Hodowla eksplantatów neuronów zwojów spiralnych i elektrofizjologia na układach wieloelektrodowych

Zgodnie ze Światową Organizacją Zdrowia, 360 milionów ludzi na całym świecie cierpi na ubytek słuchu, który ma poważne konsekwencje dla życia zawodowego i prywatnego. Aparaty słuchowe mogą przywrócić funkcje czuciowe w umiarkowanych postaciach ubytku słuchu; jednak w najcięższych przypadkach najskuteczniejszą opcją leczenia jest urządzenie protetyczne zwane implantem ślimakowym (CI). Implanty ślimakowe zawierają liniowy układ elektrod składający się z maksymalnie 24 elektrod, który jest chirurgicznie wprowadzany do błony bębenkowej ślimaka. Elektrody bezpośrednio stymulują neurony zwoju spiralnego, tworząc nerw słuchowy ¹.

Z ponad 300 000 urządzeń wszczepionych na całym świecie, implanty implantów ślimakowych są bardzo udanymi implantami medycznymi i plasują się wśród najbardziej opłacalnych procedur, jakie kiedykolwiek zgłoszono. Pomimo swojego sukcesu, implant ślimakowy nadal ma ograniczenia, takie jak zmniejszona rozdzielczość częstotliwości w porównaniu z fizjologicznym słuchem. Może to prowadzić do deficytów w skutecznej komunikacji w grupach lub hałaśliwym otoczeniu oraz zdolności do rozszyfrowywania bardzo złożonych dźwięków, takich jak muzyka. Ta zmniejszona rozdzielczość częstotliwości jest prawdopodobnie spowodowana przerwą między elektrodami CI a neuronami spiralnego zwoju, co prowadzi do stymulacji dużych grup neuronów. Przerwa ta mieści się w zakresie setek mikrometrów ^2,3. Wyeliminowanie tej luki ułatwiłoby stymulację mniejszych grup neuronów na elektrodę, zwiększając w ten sposób rozdzielczość częstotliwości i ogólną wydajność urządzenia ⁴.

Aby zbadać wpływ przerwy między elektrodą a neuronem oraz efekt różnych zoptymalizowanych protokołów stymulacji, opracowaliśmy test biologiczny in vitro oparty na nieinwazyjnej charakterystyce elektrofizjologicznej SGN na matrycach wieloelektrodowych (MEA) ⁵. Dodatkowo, MEA można łatwo modyfikować w celu zmiany kształtu, rozmiaru, materiału i chropowatości powierzchni, aby zoptymalizować interfejs neuron-elektroda. Poniżej znajduje się protokół krok po kroku umożliwiający powtarzalne uzyskanie nagrań z hodowli mysich neuronów spiralnych i ocenę zależności od wyżej wymienionych parametrów.

Opieka nad zwierzętami i eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi szwajcarskich władz lokalnych (Amt für Landwirtschaft und Natur des Kantons Bern, Szwajcaria).

1. Przygotuj rozwiązania do eksperymentów

1. Przygotować roztwór powlekający macierz zewnątrzkomórkową (ECM) (patrz tabela materiałów, punkt 6): Rozmrozić mieszankę ECM na lodzie. Rozcieńczyć mieszaninę ECM w stosunku 1:10 w podstawowej pożywce hodowlanej (bez czynników neurotroficznych lub płodowej surowicy bydlęcej (FBS)) i przechowywać na lodzie.
2. Przygotować pożywkę hodowlaną (patrz Tabela materiałów, punkt 1): Przygotować zapas pożywki neuropodstawowej niezawierającej FBS lub neurotroficznego czynnika pochodzenia mózgowego (BDNF). Uzupełnij pożywkę neuropodstawową świeżymi FBS (10%) i BDNF (5 ng/ml) tuż przed dodaniem do hodowli komórkowej.
3. Przygotować roztwór zewnątrzkomórkowy (patrz Tabela materiałów, punkt 2).

2. Mycie i sterylizacja MEA

UWAGA: MEA użyte do eksperymentów zawierają 68 elektrod ułożonych w prostokątną siatkę (Rysunek 1E). Każda elektroda ma wymiary 40 x 40 μm² w odstępie 200 μm od środka do środka. Elektrody wykonane są z platyny. Elektrody są połączone z odpowiednimi stykami za pomocą obwodu wykonanego z tlenku indu i cyny. Obwód ten jest izolowany warstwą SU-8 o grubości 5 μm. Szczegółowe informacje na temat dostawcy można znaleźć w tabeli materiałów. Inne układy MEA mogą być odpowiednie dla tych eksperymentów.

