Metody in vivo i ex vivo do badania przerzutowej kolonizacji raka jajnika struktur mlecznej w tkance tłuszczowej otrzewnej

W przeciwieństwie do większości guzów litych, przerzuty z surowiczego raka jajnika o wysokim stopniu złośliwości (HGSC) są ograniczone do jamy otrzewnej ¹. W związku z tym skuteczne terapie otrzewnowe mogą potencjalnie kontrolować lub eliminować HGSC. Obecnie standardowym podejściem terapeutycznym jest chirurgiczna cytoredukcja w połączeniu z chemioterapią ^1-3. Niestety, zdecydowana większość pacjentów doświadcza i ulega powikłaniom nawrotu choroby. Te ponure statystyki wskazują na potrzebę lepszego zrozumienia kolonizacji przerzutowej, procesu, w którym komórki rakowe lokalizują się, wykorzystują i proliferują w tkankach gospodarza, tworząc przerzuty ².

Sieć jest preferowanym wczesnym miejscem przerzutów HGSC ^4-7. W przeciwieństwie do innych komórek tłuszczowych otrzewnej, tkanka tłuszczowa zawiera niezwykłe struktury immunologiczne znane jako mleczne plamy, które zawierają komórki B, T i NK oraz makrofagi, które odgrywają kluczową rolę w homeostazie otrzewnej^8,9. Oprócz funkcji fizjologicznych odkryliśmy, że mleczne plamki odgrywają aktywną rolę w kolonizacji przerzutowej raka jajnika ⁴. W eksperymentalnych testach przerzutów SKOV3ip.1, CaOV3 i HeyA8 (człowiek) oraz ID8 (myszy; C57BL/6) komórki raka jajnika szybko stają się mlecznymi plamkami, co sugeruje, że komórki poruszają się w kierunku wydzielanego czynnika chemotaktycznego. Co ciekawe, komórki rakowe nie kolonizują otrzewnej tkanki tłuszczowej pozbawionej mlecznych plam (tj. gonad i tłuszczu macicznego) ⁴.

W celu zidentyfikowania mechanizmów regulujących kolonizację plamki mlecznej, zoptymalizowaliśmy modele ksenoprzeszczepów, które umożliwiają badanie zdarzeń komórkowych i molekularnych w trakcie kolonizacji przerzutowej ⁴. Szczególną zaletą opisanych tu podejść jest nacisk na architekturę i funkcję tkanek, co umożliwia użytkownikom testowanie hipotez w pełni zintegrowanych modelach kolonizacji przerzutowej in vivo i ex vivo ^4,10. Porównując lokalizację i wzrost komórek rakowych w magazynach tłuszczu otrzewnej, które zawierają lub nie zawierają mlecznych plamek, badacze mogą przetestować względny wkład adipocytów i komórek w plamkach mlecznych w zaleganie i postępujący wzrost komórek raka jajnika w fizjologicznie istotnych tkankach.

Wszystkie myszy były trzymane, utrzymywane i poddawane eutanazji zgodnie z wytycznymi Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) i pod nadzorem University of Chicago Animal Resource Center.

1. Przygotowanie zwierząt do badań eksperymentalnych

1. Umożliwienie zwierzętom zaaklimatyzowania się w nowym pomieszczeniu i środowisku, w celu odzyskania sił po potencjalnych fizjologicznych skutkach transportu i obchodzenia się z nimi.
   Uwaga: Poniższa technika ma zastosowanie do wszystkich dostępnych na rynku szczepów myszy. Liczba zwierząt, które mają być wykorzystane w doświadczeniu, zależy od projektu badania i powinna być dokonana po konsultacji ze statystykiem.

