Ten raport opisuje metodę pomiaru aktywności larw Drosophila za pomocą TriKinetics Drosophila Activity Monitor. Urządzenie wykorzystuje wiązki podczerwieni do wykrywania ruchów do 16 pojedynczych zwierząt. Dane mogą być analizowane w celu przedstawienia parametrów ruchu, w tym szybkości i pozycji zwierząt w komorach testowych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Pomiar aktywności larw w monitorze aktywności Drosophila
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Larwy Drosophila są wykorzystywane w wielu badaniach behawioralnych, jednak nie jest dostępne proste urządzenie do pomiaru podstawowych parametrów aktywności larwalnej. Protokół ten wykorzystuje instrument często używany do pomiaru aktywności dorosłych, monitor aktywności TriKinetics Drosophila (MB5 Multi-Beam Activity Monitor) do badania aktywności larw. Przyrząd może monitorować ruchy zwierząt w 16 pojedynczych szklanych probówkach o średnicy 8 cm, wykorzystując 17 wiązek detekcyjnych w podczerwieni na probówkę. Oprogramowanie rejestrujące automatycznie zapisuje dane do komputera, rejestrując parametry, takie jak liczba ruchów, czasy wyzwolenia czujników i pozycje zwierząt w rurach. Dane mogą być następnie analizowane w celu przedstawienia ogólnej orientacji ruchowej i/lub preferencji pozycji, a także innych pomiarów. Wszystkie dane są łatwo dostępne i kompatybilne z podstawowym oprogramowaniem do tworzenia wykresów i manipulacji danymi. W protokole tym omówione zostanie, jak korzystać z aparatury, jak obsługiwać oprogramowanie i jak przeprowadzić test aktywności larwalnej od początku do końca.
Wprowadzenie
Użycie Drosophila jako narzędzia genetycznego zmieniło wiedzę naukową o systemach biologicznych. Larwy Drosophila były wykorzystywane w różnych badaniach, w tym nad nocycepcją1, rozwojem2 oraz jako model do badania genów chorób u ludzi3. Aktywność Drosophila obejmuje szereg zachowań, które różnią się w zależności od warunków, w tym temperatur2 , ekspozycji na leki4 i między różnymi genotypami. Jednak pomimo znacznego wykorzystania larwy jako organizmu modelowego, prosta, ustandaryzowana metoda analizy aktywności larw nie jest dostępna. Obecnie w wielu badaniach lokomocji larw wykorzystuje się zaawansowane oprogramowanie do analizy wideo5. Złożoność takich zautomatyzowanych narzędzi, choć potężna, może zniechęcić laboratoria, które nie są jeszcze wyposażone do badania lokomocji, do włączania analizy parametrów aktywności informacyjnej do swoich badań. W innych obecnych metodach niezautomatyzowanych, takich jak analiza pełzania po siatce, ruch jest oceniany przez ludzkiego obserwatora, co wprowadza możliwość subiektywizmu i ogranicza przepustowość do jednego zwierzęcia na raz6-7. W podobnym badaniu wykorzystano 5-pasmowy test pełzania, który mierzył czas potrzebny larwom na pokonanie określonej odległości liniowej8. W takich niezautomatyzowanych testach mierzy się przemieszczenie, ale nie uwzględnia to nieliniowego ruchu między punktem początkowym i końcowym. Jak omówiono poniżej, opisana tutaj metoda odpowiada za większą część rzeczywistego ruchu larw, jest obiektywna, łatwa w obsłudze i oferuje solidną przepustowość.
