do badania wzrostu guza.

Eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez komitet ds. dobrostanu zwierząt Centrum Medycznego Uniwersytetu w Lejdzie (LUMC).

1. Przygotowanie komórek, instrumentów i myszy

1. Dzień przed operacją ogol myszy NOD/SCID gamma (NSG) od czwartego sutka do linii środkowej i zważ myszy, aby sprawdzić, czy wszystkie myszy mają mniej więcej porównywalną wagę.
2. Autoklawuj nożyczki, dwie pęsety i dwie proste kleszczyki do komarów (Rysunek 1A) .
3. W dniu operacji należy umyć ludzkie komórki gruczolakoraka piersi (MDA-MB-231), które zostaną jednokrotnie wstrzyknięte, solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), o pH 7,4 i trypsynizować komórki. Ugasić trypsynę, dodając 10 ml pożywki DMEM zawierającej surowicę na wierzch komórek. Odwirować komórki z prędkością 1 200 obr./min przez 7 minut w temperaturze pokojowej w celu usunięcia surowicy poprzez ponowne zawieszenie komórek w PBS lub w pożywce bez surowicy. Odwiruj je ponownie, aby całkowicie usunąć ślady surowicy. Ponownie zawieś komórki w PBS lub na pożywce.
4. Policz komórki za pomocą hemocytometru i oblicz ilość komórek. Użyj 500 000 komórek/mysz w nie więcej niż 150 μl. Opcjonalnie do PBS lub pożywki, ponownie zawieś komórki w matrigel.
   UWAGA: Określ liczbę komórek w zależności od używanego typu ogniwa.
5. Umieść komórki w sterylnych probówkach do mikrowirówek i trzymaj je na lodzie.
6. Napełnij jedną stożkową probówkę wirówkową o pojemności 50 ml 35 ml PBS pH 7,4, a drugą stożkową probówkę wirówkową o pojemności 50 ml 70% etanolem. Namocz bawełniane waciki w każdej tubce.

2. Iniekcja ortotopowa

1. Operację należy wykonać w sterylnym kapturze, aby utrzymać sterylną atmosferę. Znieczulić mysz poprzez podskórne wstrzyknięcie mieszaniny ksylazyny/ketaminy w dawce odpowiednio 10 mg/kg, 100 mg/kg masy ciała. Zamocuj mysz na poduszce grzewczej. Potwierdź skuteczność znieczulenia przez brak reakcji na szczypanie palca.
   UWAGA: Jeśli ktoś nie jest zbyt zaznajomiony z procedurami chirurgicznymi, operacja może potrwać dłużej. Odpowiednio dobrać dawkę znieczulenia.
2. Nałóż maść okulistyczną na oczy myszy, aby zapobiec wysuszeniu oczu.
3. Oczyść ogolony obszar za pomocą bawełnianego wacika zamoczonego w etanolu przygotowanym w kroku 1.6. Należy wykonywać naprzemienne peelingi z użyciem betadyny i alkoholu trzykrotnie w sposób okrężny, obracając się od planowanego miejsca nacięcia. Alternatywnie użyj jonoforu jako środka dezynfekującego.
4. Wykonaj nożyczkami małe nacięcie między czwartym sutkiem a linią środkową i zrób kieszonkę, wkładając bawełniany wacik zwilżony PBS pH 7,4.
5. Użyj pęsety, aby odsłonić poduszeczkę tłuszczową sutka. Obserwuj poduszeczkę tłuszczową po jej białym kolorze.
6. Ściśnij poduszeczkę tłuszczową drugą pęsetą od jej podstawy; w ten sposób całkowicie odsłonij poduszeczkę tłuszczową (Rysunek 1B), aby łatwo wykonać wstrzyknięcia.
7. Homogenizować mieszaninę komórek, pipetując w górę i w dół. Delikatnie odessać 50 μl zawiesiny komórkowej do strzykawki insulinowej i wstrzyknąć do poduszeczki tłuszczowej sutka, trzymając igłę poziomo. Potwierdź pomyślne wstrzyknięcie, sprawdzając, czy poduszeczka tłuszczowa nie jest obrzęknięta.
8. Delikatnie zwolnij poduszeczkę tłuszczową.
9. Zszyj nacięcie za pomocą wkrętaka do igieł. Wykonaj trzy rzuty, obracając szew wokół wkrętaka igły w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara, przeciwnym do ruchu wskazówek zegara i zgodnym z ruchem wskazówek zegara. Należy użyć dwóch węzłów na szew.
   UWAGA: Upewnij się, że węzły są napięte, w przeciwnym razie myszy mogą otworzyć szwy.
10. Po zabiegu należy wstrzyknąć podskórnie lek przeciwbólowy, taki jak temgesic w dawce 0,05-0,1 mg/kg masy ciała, w celu złagodzenia bólu.
11. Nie pozostawiaj zwierząt bez opieki, dopóki nie odzyskają przytomności i nie utrzymają pozycji leżącej mostka. Umieść wszystkie zwierzęta w różnych klatkach, aż w pełni wyzdrowieją.
12. Aby zachować sterylność, używaj klatek w autoklawie i wody. Zmieniaj klatki co trzy dni, aby utrzymać atmosferę w czystości.

