Dokładne i wolne od fenolu określanie płci DNA zarodków świń w dniu 30 za pomocą PCR

Podsumowanie

Ten protokół opisuje dokładną, tanią, szybką i nietoksyczną metodę określania płci zarodka świni z dnia 30 za pomocą metody PCR po zmieleniu zarodka na proszek bez ekstrakcji chloroformem fenolowym i oczyszczania kolumny DNA.

Streszczenie

Badania nad programowaniem prenatalnym u świni wykazały, że płeć rozwijającego się zarodka lub płodu może wpływać na wynik rozwoju. Dlatego zdolność do określenia płci zarodka jest niezbędna w wielu eksperymentach, szczególnie dotyczących wczesnego rozwoju. Niniejszy protokół demonstruje niedrogie, szybkie i nietoksyczne przygotowanie genomowego DNA świni do stosowania z PCR. Zarodki dnia 30 muszą być pobierane w sposób humanitarny, zgodnie z wytycznymi ustanowionymi przez Instytucjonalne Komitety ds. Polityki i Dobrostanu Zwierząt dla niniejszego protokołu. Przygotowanie całego zarodka do tej techniki określania płci opartej na PCR polega po prostu na zmieleniu zamrożonego zarodka na drobny proszek za pomocą wstępnie schłodzonego moździerza i tłuczka. DNA o jakości PCR jest uwalniane z niewielkiej ilości proszku zarodkowego poprzez zastosowanie gorącej inkubacji w alkalicznym odczynniku do lizy. Następnie roztwór DNA miesza się z buforem neutralizacyjnym i stosuje bezpośrednio do PCR. Dwie pary starterów są generowane w celu wykrycia określonego regionu determinującego płeć chromosomu Y (SRY) i regionu ZFX chromosomu X z dużą dokładnością i swoistością. Ten sam protokół można zastosować do innych wydłużonych zarodków (od dnia 10 do dnia 14) przed dniem 30. Ponadto protokół ten może być przenoszony z 96-dołkowymi płytkami podczas badań przesiewowych dużej liczby zarodków, co umożliwia automatyzację i wysokoprzepustowe typowanie płci.

Wprowadzenie

Świnia domowa stała się podstawowym przedmiotem badań w zakresie rozwoju, genetyki i żywienia zarówno w sektorze ludzi, jak i zwierząt gospodarskich. Potencjał świń jako modeli biomedycznych do badań na ludziach można przypisać ich fizjologicznym podobieństwom. U zwierząt gospodarskich manipulacja stosunkiem płci może zwiększyć skuteczność programów selekcji i doskonalenia genetycznego¹. Określanie płci poszczególnych zarodków jest podstawowym narzędziem wykorzystywanym w wielu badaniach eksperymentalnych, w tym między innymi w genotypie, epigenetyce i inaktywacji dymorfizmu płciowego X we wczesnym okresie rozwoju zarodka².

Badania na myszach sugerują, że dieta matki i inne czynniki mogą powodować brak równowagi płci³. U świń przyczyny braku równowagi płci obejmują rasę ojcowską⁴, pojemność macicy⁵ i stan metaboliczny lochy⁶. Ponieważ na różnice obserwowane w zarodkach i miotach może mieć wpływ dymorfizm płciowy, naukowcy powinni być świadomi płci zarodka i proporcji płci przed wyciągnięciem wniosków dotyczących swoich badań. Opracowanie skutecznych narzędzi i protokołów do określania płci zarodków świń w 30 dniu rozwoju zostanie omówione tutaj.

Różne metody typowania płci zostały opracowane do badań genetycznych na organizmach modelowych i zwierzętach gospodarskich. Szczególnie w przypadku zwierząt gospodarskich identyfikacja wczesnych zarodków męskich i żeńskich jest bardzo powszechną praktyką mającą na celu poprawę selekcji genetycznej do programów hodowlanych. Do typowania płci zastosowano kariotypowanie wczesnych zarodków u świń przy użyciu techniki Giemsa⁷ lub intensywnej fluorescencji^8,9. Metody te są jednak czasochłonne i nie nadają się do szybkiego i dokładnego badania przesiewowego dużej liczby zarodków.