Aby łatwo badać aktywność larw bez kompromisu w zakresie dokładności, wydajności czy kosztów, ta metoda wykorzystuje TriKinetics Drosophila Activity Monitor (DAM), urządzenie często używane do badania aktywności dorosłych. Wykorzystanie jednego urządzenia do badania aktywności zarówno osobników dorosłych, jak i larw jest opłacalne i umożliwia bezpośrednie porównanie ruchów zwierząt na tych dwóch etapach życia. System, charakteryzujący się najwyższym poziomem rozdzielczości producenta, wykorzystuje 17 wiązek detekcyjnych w podczerwieni na probówkę, które rejestrują aktywność larw, gdy wiązki czujników są przerywane w 16 pojedynczych probówkach. Następnie system automatycznie zapisuje zarejestrowane informacje na komputerze, udostępniając je do manipulacji za pomocą podstawowego oprogramowania do tworzenia wykresów. Uzyskane dane reprezentują promienie, które zostały przerwane przez poszczególne larwy (które można przeliczyć na szybkość), ruch, gdy larwa pozostaje w promieniu detektora oraz pozycję zwierząt w komorach testowych w okresie rejestracji (co pozwala na obliczenie preferencji pozycji). System jest wydajny i stosunkowo prosty w obsłudze, a także zapewnia wysoce powtarzalną analizę aktywności podstawowej w zasięgu każdego laboratorium badającego larwy Drosophila.
Aby zademonstrować moc tego testu, przedstawiono dane, które pokazują jego użycie do weryfikacji różnic w aktywności wynikających z różnych temperatur otoczenia, a także poprzez porównanie mutanta wcześniej opisanego jako hipoaktywny (iav1)9 z szeroko analizowaną kontrolą (w1118).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie larw
- Aby przeanalizować pożądaną larwę pod kątem lokomocji lub preferencji pozycji, hoduj larwy w standardowych warunkach do pożądanego wieku, aby oznaczyć10 przy użyciu standardowego pokarmu dla much11.
- Wykonaj filtr siatkowy, rozciągając siatkę nylonową z sitodruku na lejku. Zabezpiecz siatkę na szyjce lejka gumką. Umieść lejek w zlewce.
- Aby zebrać larwy do analizy, nabierz szpatułkę pełną pokarmu zawierającego larwy żerujące z butelki hodowlanej i przemyj filtr siatkowy wodą z kranu RT, zbierając pojedyncze larwy bezpośrednio z siatki za pomocą pędzla10.
2. Przygotowanie probówek do testów
- Aby przygotować się do zatkania probówek, ostrożnie zagotuj 4% żel agarowy i wlej na szalkę Petriego na głębokość 1,5 cm. Zapewni to zatyczkę po obu stronach rurki, gdy zwierzę jest zamknięte. 4% roztwór jest wystarczająco gęsty, aby zapobiec przedostawaniu się larw do zatyczek.
- Upewnij się, że rurki są czyste i przejrzyste przed włożeniem larwy. Jeśli tak nie jest, może to uniemożliwić rejestrowanie ruchów.
- Aby zapewnić larwom wystarczającą ilość wilgoci do poruszania się, przygotuj butelkę do wyciskania zawierającą niewielką ilość gorącej wody. Odwróć butelkę, ostrożnie skieruj wylot w stronę zlewu i delikatnie ściśnij, aby usunąć wodę z rurki odbiorczej.
- Włóż wylot butelki do probówki testowej. Ściśnij butelkę, aby dostarczyć parę wodną do probówki testowej, aż na ściance probówki pojawi się cienka warstwa kondensacji. Wideo 1 pokazuje larwę poruszającą się w rurce z odpowiednią ilością wilgoci.
- Aby zamknąć larwę w probówce, usuń żel agarowy o grubości 1,5 cm z szalki Petriego i umieść go na powierzchni siatki, aby umożliwić przepływ powietrza pod agarem, tak aby można było włożyć korek agarowy do probówki. Wcisnąć dwukrotnie jeden koniec probówki testowej do żelu, aby włożyć dwie zatyczki żelu do jednego końca.
- Za pomocą pędzla umieść jedną larwę w probówce na głębokość około 1,5 cala i uszczelnij probówkę, wciskając koniec najbliższy larwie do żelu agarowego. Powstałe ciśnienie wypchnie drugi korek żelu agarowego z przeciwległego końca i uszczelni zwierzę w probówce.