3. Pobieranie organów do analizy

1. W dniu zbioru, 8 tygodni po zagnieżdżeniu się komórek, napełnij 15 ml stożkowych probówek wirówkowych 3 ml roztworu Bouina dla każdej myszy. Ponadto należy użyć dwóch probówek o pojemności 15 ml wypełnionych 5 ml roztworu formaliny na mysz.
2. Znieczulić zwierzęta poprzez wstrzyknięcie ksylazyny/ketaminy w dawce 10 mg/kg 100 mg/kg masy ciała podskórnie. Poczekaj, aż zwierzę straci odruch wycofania szczypania palców u stóp.
3. Przymocuj zwierzę za pomocą igieł na podstawie. Wykonaj długie, pionowe nacięcie linii środkowej nożyczkami. Wykonaj dwa poziome nacięcia tuż pod przednią nogą i nad tylną nogą. Odsłoń guz, przypinając skórę do podstawy. Zmierz objętość guza za pomocą suwmiarki.
4. Oddziel guz od skóry za pomocą nożyczek. Zatrzaskowo zamroź część guza w ciekłym azocie w celu izolacji RNA. Umieść drugą część w stożkowej probówce wirówkowej wypełnionej formaliną, aby przeprowadzić immunohistochemię po zatopieniu parafiny.
5. Delikatnie wyjmij płuca. Umieścić lewe płuco w roztworze Bouina. Utrzymuj płuca w roztworze przez 3 dni. Obserwuj powierzchowne ogniska przerzutów wyraźnie gołym okiem. Opcjonalnie umieść prawe płuco w formalinie, aby zweryfikować mikroprzerzuty za pomocą barwienia hematoksyliną i eozyną (H&E).
   UWAGA: Chociaż przerzuty do płuc są często obserwowane w raku piersi, można również pobrać próbki kości, wątroby, mózgu i śledziony w celu analizy przerzutów. Komórki w obszarze przerzutów są gęstsze i różnią się morfologicznie, dlatego można je łatwo odróżnić od tkanki płucnej.
6. Dzień po zbiorach odessać roztwór formaliny z 15 ml probówek i zastąpić 70% etanolem. Zanurz tkanki w parafinie i wykonaj badania immunohistochemiczne
.
7. W celu analizy krwi otwórz jamę klatki piersiowej nożyczkami. Pobrać 450 μl krwi przez nakłucie serca. Umieścić próbkę krwi w probówce mikrowirówkowej zawierającej 50 μl 3,2% cytrynianu sodu. Po pobraniu krwi wiruj ją w temperaturze 2 000 x g przez 10 minut. Próbki osocza należy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu dalszego użycia.
   UWAGA: Istnieje kilka innych technik pobierania krwi powszechnie stosowanych w praktyce²⁰, a technika, którą należy zastosować, zależy od konfiguracji eksperymentalnej i wyboru naukowca. Jeśli próbka krwi nie jest wymagana, poddaj zwierzę eutanazji zgodnie z protokołem dla zwierząt lub zgodnie z wytycznymi instytucji.