1. Dla nowych MEA: Opłucz je, zanurzając w 70% etanolu na 30 sekund i myj wodą destylowaną przez 30 sekund. Pracuj w okapie z przepływem laminarnym.
2. Pozostaw MEA do wyschnięcia na 30 minut w okapie z przepływem laminarnym.
3. Umieścić każdy MEA na indywidualnej sterylnej szalce Petriego (35 mm x 10 mm) i zamknąć folią. MEA mogą być przechowywane do czasu ich wykorzystania.
4. Dla stosowanych MEA: Inkubować MEA na szalce Petriego (35 mm x 10 mm) zawierającej 1 ml roztworu enzymatycznego (patrz tablica materiałów, pkt 6) O/N na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze pokojowej w celu usunięcia materiału biologicznego. Następnie kontynuuj jak w kroku 2.1.
   UWAGA: Z MEA należy obchodzić się ostrożnie, używając kleszczy z gumowymi końcówkami.

3. Przygotowanie MEA do eksperymentów kulturowych

1. Usunąć folię uszczelniającą i pozostawić MEA na szalce Petriego (35 mm x 10 mm) na cały czas trwania eksperymentu.
2. Pokryć MEA roztworem przygotowanym w ppkt. 1.1: Za pomocą zimnej końcówki pipety o pojemności 200 μl (przechowywanej w temperaturze -20 °C) nanieść 50 μl roztworu powlekającego do każdej MEA, pokrywając cały obszar elektrody.
3. Pozostaw MEA do powlekania przez 30 minut do 1 godziny w temperaturze pokojowej.
4. Usunąć roztwór powlekający za pomocą pipety. Nałożyć 100 μl pożywki hodowlanej uzupełnionej 10% FBS i 5ng/ml BDNF i pozostawić w temperaturze pokojowej do momentu posiewu tkanki.
5. Umieścić 2 szalki Petriego zawierające pokryte MEA na dużej szalce Petriego (94 mm x 16 mm) i dodać trzecią małą szalkę Petriego zawierającą 1,5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do nawilżania.
   UWAGA: Dodanie małej płytki Petriego (krok 3.5) zawierającej PBS ma kluczowe znaczenie dla znacznego zminimalizowania parowania pożywki hodowlanej.

4. Rozwarstwienie spiralnego zwoju

UWAGA: Grube rozbiory można przeprowadzić poza okapem z przepływem laminarnym (Krok 4.1 do 4.4). W przypadku drobnego rozwarstwienia obowiązkowe są warunki sterylne (okap z przepływem laminarnym) (od kroku 4.5).

1. Eutanazja zwierząt (5-7 dniowych myszy) przez dekapitację bez wcześniejszego znieczulenia.
2. Wysterylizuj głowę, spryskując ją 70% etanolem.
3. Trzymając się za głowę, przetnij połączenie między skórą a czaszką ostrym/ostrym nożyczkiem wzdłuż linii strzałkowej.
4. Przetnij czaszkę strzałkowo i usuń mózg za pomocą ostrych/nożyczek.
5. Wytnij kości skroniowe z czaszki i umieść je na szalce Petriego zawierającej sterylny, lodowaty roztwór soli Hanksa (HBSS).
6. Za pomocą mikroskopu preparacyjnego wypreparuj pęcherz bębenkowy za pomocą cienkich kleszczy i odizoluj ucho wewnętrzne.
7. Usuń kość ślimaka za pomocą cienkich kleszczy.
8. Usuń więzadło spiralne i prążki naczyniowe (SV) razem, przytrzymując kleszczami podstawową część zwoju spiralnego (SG) i SV i powoli rozwijając SV od podstawy do wierzchołka
9. Wyizoluj narząd Cortiego (OC), SG i modiolus (ryc. 1A-C)
10. Oddziel OC od SG i modiolus, przytrzymując kleszczami podstawową część SG i OC i powoli rozwijając OC od podstawy do wierzchołka.
11. Wyciąć boczne eksplantaty (o średnicy od 200 do 500 μm) ze spiralnego zwoju nadal przymocowanego do modiolusa (ryc. 1D) za pomocą kleszczy i mikroskalpela.