2. Identyfikacja i izolacja otrzewnowych magazynów tłuszczu.

1. Eutanazja zwierząt poprzez przedawkowanie CO₂ i wtórną metodę fizyczną w celu potwierdzenia śmierci.
2. Ponieważ pobieranie zapasów tłuszczu otrzewnowego stanowi usunięcie narządów wewnętrznych (metoda wtórna), należy wykonać nacięcie w linii środkowej w pobliżu brodawek pachwinowych przez ścianę otrzewnej, aby odsłonić narządy wewnętrzne (ryc. 1A).
3. W przypadku tłuszczu omentalnego (OM) należy odsłonić kompleks omentalno-trzustkowy, rozciągając śledzionę z jamy otrzewnej za pomocą kleszczy (ryc. 1C). Uwolnij sieć z trzustki i śledziony, ściśle przycinając wszystkie połączenia tkankowe. Upewnij się, że pozostała tkanka trzustki została wycięta ⁴.
4. W przypadku tłuszczu gonad (GF) użyj kleszczy, aby podnieść tłuszcz gonadalny otaczający jajniki i wyciąć, przecinając połączenia tkankowe (ryc. 1A górna prawat) ⁴.
5. W przypadku tłuszczu macicznego (UF) użyj kleszczy, aby podnieść tłuszcz maciczny otaczający rogi macicy i wyciąć, przecinając połączenia tkankowe (ryc. 1A na dole po prawej) ⁴.
6. W przypadku tłuszczu krezkowego (MF) przetnij połączenie między jelitem cienkim a odźwiernikiem. Użyj kleszczy, aby mocno chwycić wolny koniec jelita cienkiego i powoli "oderwij" go od tłuszczu krezkowego. Uwolnij tłuszcz krezkowy z korzenia krezki za pomocą nożyczek preparacyjnych (ryc. 1A w lewym dolnym rogu) ⁴.
7. W przypadku tłuszczu splenoportalu (SF) podnieś dystalny koniec śledziony za pomocą kleszczy, aby odsłonić cienki pas tłuszczowy tkanki łączącej wnękę śledziony z trzustką. Wytnij tłuszcz splenoportal, najpierw uwalniając go z trzustki, a następnie ostrożnie wycinając go ze śledziony (ryc. 1B) ⁴.

3. Identyfikacja plamki mlecznej za pomocą barwienia Giemsa

1. Odetnij omenta (patrz krok 2.3) od myszy C57BL/6 i utrwal w 5% neutralnej buforowanej formalinie w temperaturze 4 °C przez 16 godzin (O/N).
2. Do zatapiania parafiny w utrwalonej tkance wybierz formę odpowiednią do wielkości tkanki. Wlej stopioną parafinę ze zbiornika parafiny, aby wypełnić formę. Otwórz kasetę i za pomocą ciepłych kleszczyków przenieś tkankę do formy.
   1. Ostrożnie zorientuj tkanki podczas zatapiania parafiny, aby uzyskać przekroje podłużne. Umieść opisaną kasetę z chusteczkami na formule i mocno dociśnij. Pozostaw formę do ostygnięcia na co najmniej 30 minut.
3. Wyciąć odcinki szeregowe (o grubości 4 μm) z bloku tkanki zatopionej w parafinie utrwalonej w formalinie (FFPE). Umieść wstępnie oczyszczone szkiełko pod sekcjami, gdy wstęga tkanki schodzi z bloku parafiny.
4. Kolejno pociąć całą sieć na sekcje; zebrać i zabarwić co trzeci skrawek na plamę Giemsa (patrz 3.6). Pozostaw szkiełko z sekcjami do wyschnięcia na powietrzu, najlepiej O/N przy RT. Wysuszone szkiełka są gotowe do mocowania. Wybarwić pierwszą sekcję na hematoksylinę i eozynę w celu porównania ze szkiełkami barwionymi metodą Giemsa.
5. Odparafinować szkiełka przez dwie sekwencyjne 5-minutowe inkubacje w ksylenach. Preparaty do ponownego uwodnienia przez dwie sekwencyjne inkubacje w następujących: 100% etanolu, 95% etanolu i na koniec wody z kranu.
   1. Podejmij odpowiednie środki ostrożności, aby zapobiec wyschnięciu szkiełek. Wykonaj wszystkie kroki w RT.
6. Całkowicie zanurzyć szkiełka w słoiku Coplin zawierającym 5% roztwór Giemsa (w/v przygotowany w wodzie z kranu) i inkubować przez 4 minuty w temperaturze pokojowej. Szkiełka należy płukać w wodzie z kranu przez 60 sekund, wysuszyć na powietrzu i zamontować z szkiełkiem nakrywkowym za pomocą podłoża montażowego.
7. Zobrazuj poplamione szkiełka za pomocą skanera Whole Slide Scanner i przetwarzaj za pomocą oprogramowania producenta. Określ ilościowo objętość plamki mlecznej w wybarwienych przez Giemsę skrawkach omentalnych za pomocą oprogramowania ImageJ⁴.