Najbardziej efektywną metodą typowania płci jest amplifikacja DNA przy użyciu stabilnej termicznie polimerazy DNA i pary starterów. Określanie płci DNA metodą PCR jest bardziej specyficzne, szybkie i czułe, wymaga jedynie niewielkiej ilości materiału komórkowego. Pierwsze określenie płci zarodków metodą PCR przeprowadzono na ludziach¹⁰, a następnie na myszach¹¹, bydle¹², bawołach¹³ i owcach¹⁴ zarodkach przedimplantacyjnych. U świń najwcześniejsza metoda typowania płci DNA została ustalona dla zarodków przed implantacją za pomocą pojedynczej pary starterów DNA specyficznych dla chromosomu Y¹⁵. Jednak najczęstsze startery PCR do określania płci zostały wybrane z chromosomu Y męskiego specyficznego genu SRY¹⁶ i niedyskryminującego płci regionu genu palca cynkowego zlokalizowanego zarówno na chromosomie X jak i Y¹⁷. Następnie startery te zostały zastosowane do określenia płci zarodków dnia 30 w tym badaniu z poprawioną specyficznością starterów w celu wykrycia tylko chromosomu X genu palca cynkowego.

Genomiczne DNA z zarodków przedimplantacyjnych świń można pobrać poprzez wystawienie nienaruszonej blastocysty na bufor z proteinazą K¹⁶ lub poprzez pobranie biopsji kilku komórek z poszczególnych zarodków wczesnego rozszczepienia¹⁵ i użycie ich do bezpośredniego PCR. Jednak uwolnienie DNA z krwi świni, włosów, tkanek lub dużego zarodka o wielkości ponad kilku centymetrów nie jest skutecznie przeprowadzane przy użyciu metody proteinazy K. Metody ekstrakcji DNA dla tych materiałów zostały ustalone przy użyciu czasochłonnych protokołów fenol/chloroform⁶ lub drogich zestawów opartych na kolumnach¹⁸. Aby uniknąć stosowania potencjalnie toksycznych chemikaliów, istnieje tendencja do opracowywania niedrogich, łatwych i wolnych od fenolu metod ekstrakcji DNA. Ten rodzaj protokołu izolacji genomowego DNA o jakości PCR z tkanek myszy¹⁹ i^{zebry 20} został opracowany przy użyciu gorącego wodorotlenku sodu i Tris (HotSHOT). Badanie to zapewnia protokół uzyskiwania DNA ze zmodyfikowanym HotSHOT i przeprojektowanymi parami starterów dupleksowych do typowania płci PCR bezpośrednio z lizatów komórkowych zarodków świń dnia 30 z dużą dokładnością.

Protokół

Zgodnie z wytycznymi Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami i za zgodą Wydziałowej Komisji ds. Polityki i Dobrostanu Zwierząt - Żywy Inwentarz Uniwersytetu Alberty, ciężarne lochy zostały poddane eutanazji przez przeszkolony personel około 30 dnia ciąży, a zarodki zostały pobrane. Przez cały czas trwania zabiegów należy używać rękawiczek do badań.

1. Pobieranie i przechowywanie próbek

1. Eutanazja lochy za pomocą w niewoli, a następnie wykrwawienie. Nosić rękawiczki do badań, aby pobrać drogi rozrodcze i zarodki od każdej lochy poddanej eutanazji.
   Uwaga: Szybkie pobranie próbek i przeniesienie zarodków do suchego lodu lub ciekłego azotu zaowocuje wyższą jakością tkanek do innych prac molekularnych, takich jak mikromacierze i qPCR.
2. Rozwarstwić macicę i delikatnie oddzielić wszystkie zarodki w obrębie ich pozaembrionalnych błon łożyskowych od leżącej poniżej ściany macicy²¹. Upewnij się, że nie ma zanieczyszczenia tkanek matki.
3. Rekordowa długość i waga wszystkich zdolnych do życia zarodków przed zamrożeniem.
4. Zbierz każdy pojedynczy zarodek i natychmiast zawiń go w folię aluminiową przed zamrożeniem ciekłym azotem.
5. Przenieść zamrożone zarodki z ciekłego azotu bezpośrednio do zamrażarki o temperaturze -80 °C.

2. Mielenie zarodków

1. Oznaczyć wszystkie probówki z próbkami (15 ml) identyfikatorem próbki potrzebnym do określenia liczby próbek, które mają być analizowane.
2. Napełnij pojemnik termiczny suchym lodem do połowy i włóż wstępnie oznaczoną probówkę z próbką do suchego lodu.
3. Noś rękawice zimowe z drugą parą rękawiczek do badań na wierzchu do przenoszenia wstępnie schłodzonych moździerzy i tłuczków z zamrażarki o temperaturze -80 °C do pojemnika na suchy lód.
4. Zamrożony zarodek umieścić w moździerzu na suchym lodzie.
5. Wlej odpowiednią ilość ciekłego azotu, aby przykryć zarodek i zmiel go tłuczkiem na drobny proszek.
6. Przenieść proszek z zarodków do wstępnie oznaczonej probówki z próbką za pomocą mikroszpatułki (ryc. 1) i umieścić probówkę w zamrażarce o temperaturze -80 °C.
7. Użyj czystego, wstępnie schłodzonego moździerza i tłuczka dla każdego zarodka, a po zmieleniu każdego zarodka zmień rękawiczki do badania, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego między próbkami.