- Umieść rurki w urządzeniu MB5 Multi-Beam Drosophila Activity Monitor (DAM) i dostosuj położenie rurek tak, aby zwierzęta nie mogły wyjść poza zasięg czujników.
- Aby upewnić się, że probówki testowe nie wysuwają się z ramki odczytu podczerwieni urządzenia podczas transportu, należy przytrzymać probówkę na miejscu, mocując pierścień szpachli wokół każdej probówki w miejscu, w którym styka się z urządzeniem rejestrującym.
3. Pomiar aktywności
- Rejestruj aktywność w inkubatorze, aby zapobiec niedokładnym odczytom, które mogą wystąpić z powodu cieni, lamp fluorescencyjnych lub zmian temperatury w laboratorium. Na rysunku 5 przedstawiono sugerowany układ systemu.
- Ustawić inkubator na temperaturę 20 °C (patrz rysunek 1). Aby uniknąć fałszywych nagrań spowodowanych zakłóceniami powodowanymi przez żarówki podczas nagrywania, wyłącz lampy fluorescencyjne inkubatora i użyj oddzielnego źródła światła LED podczas nagrywania w inkubatorze. Przeprowadź próbę bez udziału zwierząt, aby upewnić się, że warunki oświetleniowe nie powodują nieprawidłowego działania czujników. Po tym teście nie powinny być rejestrowane żadne dane dotyczące ruchu.
- Pozwól larwom zaaklimatyzować się w warunkach inkubatora w temperaturze 20°C na 5 minut przed rozpoczęciem testu.
- Aby ustawić system DAM na żądane interwały nagrywania (np. 1 minuta), upewnij się, że oprogramowanie do nagrywania systemu DAM zostało pobrane na komputer hosta12 i otwórz plik systemu DAM przed podłączeniem komory nagrywania do interfejsu PSIU.
- Aby ustawić żądaną częstotliwość nagrywania, z jaką dane będą zapisywane, wybierz preferencje, a następnie kliknij powyżej lub poniżej opcji interwału odczytu, aby wybrać różne przedziały czasowe, w których dane będą przechowywane. Na przykład wybierz czas interwału czytania od 1 sekundy do 1 godziny.
- Aby wybrać zmienny parametr do rejestrowania danych, wybierz preferencje, a następnie zaznacz odpowiednie pola w obszarze typu danych wyjściowych (liczby, przesunięcia, pozycje i zatrzymanie, patrz Tabela 1). Każdy parametr zapewnia unikalną analizę aktywności larwalnej w probówce.
- Aby rozpocząć nagrywanie, podłącz monitor do modułu interfejsu zasilacza (PSIU) za pomocą telefonicznego CAB6. Podłącz zasilacz PSIU do gniazdka elektrycznego. Zielone światło wskaże prawidłowe połączenie.
- Podłącz zasilacz PSIU za pomocą uniwersalnej magistrali szeregowej (USB) do komputera Macintosh lub komputera z systemem Windows w celu nagrywania danych. Otwórz program DAM SystemMB1v6x na komputerze, aby automatycznie rozpocząć nagrywanie danych.
- Po upływie żądanego czasu zbierania wybierz opcję Zakończ, a następnie Zakończ teraz na ekranie aktywności DAM; dane zostaną automatycznie zapisane w obszarze Dane systemowe DAM. Weź ten plik danych (np. monitor 1) i przeciągnij go do osobnego folderu. Spowoduje to zapisanie surowych danych z oprogramowania DAM, aby można je było później przetworzyć.
4. Przygotowanie danych do przetwarzania (DAM FileScan)
- Aby przetworzyć surowe dane do zrozumiałego formatu, otwórz aplikację DAM FileScan i wybierz opcję Wybierz folder danych wejściowych. Następnie wybierz folder danych i żądany plik, a następnie wybierz opcję skanowania. Na koniec wybierz długość pojemnika do żądanego okresu odczytu. Spowoduje to uporządkowanie surowych danych w parametry ustawione przez operatora, a program będzie raportował dane zebrane w tym konkretnym zakresie.