4. Namnażanie i przygotowanie komórek raka jajnika do badań in vivo i ex vivo

1. Podgrzać 15 ml pożywki do wzrostu komórek do temperatury 37 °C w łaźni grzewczej. Przygotować kolbę do hodowli tkankowych o odpowiedniej wielkości (np. o powierzchni 75^cm2), na której należy umieścić etykietę z nazwą linii komórkowej, numerem pasażu, datą i osobą, która przygotowała zamrożony bulion oraz datą i osobą, która rozmraża/posiewa komórki.
   Uwaga: W badaniach nad przerzutami tak szczegółowe informacje są kluczowe, ponieważ data zamarznięcia i liczba pasaży mogą wpływać na fenotyp przerzutów.
2. Korzystając ze sterylnego środowiska biologicznego kaptura bezpieczeństwa, odpipetować 10 ml pożywki do kolby hodowlanej T-75. Wyjąć fiolkę z komórkami z systemu ciekłego azotu i sprawdzić etykietę, aby potwierdzić typ komórek. Rozmrażać tylko jedną fiolkę z komórkami na raz, ogrzewając ją w łaźni grzewczej o temperaturze 37 °C.
3. Stosując sterylną technikę, pipetować^{1x10 6} rozmrożonych komórek do kolby hodowlanej. Umieścić kolbę w inkubatorze, aby umożliwić przyczepienie się komórek. Delikatnie kołysz kolbą w przód i w tył, aby utworzyć jednolitą zawiesinę komórek.
   1. Umieścić kolbę w inkubatorze do hodowli tkankowych i utrzymywać w temperaturze 37 °C w środowisku o stężeniu 5% CO_{2 .} Pozwól komórkom przylegać do O/N.
4. Odessać pożywkę i zastąpić świeżą, wstępnie podgrzaną pożywką wzrostową. Umieścić kolbę w inkubatorze i pozwolić komórkom rosnąć. Codziennie monitoruj wzrost komórek poprzez oględziny co 2-3 dni za pomocą odwróconego mikroskopu. Użyj standardowych technik hodowli komórkowych, aby przejść komórki po osiągnięciu 70-80% konfluencji.
   Uwaga: W przypadku testów eksperymentalnych należy zebrać komórki przy 70% zbiegu, aby upewnić się, że komórki aktywnie się rozmnażają.
5. Odessać pożywkę hodowlaną i przepłukać 10 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Odessać PBS i dodać 0,25% trypsyny/EDTA (2 do 3 ml na powierzchnię 75^cm2) i inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C. Wizualnie potwierdzić, że komórki się odłączyły i dodać równą objętość pożywki wzrostowej, a następnie delikatnie pipetować komórki w górę i w dół, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki.
   Uwaga: Bardzo ważne jest, aby pożywka wzrostowa zawierała surowicę, ponieważ dezaktywuje trypsynę. Przygotuj co najmniej 2 do 4 razy więcej komórek niż liczba wymagana dla danego eksperymentu, aby skompensować utratę komórek podczas kolejnych etapów
6. Określić procent żywotnych komórek w zawiesinie za pomocą testu wykluczania błękitu trypanowego przy użyciu hemacytometru lub automatycznego licznika komórek.
   Uwaga: Tutaj używaj tylko preparatów komórkowych, w których ≥ 96% komórek jest zdolnych do życia.
7. Przenieść zawiesinę komórek z kolby do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Komórki osadu przez odwirowanie 5 minut w temperaturze 1 100 x g, w temperaturze 4 ^oC.
8. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w PBS do stężenia 2x10⁶ komórek na ml.