5. Hodowla eksplantatów spiralnych ganglionów na MEA

1. Umieścić dwa eksplantaty spiralnych zwojów obok elektrod na MEA uprzednio przygotowanym ze 100 μl pożywki hodowlanej.
2. Umieść narząd Cortiego w odległości około 5 mm od obszaru elektrody.
3. Użyj kleszczy, aby przypiąć eksplantaty i narząd Cortiego do MEA, unikając uszkodzenia tkanki.
4. Ostrożnie umieścić MEA w inkubatorze i hodowli w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ . Następnego dnia sprawdź wzrokowo, czy eksplantaty są przymocowane do MEA.
   UWAGA: Jeśli eksplantaty nie mają przyłączonego O/N, rzadko będą to robić w ciągu następnych dni. OC umieszcza się w sąsiedztwie kultury w celu wsparcia troficznego/neurotroficznego.
5. Dodawaj 100 μl pożywki zawierającej 10% FBS i BDNF codziennie przez 5 kolejnych dni.
6. W dniu 6 dodaj 2 ml pożywki hodowlanej zawierającej 10% FBS i 5 ng/ml BDNF i hoduj tkankę przez dodatkowe 13 dni.

6. Zapisy elektrofizjologiczne do badania spontanicznej i zależnej od stymulacji elektrod aktywności

1. Przemyć kulturę MEA roztworem zewnątrzkomórkowym przygotowanym w kroku 1.3, w temperaturze pokojowej.
2. Osusz styki chusteczką i zamontuj MEA na konfiguracji MEA.
   UWAGA: Aby kultura była wilgotna podczas montowania, dodaj do kultury niewielką kroplę roztworu zewnątrzkomórkowego.
3. Dodać 300 μl roztworu zewnątrzkomórkowego i odczekać 10 minut przed nagraniem, aby system mógł się ustabilizować.
4. Rejestruj spontaniczną aktywność przez 2 minuty ze wszystkich elektrod, naciskając przycisk nagrywania/pobierania w oprogramowaniu i zidentyfikuj elektrody rejestrujące.
5. Stymulacja elektrod MEA: Wybierz amplitudę/czas trwania/kształt bodźca w odpowiednim oprogramowaniu i zastosuj do kilku elektrod po kolei, jak opisano ¹³. Wybierz elektrody na podstawie tych, które wykazują spontaniczną aktywność (jak w kroku 6.4). Zapisz ze wszystkich pozostałych elektrod.
6. Aby wykluczyć artefakt stymulacji, stymuluj z tej samej elektrody 10 razy. Jeśli hodowla zareaguje co najmniej 8 na 10 razy, można założyć, że jest to pozytywna odpowiedź na stymulację wywołaną elektrodą.
7. Aby zidentyfikować szum tła, należy zastosować tetrodotoksynę (TTX) do hodowli o stężeniu 1 μM, aby zablokować kanały sodowe bramkowane napięciem i nagrywać przez 2 minuty. Użyj tego, aby przeprowadzić wykrywanie skoków (7.1 i 7.2).

7. Analiza danych

UWAGA: Analiza danych została wcześniej szczegółowo opisana w ^{punktach 6} i ⁵. Szczegółowe informacje na temat oprogramowania użytego w tym badaniu znajdują się w Tabeli materiałów, punkt 7.

1. Za pomocą odpowiedniego oprogramowania można wykryć spontaniczną aktywność każdej elektrody za pomocą detektora opartego na odchyleniach standardowych i późniejszym dyskryminatorze. Procedura ta została opisana w ^{punkcie 6}. Aktywność pojawia się jako szybkie stany przejściowe napięcia (<5 ms).
2. Wybierz próg, który powoduje brak aktywności podczas analizowania próbek poddanych działaniu TTX. Dostosuj wartość progową dla każdego eksperymentu, aby odróżnić wykrycia fałszywie dodatnie od fałszywie ujemnych.
3. Za pomocą odpowiedniego oprogramowania obserwuj wykrytą aktywność neuronalną każdej elektrody jako wykres rastrowy zgodnie ze standardowymi procedurami (patrz rysunek 2A-C).
4. Określ i wyświetl całkowitą aktywność sieciową, sumując wszystkie wykryte zdarzenia w przesuwanym oknie o długości 10 ms, przesuniętym o krok 1 ms.
5. Wykrywaj aktywność wywołaną stymulacją, wyświetlając surowe dane za pomocą odpowiedniego oprogramowania analitycznego. Zidentyfikuj pojedyncze skoki w trybie offline ręcznie. Pojedyncze skoki pojawiają się jako szybkie stany przejściowe napięcia, występujące po artefakcie stymulacji (grot strzałki na rysunku 2E). Przykład pokazano na rysunku 2E.
6. W zależności od eksperymentu przeanalizuj liczbę reagujących elektrod, próg potrzebny do osiągnięcia odpowiedzi, liczbę potencjału czynnościowego na elektrody i inne interesujące parametry ⁵.