- Wybierz typ danych wyjściowych, aby przeanalizować żądane ustawienie ruchu (monitorowanie liczb, ruchów, zatrzymania). W menu dodatkowych odczytów wybierz sumę do przedziału (dzieje się tak, jeśli długość przedziału jest większa niż wybrany interwał odczytu systemu).
- Nazwij plik odpowiednio i zapisz. Plik będzie przechowywany w tej samej lokalizacji, co folder z kroku 3.9.
5. Dostęp do danych do analizy
- Aby zebrać średnie ruchy, przetwórz surowe dane wygenerowane w kroku 4. Aby wygenerować tabelę w programie do obsługi arkuszy kalkulacyjnych, otwórz plik, który został wcześniej zapisany (krok 4.3), a gdy pojawi się okno kreatora importu tekstu, wybierz opcję Zakończ, aby otworzyć pliki danych w formacie arkusza kalkulacyjnego.
Uwaga: W zależności od analizowanego typu danych arkusz kalkulacyjny będzie odczytywany w różny sposób. Zazwyczaj, aby zmierzyć ruchy lub zliczenia monitora, okres badania będzie rejestrowany numerycznie, a każda pojedyncza rurka odczytu otrzyma wyznaczoną literę. Podczas przeglądania danych w arkuszu kalkulacyjnym kolumny K-Z reprezentują odpowiednio miejsca dla probówek testowych 1-16. Wiersze reprezentują zebrane punkty danych. - Na przykład, jeśli ruchy były zbierane przez 20 minut w odstępach 1-minutowych, uśrednij 20 wierszy, aby obliczyć średnią liczbę ruchów na minutę i inne pomiary.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Rycina 1 przedstawia wyniki badania odpowiedzi termicznej kontrolnych larw trzeciego stadium, w1118, z wykorzystaniem urządzenia monitorującego w celu wykrycia różnic w lokomocji larw w siedmiu różnych temperaturach. Larwy przemyto i umieszczono w urządzeniu do pomiaru aktywności DAM zgodnie z powyższym opisem, a następnie umieszczono w inkubatorze ustawionym na żądaną temperaturę. Następnie pozwolono aparatowi na aklimatyzację do środowiska przez 5 min przed rozpoczęciem rejestracji. Lokomocj...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Na aktywność larw Drosophila wpływa wiele czynników, w tym genotyp8, wiek13 lati temperatura otoczenia2. Chociaż potężne metody wideograficzne zdolne do bardzo szczegółowej analizy zostały opracowane przeztych, którzy badają lokomocję5, ten poziom szczegółowości może być zbędny dla tych, którzy chcą określić podstawowe parametry aktywności. Opisana tutaj metoda wykorzystuje urządzenie, które jest dostępne w wielu laboratoriach, jest łatwe w obsłudze, generuje wysoce po...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez NIH P20GM103643 do I. Meng.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Monitor aktywności Drosophila, wielowiązkowy, 16 rurek, w tym przewody | TriKinetics Inc. | MB5 | |
| do monitora aktywności | TriKinetics Inc. | PSIU24 | |
| Szklane rurki 80 x 5 mm do monitora aktywności (100) | TriKinetics Inc. | PGT 5x80 | |
| DAMsystemMB1v6x Oprogramowanie do akwizycji danych dla Macintonsh OSX (Intel) | www.trikinetics.com | bezpłatne pobieranie | |
| oprogramowania DAMFileScan 108x dla komputerów Macintosh | www.trikinetics.com | free download | |
| USB software (PSIUdrivers.zip). | www.trikinetics.com | free download | |
| DAMSystem Notes 308 | www.trikinetics.com | free download | |
| Zeiss Stemi 2000C- Stereoskop | Mikroskop Spectra Services | SP-STEMI2000C-BS | |
| Dwutlenek węgla | Maine Oxy | anestezjologia | |
| Fly Pad | Genesee | 59-114 | powierzchnia do sortowania znieczulonych much |