5. Dootrzewnowe wstrzykiwanie komórek

Uwaga: W naszych eksperymentach, myszy są poddawane laminarnemu przepływowi powietrza lub komorze bezpieczeństwa biologicznego w naszym obiekcie barierowym, aby ograniczyć ryzyko ekspozycji na patogeny, Aby wyraźnie zademonstrować tę technikę, procedury opisane w załączonym filmie zostały przeprowadzone w laboratorium zatwierdzonym do pracy na zwierzętach. Ta konkretna technika nie wymaga od zwierząt znieczulenia. Zgodnie z zatwierdzonymi protokołami należy wykonywać tę technikę na żywych zwierzętach. Do tego badania należy użyć odpowiednich szczepów myszy. Na przykład: użyj nagich myszy z obniżoną odpornością do badania kolonizacji ludzkich komórek raka jajnika (SKOV3ip.1 i HeyA8); użyć immunokompetentnych myszy C57BL / 6 do badania kolonizacji mysich komórek raka jajnika (ID8).

1. Umieścić 500 μl zawiesiny jednokomórkowej do strzykawki i umieścić w sterylnej igle o masie 25 G. Zmniejsza to ścinanie komórek przed wstrzyknięciem.
2. Podnieś mysz za kark i przytrzymaj ogon za pomocą dłoni i palca wskazującego, a następnie umieść lewą tylną nogę między palcem serdecznym a małym (gdy mysz jest skrępowana lewą ręką).
   Uwaga: Aby uniknąć urazów narządów jamy brzusznej, należy dobrze przytrzymać mysz, aby nie mogła się poruszać podczas wstrzyknięcia.
3. Wyobraź sobie linię w poprzek brzucha tuż nad kolanami i zlokalizuj punkt po prawej stronie zwierzęcia i blisko linii środkowej. Punkt wejścia znajduje się w czaszce i lekko przyśrodkowo w stosunku do ostatniego sutka.
   Uwaga: Włożenie igły po prawej stronie myszy pozwala uniknąć jelita ślepego i zmniejsza ryzyko przebicia jelit¹¹.
4. Wbić igłę w dolną boczną część brzucha myszy na głębokość około 0,5 cm. Pociągnąć tłok do tyłu, aby upewnić się, że igła nie przebiła naczynia krwionośnego lub innych narządów otrzewnej.
   1. W przypadku zassania płynu należy wyrzucić strzykawkę (i próbkę)¹¹. Zielonkawo-brązowy lub żółty aspirat wskazuje odpowiednio na penetrację igły odpowiednio do jelit lub pęcherza.
5. Wstrzykiwać próbkę pod powolnym, stałym ciśnieniem. Wyjmij igłę i umieść mysz z powrotem w klatce. Nie zamykać strzykawki przed umieszczeniem jej w pojemniku na ostre przedmioty.
6. Ofiaruj myszy poprzez uduszenie CO₂ i usunięcie ważnych narządów w określonych punktach czasowych po wstrzyknięciu.