3. Preparatyka genomowego DNA przy użyciu metody modyfikowanego wodorotlenku sodu

1. Oznaczyć wszystkie probówki do mikrowirówek (1,5 ml) potrzebne do określenia liczby próbek do analizy.
2. Przed rozpoczęciem przenieść probówki zawierające sproszkowane zarodki z zamrażarki w temperaturze -80 °C do pojemnika z suchym lodem.
3. Odpipetować 180 μl 50 mM NaOH (wodorotlenku sodu) do każdej wstępnie znakowanej probówki do mikrowirówki.
4. Włączyć inkubator i podgrzać do 95 °C.
5. Za pomocą wykałaczki przenieś odpowiednią ilość proszku zarodkowego (około 5-10 mg) (ryc. 2) z probówki z próbką do wstępnie znakowanej probówki mikrowirówkowej zawierającej 50 mM roztworu NaOH.
6. Powoli pociągnij tę samą wykałaczkę, aby uwidocznić lizat DNA jako lepką, lepką, białą przezroczystą substancję (ryc. 3).
7. Przenieść probówki do mikrowirówek z lizatem DNA do wstępnie ogrzanego inkubatora w temperaturze 95 °C na pięć minut. Natychmiast przenieś rurkę do styropianowego pudełka wypełnionego lodem.
8. Dodać 20 μl 1 M Tris-HCl bezpośrednio do probówki mikrowirówki i wymieszać, delikatnie stukając w probówkę. Użyj papieru pH, aby upewnić się, że pH wynosi około 8,0 (rysunek 4) przed odwirowaniem.
   Uwaga: W przypadku dużej liczby preparatów próbek dopuszczalne jest losowe wybranie kilku próbek w celu sprawdzenia pH.
9. Odwirować probówkę z lizatem DNA o stężeniu 2 000 x g w mikrowirówce przez dwie minuty w temperaturze pokojowej w celu usunięcia nierozpuszczonych resztek tkanek.
10. Przenieść 150 μl górnego klarownego supernatantu do nowej probówki lub 96-dołkowych płytek.
    Uwaga: Klarowny lizat DNA jest gotowy do użycia jako matryca w reakcji PCR i jest stabilny w temperaturze 4 °C przez dwa tygodnie lub może być przechowywany w temperaturze -20 °C przez rok.

4. Projektowanie starterów PCR specyficznych dla płci

1. Numery dostępu do regionu Y determinującego płeć świń (SRY) (NM_214452.3) oraz genów sprzężonych z białkiem palca cynkowego (ZFX) (XM_005673501.1) można uzyskać ze strony internetowej NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.
2. Skopiuj i wklej te numery dostępu NCBI do internetowego narzędzia do projektowania podkładów.
   Uwaga: Najlepsze informacje o starterach, w tym długość, Tm i GC%, a także rozmiar produktu PCR (bp), zostaną wygenerowane na ekranie komputera (Rysunek 5).
3. Zweryfikuj specyficzność tych starterów za pomocą programu nukleotydowego Blast (Blastn) w porównaniu z obecną bazą danych genomu świń 104, aby upewnić się, że sekwencje te znajdują się tylko na chromosomach X i Y odpowiednio dla SRY i ZFX (Figura 6).