8. Utrwalanie tkanek i immunohistochemia

UWAGA: Proces barwienia zniszczy MEA. Patrz Tabela materiałów (punkt 4) dla odczynników.

1. Bezpośrednio po nagraniu przemyć kultury trzykrotnie ciepłym PBS o temperaturze 37 °C. Wyrzucić PBS i zastosować 4% paraformaldehydu (PFA) (w PBS), podgrzanego do 37 °C przez 10 min.
   UWAGA: PFA jest toksyczny. Pracuj w kapturze chemicznym z odpowiednią ochroną i wyrzuć roztwór zgodnie z wytycznymi.
2. Przemyć kultury trzykrotnie PBS i zablokować 2% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) w PBS (0,01% Triton-X100) przez 2 godziny.
3. Dodać pierwsze przeciwciało (Anty-βIII tubulina, przeciwciało TUJ) rozcieńczone w PBS (2% BSA i 0,01% Triton-X100) i pozostawić O/N w temperaturze 4 °C. Przemyć kulturę trzykrotnie PBS.
   UWAGA: Od teraz należy przechowywać próbkę w ciemności tak często, jak to możliwe, aby zminimalizować bielenie wtórnego przeciwciała znakowanego fluorescencyjnie.
4. Dodać przeciwciało drugorzędowe rozcieńczone w PBS (2% BSA i 0,01% Triton-X100) i inkubować przez 1 do 2 godzin w temperaturze pokojowej. Aby zabarwić jądra, dodać 1:10 000 DAPI (1 mg/ml bulionu) przez 10 min.
5. Przemyć trzykrotnie PBS i przymocować próbki tyłem do cienkich szkiełek nakrywkowych (24 x 50 mm²) za pomocą podłoża montażowego (patrz tabela materiałów, punkt 4). Obraz za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego o powiększeniu 5X i 20X.

Rysunek 1 podsumowuje procedurę izolacji, przygotowania i hodowli tkanek na MEA. Pokazujemy kolejne etapy rozwarstwiania tkanek w celu wyizolowania zwoju spiralnego (SG) z nabłonka czuciowego narządu Cortiego (OC) i prążkowia naczyniowego (SV) oraz przyłączonego więzadła spiralnego (ryc. 1 AC). Spiralne eksplantaty zwojów (w liczbie 3-4) są wycinane mikronożyczkami z ganglionu, jak schematycznie pokazano na rysunku 1D, i umieszczane na MEA (rysunek 1E), nad obszarem zajmowanym przez elektrodę (2,2 mm2). OC umieszcza się w pobliżu, na zewnątrz powierzchni elektrody. Wzrost kultury można monitorować w czasie (ryc. 1G). Schemat ideowy protokołu pokazano na rysunku 1F. Aktywność elektrofizjologiczną można wykryć po 6 dniach hodowli, która wzrasta wraz z wydłużeniem czasu hodowli. Zalecamy ocenę 18-dniowych kultur, które wytwarzają znacznie większą liczbę elektrod rejestrujących w porównaniu z wcześniejszymi punktami czasowymi 5.

Rysunek 1. Przygotowanie hodowli komórkowych. (A) Świeżo wypreparowane ucho wewnętrzne myszy. Biała przerywana linia wskazuje położenie ślimaka, przerywana linia wskazuje obszar przedsionkowy. (B) Ucho wewnętrzne myszy po usunięciu kostnej ściany ślimaka. Skręty ślimaka są oznaczone białymi przerywanymi liniami. (C) Zwój spiralny (SG) i modiolus, narząd Cortiego (OC) i prążek naczyniowy (SV) oraz więzadło spiralne są pokazane po rozwarstwieniu. (D) Schemat rozbioru SG i OC oraz przygotowania eksplantatu SG {rysunek zaadaptowany z 5 za zgodą wydawcy}. (E) Ilustracja układu wieloelektrodowego użytego w tym badaniu. Elektrody kodujące są zorganizowane w prostokątną siatkę pośrodku i zajmują powierzchnię 2,2 mm2. 4 Pokazano elektrody uziemiające i styki boczne. (F) Schemat protokołu hodowli. Nagrania wykonywane są w dniu 18. (G) Reprezentatywne obrazy (obrazy jasnego pola) i schematy eksplantatów SG na MEA monitorowane w kulturze w dniu 1, 6 i 18. Podziałka = 400 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Spontaniczna aktywność może być wykryta na MEA i pokazana jako wykres rastrowy, gdzie każda linia wykresu reprezentuje wykryty wzrost. Pokazano reprezentatywny przykład pokazujący spontaniczną aktywność wykrytą przez kilka elektrod (różne kolory na wykresach) (rysunek 2A, 2B i 2C).