6. Kolonizacja plam mlecznych In vivo

1. Kwantyfikacja lokalizacji komórek rakowych w plamach mlecznych za pomocą cytometrii przepływowej
   1. Wyizoluj magazyny tłuszczu otrzewnowego od myszy (jak opisano w kroku 2.3 - 2.7), którym wstrzyknięto fluorescencyjnie znakowane komórki rakowe i natychmiast umieść tkanki w lodowatym PBS.
      1. W przypadku tej konkretnej techniki dopasuj wagę całej tkanki tłuszczowej tłuszczu do sieci tłuszczowej. Przenieść tkanki do oddzielnych probówek o pojemności 5 ml zawierających 1,5 ml DMEM bez surowicy i 0,1% (w/v) albuminy surowicy bydlęcej. Tkanki zbiorcze pobrane od trzech niezależnych myszy w celu zapewnienia wystarczającej ilości komórek do cytometrii przepływowej.
   2. Zmielić tkanki za pomocą nożyczek chirurgicznych i dodać 1,5 ml DMEM bez surowicy zawierającego 0,4% (w/v) kolagenazy I. Inkubować zawiesinę tkankową w temperaturze 37 °C przez 30 minut z mieszaniem rotacyjnym.
      1. Jako opcjonalny krok, dalsze odłączenie tkanki przez przeżuwanie. W takim przypadku przenieś zawiesinę kolagenazy tkankowej do worka mikrostomachera, przeżuwaj przez 10 minut na niskim poziomie, obracając orientację worków po 5 minutach.
   3. Przefiltruj próbki przez nylonowy filtr siatkowy (pory 60 μm), aby usunąć większe zanieczyszczenia. Zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 250 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić frakcję sklarowaną nad osadem.
   4. Zawiesić osad komórkowy w 100 μl PBS w połączeniu z 900 μl buforu do lizy ACK i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 min. Odwirować komórki przy 250 x g przez 5 min i odrzucić supernatant.
      1. Zawiesić osad komórkowy w 250 μl lodowatego PBS. Przefiltruj próbki przez nylonową siatkę o porach 60 μm, aby zapewnić zawiesinę pojedynczej komórki. Przepłucz filtr 250 μl lodowatego PBS.
   5. Określ ilościowo liczbę fluorescencyjnie znakowanych komórek w populacji za pomocą cytometru przepływowego wyposażonego w żółto-zielony laser o długości 561 nm i filtr pasmowoprzepustowy 585 nm/15 nm. Ustawić bramkę dla komórek tdTomato-dodatnich na podstawie analizy komórek rodzicielskich i/lub odpowiednich kontroli ujemnych ⁴.
2. Kwantyfikacja przerzutów mikroskopowych i makroskopowych
   1. Przy pożądanym eksperymentalnym punkcie końcowym (punktach końcowych) wyizolować i natychmiast umieścić tkanki w odpowiednim pożywce utrwalającej. Utrwal większe próbki, takie jak nienaruszone magazyny tłuszczu gonadalnego, macicznego i krezkowego w 10% neutralnej buforowanej formalinie przez 48 godzin w 4 °C. Utrwal mniejsze próbki (tłuszcz omentalny i splenoportalowy, a także tkankowe odpowiedniki tłuszczu macicznego i krezkowego) w 5% neutralnej buforowanej formalinie w temperaturze 4 °C przez 2-16 godzin.
      1. Alternatywnie, zatrzaskowo zamroź tkanki, umieszczając je w pożywce zamrażającej, takiej jak OCT i wrzuć do odpowiedniej ilości ciekłego azotu.
   2. Przenieść utrwalone tkanki do 70% etanolu i przechowywać w temperaturze 4 °C aż do zatopienia w parafinie. Osadzać i przetwarzać tkankę zgodnie z opisem w ppkt 3.2 i 3.3.
      1. Użyj wycinka barwionego H&E do oceny tkanek pod kątem obecności lub braku mikroskopijnych przerzutów (tj. skupisk 50 komórek). Potwierdź obecność mikroskopijnych przerzutów za pomocą metody wtórnej, takiej jak barwienie IHC dla cytokeratyny 8/18 w celu wykrycia komórek raka jajnika.