5. Genomiczny DNA PCR bezpośrednio z lizatów DNA

1. Należy użyć tylko 1 μl lizatu DNA jako matrycy do 15 μl reakcji PCR.
   Uwaga: Wysokoprzepustową metodę przesiewowego PCR na płytkach 96-dołkowych można przeprowadzić w podobny sposób przy użyciu pipety wielokanałowej.
2. Wykonaj następujące czynności tylko dla pierwszego PCR: przygotuj jedną probówkę PCR do kontroli ujemnej bez matrycy i dwie dodatkowe probówki do kontroli dodatniej, dodając 1 μl (0,5 ng) uzyskanego w handlu genomowego DNA świni płci o znanej płci. Później dołącz próbkę z ostatniej udanej analizy płci jako kontrolę pozytywną i uruchom razem z nową reakcją PCR w celu określenia płci.
3. Użyj dowolnego gotowego enzymu PCR HotStart i przygotuj mieszankę główną, dodając startery i wodę wolną od nukleaz, w zależności od całkowitej liczby reakcji PCR. Dodać 1 μl lizatu DNA do istniejącej wcześniej probówki do PCR z 14 μl głównej mieszanki PCR. Dodaj startery tak, aby końcowe stężenie starterów z dwóch genów specyficznych dla płci wynosiło 0,3 μM w sumie 15 μl reakcji PCR.
4. Ustaw następujący program PCR w termocyklerze: 95 °C przez 3 minuty, 35 cykli każdy z 20-sekundowym etapem topnienia 98 °C, następnie 15-sekundowym etapem wyżarzania w temperaturze 65 °C, a następnie 15-sekundowym etapem wydłużania w temperaturze 72 °C. W końcowym etapie inkubować reakcje przez 1 minutę w temperaturze 72 °C i kontynuować inkubację w temperaturze 4 °C aż do wyjęcia probówki PCR w celu weryfikacji elektroforezy żelowej w celu określenia płci.
   Uwaga: Warunki PCR i optymalizacja są zgodne z instrukcją zestawu PCR wymienioną w tabeli materiałów.
5. Dodać odpowiednią ilość nietoksycznej zielonej, fluorescencyjnej barwie w żelu DNA SYBR podczas przygotowywania 2% żelu agarozowego TBE.
   Uwaga: Bromek etydyny można zastąpić barwnikiem o zielonej fluorescencji, jeśli nie jest dostępny.
6. Dodać 1,5 μl barwnika ładującego (10x) do probówki PCR i dobrze wymieszać, pipetując bufor reakcyjny PCR w górę iw dół.
7. Załadować 10 μl próbki do studzienki i uruchomić żel agarozowy z odpowiednimi ustawieniami napięcia (mały aparat żelowy przy 100 V, aparat 96-dołkowy żelowy przy 150 V, aż pasmo barwnika przejdzie przez połowę żelu).
8. Obserwuj i dostosuj intensywność pasm przy ustawieniu światła fluorescencyjnego za pomocą skanera laserowego i uchwyć obraz żelu. Uwaga: Zwykły żel do obrazowania żelu można zastąpić żelem bromkowym etydyny.
9. Określ płeć zarodków świń, identyfikując zarodki z jednym prążkiem jako samicą i dwoma prążkami jako samcem (ryc. 7).

Wyniki

Reprezentatywny wynik determinacji płci z 345 lizatów DNA metodą PCR jest pokazany na rysunku 7 i podsumowany w tabeli 1.

Jak widać na rysunku 7, temperatura wyżarzania starterów na poziomie 65 °C jest optymalnym warunkiem w tym protokole PCR, generującym podobną intensywność i przewidywane rozmiary amplikonów (Rysunek 5) wśród różnych próbek.

Dyskusja

Większość istniejących protokołów związanych z typowaniem płci DNA zarodków świń jest odpowiednia tylko dla wczesnego stadium przed implantacją^15,16. Udało nam się opracować protokół odpowiedni do badań przesiewowych zarodków świń w późnym okresie ciąży. Na podstawie badań z podobnymi etapami rozwoju zarodków z poprzednich badań^6,18, niniejszy protokół jest uważany za bezpieczniejszy i tańszy.

Protokół ten jest również odpowiedni dla dużej liczby próbek do typowania płci ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zestaw KAPA HiFi HotStart Ready Mix PCR	KAPABiosystems	KR0370	inna polimeraza Hot Start Taq może być stosowana po optymalizacji
SYBR Safe DNA Gel Stain	Life Technologies	S33102	Bromek etydyny można zastąpić SYBR Safe
Pig żeńskie i męskie genomowe DNA	Zyagen	GP-160-F1 i GP-160-M5	Można zastosować pozytywne kontrole z tkanek DNA znanej płci.
Skaner laserowy Typhoon FLA 9500	GE Healthcare Life Sciences	28-9969-43	można użyć innego systemu obrazowania
Bezpłatne miękkie nitrylowe rękawice do badań	WWR	89038-270	można użyć każdej innej rękawicy diagnostycznej
Wodorotlenek sodu, stały	Fisher	BP 359 -212	klasy biologii molekularnej
, 1,5 ml, PCR clean	Eppendorff	0030 108.051	żaroodporny
ThermoStat plus	Eppendorff	22670204	Używaj jako inkubator dla 95 i #176; C, nie musisz używać grzałki
Wykałaczka	Bunzl Plc	75200815	Można użyć dowolnych okrągłych drewnianych wykałaczek - wysokiej jakości drewna
Mikrowirówka 5417R/5417C	Eppendorff	22621807	Ten model został wycofany z produkcji. Ale można użyć innego nowszego modelu
Mikroszpatułka	Fisher	SDI28540115	autoklawizowana przed każdym użyciem.