| Mały pędzel malarski | Winsor & Newton | #2 ROUND | lub podobny, używany do sortowania znieczulonych much |
| Sitodruk siatkowy (160) | msj-gallery.com | SM160W63-3YD | użyty w tym protokole wynosił ~ 0,1 mm |
| Tegosept | Genesee | 20-258 | konserwant |
| Etanol (190proof) | Pharmco | 111000190 | używany do rozpuszczania Tegosept |
| 6 uncji Butelka z kwadratowym dnem (PP) | Genesee | 32-130 | |
| "Flugs" do plastikowych butelek na muchy | Genesee | 49-100 | |
| Fiolki Drosophila, szerokie (PS) | Genesee | 32-117 | |
| Flugs do szerokich plastikowych fiolek | Genesee | 49-101 | |
| Żółty odkiełkowana mączka kukurydziana | Złoty medal | ||
| Drosophila agar | LabScientific | FLY 8020 | |
| Drożdże piekarskie - Mąka Red Star | King Arthur | 1270 | |
| Cukier granulowany - Extra Fine | Domino |
Bibliografia
- Tracey, W. D. Jr, Wilson, R. I., Laurent, G., Benzer, S. painless, a Drosophila.gene essential for nociception. Cell. 113, 261-273 (2003).
- Ainsley, J. A., Kim, M. J., Wegman, L. J., Pettus, J. M., Johnson, W. A. Sensory mechanisms controlling the timing of larval developmental and behavioral transitions require the Drosophila.DEG/ENaC subunit. Pickpocket1. Dev. Biol. 322 (1), 46-55 (2008).
- Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila. melanogaster.and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacol. Rev. 63 (2), 411-436 (2011).
- Cattaert, D., Birman, S. Blockade of the central generator of locomotor rhythm by noncompetitive NMDA receptor antagonists in Drosophila.larvae. J. Neurobiol. 48 (1), 58-73 (2001).
- Caldwell, J. C., Miller, M. M., Wing, S., Soll, D. R., Eberl, D. F. Dynamic analysis of larval locomotion in Drosophila. hordotonal organ mutants. PNAS. 100 (26), 16053-16058 (2003).
- Nichols, C. D., Bechnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. J. Vis. Exp. (61), (2012).
- Godoy-Herrera, R. The development and genetics of digging behavior in Drosophila. arvae. Heredity. 56, 33-41 (1986).
- Sinadinos, C., Cowan, C. M., Wyttenbach, A., Mudher, A. Increased throughput assays of locomotor dysfunction in Drosophila. larvae. Journal of Neuroscience Methods. 203 (2), 325-334 (2012).
- Homyk, T., Sheppard, D. E. Behavioral mutants of Drosophila melanogaster. I. Isolation and mapping of mutations which decrease flight ability. Genetics. 87 (1), 95-104 (1977).
- Chattopadhyay, A., Gilstrap, A. V., Galko, M. J. Local and global methods of assessing thermal nociception in Drosophila. larvae. J. Vis. Exp. (63), e3837(2012).
- Model Organisms I: yeast, Drosophila and C. elegans. Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: https://www.jove.com/science-education-database/3/essentials-of-biology-1-yeast-drosophila-and-c-elegans (2015).
- Woods, J. K., Kowalski, S., Rogina, B. Determination of the spontaneous locomotor activity in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (86), e51449(2014).
- Troncoso, B., Godoy-Herrera, R., Waldo, M. The development of larval movement patterns in Drosophila). Heredity. 58 (1), 321-329 (1987).
- Helfrich, C., Engelmann, W. Circadian rhythm of the locomotor activity in Drosophila. melanogaster.and its mutants ‘sine oculis’ and ‘small optic lobes. Physiological Entomology. 8 (3), 257-272 (1983).
- Johnson, A. W., Carder, W. J. Drosophila, ociceptors mediate larval aversion to dry surface environments utilizing both the painless TRP channel and the DEG/ENaC subunit, PPK1. PLoS ONE. 7 (3), (2012).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