7. Kolonizacja mlecznej plamki ex vivo

1. Ustalenie podstawowych warunków hodowli narządów ex vivo
   1. Umieścić każdą sieć w pojedynczej wkładce płytki hodowlanej i umieścić w jednym dołku dwunastodołkowej płytki do hodowli tkankowej zawierającej 500 μl pożywki DME/F12 zawierającej 20% FCS. Hodowle narządów należy utrzymywać w temperaturze 37 °C w środowisku o stężeniu 5% CO₂ przez 24 do 48 godzin i/lub dodatkowe punkty czasowe. Należy użyć trzech niezależnych omentów (potrójnych próbek) dla każdego warunku (np. rodzaju podłoża/punktu czasowego).
   2. Aby potwierdzić integralność tkanek w eksperymentalnych punktach końcowych, należy utrwalić i przetworzyć próbki zgodnie z opisem w kroku 3. Liczenie zdrowych i martwiczych adipocytów na skrawkach H&E może ocenić integralność tkanek. Wymagane jest co najmniej ~120 komórek z 5 próbek biologicznych, aby sformułować procent żywej tkanki obecnej^{w 10}.
   3. Aby zmierzyć funkcję tkanki, umieść omenta (n = 3) w oddzielnych studzienkach 24-dołkowej płytki zawierającej 500 μl pożywki DME/F12 z 20% FCS. Pozostawić omenta do kondycjonowania pożywki w temperaturze 37 °C w środowisku 5% CO_{2 przez} 24 godziny, a następnie usunąć 250 μl do użycia w teście IL-6 ELISA¹⁰.
2. Wspólna hodowla ex vivo sieci myszy z komórkami SKOV3ip.1-GFP
   1. Wyhodować i przygotować fluorescencyjnie znakowane komórki, jak opisano w punkcie 4, a następnie zawiesić w stężeniu 2 ×^{10 6} komórek na ml.
   2. Nałóż ~6 μl kleju tkankowego na membranę wkładki hodowlanej i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Umyj membranę dwukrotnie sterylną wodą, aby usunąć nadmiar kleju. Wysuszyć membrany na powietrzu pod kapturem laminarnym.
   3. Ostrożnie wytnij omentę i przymocuj ją do membrany pokrytej klejem za pomocą sterylnych kleszczyków. Pozwól tkance przylegać do membrany przez 1 minutę przed dodaniem pożywki. Dodać 500 μl zawiesiny komórkowej na wierzch każdej sieci w każdej wkładce hodowlanej. Wypełnić obszar wokół komory transwell 2,5 ml DME/F-12 ¹⁰.
   4. Inkubować omentę z zawiesiną komórkową przez 6 godzin w temperaturze 37 °C w środowisku o stężeniu 5% CO_{2 .} Ostrożnie wyjmij i umyj omentę ~10 ml PBS. Wizualizacja ognisk fluorescencyjnych komórek rakowych za pomocą odpowiedniego systemu obrazowania fluorescencyjnego ¹⁰.

Identyfikacja i badanie histologiczne otrzewnowych magazynów tłuszczu

Szczegółowa analiza anatomiczna pozwala zidentyfikować cztery z pięciu głównych źródeł tłuszczu w otrzewnej (Rysunek 1A). Poruszając się zgodnie z ruchem wskazówek zegara od górnego środka są: sieć (OM; zarysowana) znajdująca się nad żołądkiem i śledzioną, tłuszcz gonadalny (GF) otaczający lewy jajnik (ov), tłuszcz maciczny (UF) przyczepiony do rogów macicy (uh) i krezka (MY) przyczepiona do jelita cienkiego (si). Jako punkty odniesienia wskazywany jest jajnik (ov), róg macicy (uh) i jelito cienkie (si). Tłuszcz śledzionowy (SP) otacza tętnicę śledzionową i łączy wnękę śledziony z tętnicą trzewną (ryc. 1B). Wreszcie sieć jest przyczepiona do żołądka i trzustki (ryc. 1C). Struktura ogólna i względna wielkość tych tkanek jest pokazana na rysunku 1D. Z badania histologicznego tkanek wynika, że splenoportal i tłuszcz omentalny zawierają struktury plamki mlecznej [MS] na obrzeżach tkanek, otoczone adipocytami [A]; tłuszcz maciczny, gonadalny i krezkowy nie (ryc. 1E).

Identyfikacja mlecznej plamki za pomocą barwienia Giemsa

Aby umożliwić porównanie ogólnej zawartości mlecznej plamki między różnymi szczepami myszy, objętość mlecznej plamki i obszar obecny w poszczególnych omentach zostały oznaczone ilościowo za pomocą nowatorskiej metody. Jak opisano w Methods, "cyfrowy cały montaż" omenty został skonstruowany poprzez barwienie co trzeciej sekcji tkanki w 5% roztworze Giemsa i uchwycenie obrazów barwionych tkanek (ryc. 2A). Mleczne plamy pojawiają się jako obszary zabarwiające się na ciemnoniebiesko (ryc. 2B). Tożsamość tych regionów jako mlecznych plam została potwierdzona w odcinkach seryjnych zarówno przez barwienie H&E, jak i IHC dla komórek dodatnich dla CD45, powszechnego markera limfocytów (odpowiednio figura 2C i D). Jak opisano w Clark i Krishnan i wsp.4, obrazy (ryc. 2A) zostały skompilowane i przetworzone w celu skonstruowania "cyfrowego całego wierzchowca", który można było następnie wykorzystać do obliczenia objętości i powierzchni mlecznej plamki w poszczególnych omentach.