Udane zastosowanie "ortotopowego modelu raka piersi" opiera się na prawidłowym wstrzykiwaniu komórek do poduszeczki tłuszczowej sutka. Błędy eksperymentalne, takie jak nieprecyzyjna inokulacja komórek lub nieszczelność, mogą prowadzić do różnic w wielkości guza, a nawet do braku guza, co prowadzi do powstania struktury wyglądającej podobnie do poduszeczki tłuszczowej sutka, której wstrzyknięto bufor kontrolny (ryc. 2A). Tempo wzrostu guza zależy od charakteru wstrzykniętej linii komórkowej i ogólnie można je zaobserwować przez skórę myszy (ryc. 2B). W przeciwieństwie do eksperymentów in vitro, tempo wzrostu komórek nowotworowych może nie być stałe w czasie in vivo (ryc. 2C). Z powodu niedotlenienia i braku składników odżywczych mogą powstawać obszary martwicze, które wpłyną na tempo wzrostu guza (ryc. 2D). Ponadto interesujący nas gen może wpływać na pewną fazę progresji raka (wczesną lub późną), dlatego w zależności od konfiguracji eksperymentalnej, wzrost guza może rozpocząć się szybko, ale spowolnić pod koniec lub odwrotnie.

Należy zachować ostrożność podczas procedury usuwania guza; rygorystyczne obchodzenie się z nim może wpłynąć na strukturę guza i prowadzić do problemów w analizie immunohistochemicznej. Obszar wokół guza może wykazywać duże naczynia, które powstają w wyniku przebudowy naczyń. Naczynia te odgrywają kluczową rolę w usuwaniu produktów przemiany materii i zaopatrują tkankę nowotworową w składniki odżywcze i tlen, ułatwiając w ten sposób wzrost guza (ryc. 2B). Powstawanie nowych naczyń krwionośnych (angiogeneza) można badać poprzez barwienie guza pod kątem markerów naczyniowych (tj. CD31, CD34).

Pobranie płuc w roztworze Bouina pomaga uwidocznić powierzchowne ogniska przerzutowe na płucach (Rysunek 3A). Ogniska można odróżnić od tkanki płucnej po bladym kolorze i są łatwe do wykrycia18. Przerzuty można wyrazić jako liczbę ognisk powstałych na powierzchni płuc. Jednak tworzenie ognisk jest zależne od linii komórkowej; Nieagresywne komórki powodują tylko mikroprzerzuty lub nie powodują ich wcale. Mikroprzerzuty można łatwo zidentyfikować za pomocą barwienia hematoksyną/eozyną na tkance płucnej zatopionej w parafinie (ryc. 3C).

Rysunek 1: Materiał i metody. (A) Sprzęt chirurgiczny wymagany do wstrzykiwania komórek raka piersi do poduszeczki tłuszczowej sutka. (B) Reprezentatywne zdjęcie przedstawiające odsłonięcie poduszeczki tłuszczowej sutka.

Rycina 2: Przegląd ortotopowego wzrostu guza piersi u myszy.(A) Kontrola pożywki lub (B) Ludzkie komórki raka piersi (MDA-MB-231) są wstrzykiwane do poduszeczki tłuszczowej sutka samicy myszy NSG. Myszy poddano eutanazji i zrobiono im zdjęcia. Guzy są oznaczone przerywanym okręgiem. Strzałka wskazuje poduszeczkę tłuszczową sutka. (C) Objętość guza mierzono suwmiarką przy użyciu następującego wzoru: objętość guza = 0,5 x długość x szerokość x szerokość. (D) Ogólna morfologia guza jest analizowana za pomocą barwienia H&E. I oznacza komórki naciekające, T oznacza komórki nowotworowe, a N oznacza obszar martwiczy. (Podziałka = 200 μm)

Rycina 3: Przerzuty guza do płuc.(A) Płuca myszy, którym wstrzyknięto ortotopowo komórki nowotworowe (MDA-MB-231). Inkubacja płuc w roztworze Bouina odsłania ogniska przerzutowe na płucach. (B) Płuca myszy kontrolnych, które przeszły ortotopowe wstrzyknięcie pożywki kontrolnej. Jak wyraźnie widać, te płuca kontrolne nie wykazują makroskopowych przerzutów. (C) Barwienie H&E pokazuje obszar przerzutowy w tkance płucnej. Wkładka pokazuje przegląd w małym powiększeniu tkanki płucnej zawierającej ognisko przerzutowe. przerywany prostokąt we wstawce jest reprezentowany na dużym panelu. Komórki nowotworowe są oznaczone białą przerywaną linią; Zwróć uwagę na większe i gęstsze jądra. (podziałka = 100 μm, biała podziałka = 20 μm)

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.