Dodatkowo, elektrody MEA mogą być używane do stymulacji hodowli. Reprezentatywny przykład przedstawiający impuls dwufazowy używany do stymulacji (rysunek 2D), 5 elektrod reagujących (czerwone ścieżki) i elektrod niereagujących (niebieskie ścieżki) pokazano na rysunku 2E. Do tych eksperymentów jedna elektroda była używana do stymulacji, a wszystkie pozostałe do nagrywania. Potencjały czynnościowe pojedyncze pojawiły się 1 ms po artefakcie stymulacji (grot strzałki). MEA może być wybarwiony immunologicznie pod koniec procedury w celu oceny pokrycia procesów neuronalnych w obszarze elektrody. Elektroda oznaczona na zielono na rysunku 2F została użyta do stymulacji, a elektrody oznaczone na czerwono użyto do rejestrowania odpowiedzi (rysunek 2E).

Rysunek 2. Zapisy danych na MEA. (A) Ślady oryginalnych zapisów sześciu z 63 elektrod wykazujących spontaniczną aktywność. (B) Wykres rastrowy sześciu elektrod z rysunku 2A po wykryciu spajału. Każdy słupek reprezentuje jeden potencjał czynnościowy. (C) Wykres rastrowy zawierający wszystkie elektrody (jak w A i B) Aktywność jest rejestrowana z 63 elektrod (kanały o numerze 0-63) przez 2 minuty. (D) Do stymulacji kultury z jednej elektrody zastosowano bodziec dwufazowy o łącznym czasie trwania 80 μs i amplitudzie 80 μA (E58 na rysunku 2F). (E) Reprezentatywny przykład śladów danych surowych uzyskanych po stymulacji elektrodą 58 pokazujących potencjały czynnościowe (czerwone ślady) lub bez odpowiedzi (niebieskie ślady) po stymulacji (grot strzałki). (F) Hodowla zwojów spiralnych na MEA wybarwiona immunologicznie dla markera neuronalnego TUJ (zielony) na końcu eksperymentu w celu wizualizacji pokrycia neuronalnego obszaru elektrody {rysunek dostosowany z 5 za zgodą wydawcy}. Elektroda 58 używana do stymulacji jest oznaczona kolorem zielonym, elektrody reagujące są oznaczone kolorem czerwonym. Podziałka = 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wreszcie, konfiguracja MEA pozwala na zbadanie możliwych modyfikacji powierzchni elektrod, które mogą zwiększyć czułość nagrywania. W badaniach wykorzystano dwie dostępne na rynku elektrody MEA o dwóch różnych powierzchniach platynowych: Grey Platinum (Grey Pt), składającą się z warstwy Pt o grubości 150 nm (impedancja: 400 KΩ/1 KHz) oraz Black Platinum, (Black, Pt), otrzymaną w wyniku elektrochemicznego osadzania Pt na końcu procesu mikrowytwarzania (impedancja: 20 KΩ/1 KHz). Szczegółowe informacje można znaleźć w tabeli materiałów (punkt 6).

Przeprowadzono sześć niezależnych eksperymentów MEA dla każdego typu elektrody. Black Pt MEA pozwala na wykrycie aktywności neuronalnej na większej liczbie elektrod na MEA (ryc. 3A) i zmniejszenie amplitudy bodźca potrzebnej do wywołania odpowiedzi (ryc. 3B). Przeanalizowaliśmy dla 30-35 niezależnych par elektrod, w 6 różnych eksperymentach, próg prądu potrzebny do uzyskania odpowiedzi. Czarne elektrody Pt działały znacznie lepiej, wykazując próg 31,09 μA +/-2,4 w porównaniu z szarymi elektrodami Pt 47,57 μA +/- 1,97.

Rysunek 3. Porównanie elektrod Pt szarych i czarnych. Dwa typy elektrod (Grey i Black Pt) porównano obok siebie przy użyciu 12 niezależnych kultur MEA, po 6 dla każdego typu MEA. (A) Pokazana jest całkowita liczba reagujących elektrod w jednym doświadczeniu. (B) Pokazano próg amplitudy do wywołania odpowiedzi, mierzony przy użyciu 30-35 niezależnych par elektrod w 6 niezależnych eksperymentach MEA. Dane są wyświetlane jako Średnia+/-SD. (Test Studenta t p <0,001) Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.