Ilościowa i jakościowa ocena kolonizacji nowotworów sieci

Metoda oparta na cytometrii przepływowej została opracowana w celu ilościowego określenia liczby komórek rakowych obecnych w magazynach tłuszczowych po wstrzyknięciu dootrzewnowym. Protokół ten jest szczególnie przydatny do badania wczesnych etapów kolonizacji procesu przerzutowego. Na przykład na rysunku 3A przygotowano komórki ID8-tdTomato i wstrzyknięto je dootrzewnowo myszom C57BL / 6. Po 7 dniach od wstrzyknięcia (dpi) narządy tłuszczowe zostały pobrane i zdysocjowane do zawiesiny jednokomórkowej, jak opisano w metodach. Liczbę komórek tdTomato określono ilościowo za pomocą cytometrii przepływowej (ryc. 3A, po lewej). Sieć wykazała około 12-krotny wzrost liczby zdarzeń tdTomato-dodatnich w porównaniu z kontrolami, którym wstrzyknięto PBS (ryc. 3A, po prawej), ale nie było znaczącego wzrostu preparatów komórkowych z tłuszczu gonadalnego, tłuszczu macicznego lub krezki. Komplementarne jakościowe podejście oparte na IHC wykazało również, że 7 dni po wstrzyknięciu i.p. komórek SKOV3ip.1 zaobserwowano porównywalne zmiany w komórkach rakowych zarówno w tłuszczu omentalnym, jak i śledzionowym (Figura 3B). IHC dla ludzkiej pan-cytokeratyny (pan-CK) potwierdza obecność komórek rakowych w mlecznych plamach. Specyficzność barwienia IHC potwierdzono przy użyciu kontroli IgG dla przeciwciała pan-cytokeratyny (Figura 3B). Kolonizację ID8 rakiem jajnika w otrzewnowych magazynach tłuszczu oceniano przy użyciu myszy C57BL / 6 w temperaturze 7 dpi. Przedstawiono duże zmiany w komórkach nowotworowych w mlecznych plamach zarówno sieci tłuszczowej, jak i splenoportalu. Małe skupiska komórek rakowych były czasami obserwowane w innych magazynach tłuszczu, jak pokazano we wstawce panelu. W ten sposób można uzyskać dostęp zarówno do względnej liczby, jak i lokalizacji komórek w danej tkance.

Aby rozwiązać problemy związane z warunkami in vivo przy jednoczesnym zachowaniu składu i architektury tkanek, zoptymalizowaliśmy podejście ex vivo do badania kolonizacji komórek raka jajnika w tkankach omentalnych. Całe tkanki jajowe wycięte od myszy są z powodzeniem hodowane ex vivo w celu zbadania interakcji raka jajnika z plamkami mlecznymi. Komórki SKOV3ip.1-GFP wysiewano na tkankach omentalnych hodowanych ex vivo i utrzymywano w temperaturze 37 °C przez okres 6 godzin. Komórki fluorescencyjne GFP-dodatnie były widoczne w dyskretnych ogniskach zarówno w omentach ex vivo, jak i in vivo, zebranych 6 godzin po wstrzyknięciu komórek SKOV3ip.1-GFP (Figura 4A). W obu warunkach weryfikacja histologiczna przy użyciu barwienia H&E potwierdziła lokalizację komórek rakowych w mlecznych plamkach (Figura 4B). Barwienie potwierdzające przy użyciu barwienia cytokeratyną dla komórek rakowych wykazało obecność ognisk komórek rakowych w plamkach mlecznych (ryc. 4C). Dane te wskazują na możliwość wykorzystania podejść ex vivo w badaniach opartych na mechanizmach w celu uzupełnienia wyników in vivo.

Rysunek 1. Względne lokalizacje i struktury głównych magazynów tłuszczu otrzewnej. (A) Gruba sekcja anatomiczna pokazująca względne położenie czterech z pięciu głównych źródeł tłuszczu otrzewnowego. Pokazano sieć (OM; zarysowano), tłuszcz gonadalny (GF), tłuszcz maciczny (UF), krezkę (MY), jajnik (ov), rogi macicy (uh) i jelito cienkie (si). (B) Tłuszcz śledzionowy (SP; obrysowany) odsłonięty przez podniesienie śledziony kleszczami. (C) Pokazana sieć myszy została wycięta z trzustki w celu poprawy wizualizacji. Z wyłączenia: Względne rozmiary i struktury wyciętego tłuszczu otrzewnowego; Krezka jest pokazana przyczepiona do korzenia krezki. E. Ocena histologiczna tłuszczu otrzewnowego pod kątem obecności plam mlecznych (A) adipocytów, (MS) plamki mlecznej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ryc. 2. Oparte na Giemsie podejście do ilościowego oznaczania plam mlecznych w tkance jajowej. (A) Obraz przekroju całej sieci zabarwionej Giemsą. Seryjne skrawki tkanki omentalnej oceniane za pomocą: (B) barwienia Giemsa; Mleczne plamy są oznaczone czarnymi strzałkami. (C) barwienie H&E; oraz (D) IHC przy użyciu przeciwciała anty-CD45 do identyfikacji limfocytów w strukturze mlecznej plamki. Podziałka skali jest taka sama dla B-D i oznacza 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ryc. 3. Komórki raka jajnika preferencyjnie kolonizują tłuszcz otrzewnowy, który zawiera mleczne plamki. Analizy cytometryczne sieci (OM), tłuszczu z macicy (UF), tłuszczu gonadalnego (GF) i krezki (MY) pobranych od myszy w 7 dpi komórek ID8-tdTomato (po lewej). Dane są przedstawione jako wzrost zmiany fałdowej komórek tdTomato-postive w porównaniu z myszami, którym wstrzyknięto PBS (po prawej). Słupki błędu wskazują błąd standardowy średniej. ** oznacza p<0,01 w porównaniu z kontrolami PBS. (B) Badanie tkanek zarówno za pomocą standardowej histologii, jak i IHC wykazało porównywalną kolonizację mlecznych plam zarówno w sieci tłuszczowej, jak i splenoportalu (po wstrzyknięciu 1x106 komórek SKOV3ip.1 do myszy nago). Skrawki oceniano za pomocą barwienia H&E. Obecność komórek nabłonkowych (nowotworowych) w obrębie zmian została potwierdzona przez wykrycie cytokeratyny przez IHC za pomocą przeciwciała przeciwko pan-cytokeratynie (pan-CK). IHC wykorzystujący przeciwciało izotypu IgG dla pan-cytokeratyny zastosowano jako kontrolę swoistości barwienia. Podziałka skali jest taka sama dla wszystkich obrazów i oznacza 100 μm. (C) Ocena kolonizacji ID8 rakiem jajnika w otrzewnowych magazynach tłuszczu u myszy C57BL / 6 w 7 dpi. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4. Kolonizacja ex vivo komórek raka jajnika do sieci jajników.Kolumny reprezentują porównanie trzech warunków eksperymentalnych pokazujących naiwną omentę (po lewej), omentę od myszy 6 godzin po wstrzyknięciu i.p. 1 x 106 komórek SKOV3ip.1 (w środku) i omentę z SKOV3ip.1-GFP skolonizowaną w warunkach ex vivo (po prawej). Omenta naiwna (ślepa), omenta skolonizowana przez SKOV3ip.1-GFP z testu in vivo (przywiązanie in vivo) lub omenta skolonizowana przez SKOV3ip.1-GFP w warunkach hodowli ex vivo (przyłączenie ex vivo). Obrazowanie fluorescencyjne całej omenty w przypadku GFP wykazuje podobny wzorzec kolonizacji zarówno w testach in vivo, jak i ex vivo (A). Barwienie H&E seryjnych odcinków omenty z panelu A potwierdza obecność komórek nowotworowych zlokalizowanych w plamkach mlecznych (B). Cytokeratyna dla komórek raka jajnika potwierdza barwienie H&E (C). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.