Artykuł metodologiczny

Zapis patch clamp komórek amakrynowych Starburst w płaskim preparacie bezkofeinowej siatkówki myszy

DOI:

10.3791/54608

⸱

13 października 2016

 ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, Baylor College of Medicine, 2Department of Neuroscience, Baylor College of Medicine, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, Baylor College of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół pokazuje, jak przeprowadzić zapis klamry całokomórkowej na neuronach siatkówki z preparatu do montażu płaskiego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Siatkówka ssaków to warstwowa tkanka złożona z wielu typów neuronów. Aby zrozumieć, w jaki sposób sygnały wzrokowe są przetwarzane w skomplikowanej sieci synaptycznej, zapisy elektrofizjologiczne są często wykorzystywane do badania połączeń między poszczególnymi neuronami. Zoptymalizowaliśmy preparat do montażu płaskiego do rejestracji patch clamp genetycznie oznaczonych neuronów zarówno w GCL (warstwa komórek zwojowych), jak i INL (wewnętrzna warstwa jądrowa) siatkówki myszy. Nagrywanie neuronów INL w płaskich mocowaniach jest preferowane w stosunku do plasterków, ponieważ zarówno połączenia pionowe, jak i boczne są zachowane w poprzedniej konfiguracji, co pozwala na badanie obwodów siatkówki z dużymi komponentami bocznymi. Zastosowaliśmy tę procedurę do porównania odpowiedzi neuronów współpracujących z lustrem w siatkówkach, takich jak cholinergiczne komórki amakrynowe gwiazdoskrzydłe (SAC).

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jako łatwo dostępna część ośrodkowego układu nerwowego, siatkówka przez dziesięciolecia była użytecznym modelem w badaniach neurobiologicznych. Znakowanie genetyczne neuronów pozwoliło na szczegółową charakterystykę połączeń synaptycznych w siatkówce. Dzięki wielu dostępnym metodologiom badania funkcji i morfologii neuronów siatkówki, technika zapisu patch clamp odegrała zasadniczą rolę w naszym obecnym zrozumieniu pionowo przesyłanych sygnałów w siatkówce. Sygnały te pochodzą z absorpcji fotonów w fotoreceptorach i są wysyłane do ośrodków wzrokowych mózgu poprzez pobudzanie komórek zwojowych siatkówki (RGC). Pomimo dużej ilości zgromadzonej do tej pory wiedzy, różnorodność neuronalna w unaczynionej siatkówce ssaków pozostaje nierozwiązana i utrudnia pełne zrozumienie obwodów siatkówki, które służą normalnemu widzeniu. Dzieje się tak częściowo dlatego, że większość nagrań została wykonana na wycinkach siatkówki, aby zamienić integralność obwodu bocznego na dostęp do bardziej proksymalnych neuronów siatkówki1-3. Aby uzyskać kompleksowy obraz tego, w jaki sposób siatkówka oblicza sygnały wzrokowe, pożądane jest rejestrowanie neuronów w płaskich mocowaniach, w których połączenia boczne, duże i małe, mogą być lepiej zachowane.

Gdy transmisja synaptyczna z fotoreceptorów do komórek dwubiegunowych zostaje przerwana z powodu wadliwego szlaku sygnałowego metabotropowego receptora glutaminianu 6 (mGluR6) w depolaryzujących komórkach dwubiegunowych4-6 lub po prostu w wyniku utraty fotoreceptorów w zdegenerowanych siatkówkach7-10, wiele RGC wykazuje aktywność oscylacyjną. Oscylacje te pochodzą z wielu źródeł, jednak ta obejmująca sprzężenie szczelinowe między komórkami amakrynowymi AII (AII-AC) a depolaryzującymi stożkowymi komórkami bipolarnymi (DCBC) przyciągnęła najwięcej uwagi i dlatego jest najlepiej rozumiana1,7,11. Znaleźliśmy inne źródło, które utrzymuje się pod farmakologiczną blokadą wspomnianej sieci AII-AC/DCBC i napędza oscylacje SAC typu OFF u myszy RhoΔCTA i Nob z bezkofeinowymi siatkówkami7,8,12. Tutaj szczegółowo opisujemy nasz protokół przygotowania płaskich mocowań siatkówki do rejestracji neuronów INL. Podejście to wykorzystuje komercyjne linie myszy (numer magazynowy Jax 006410 i 007905) do oznaczania cholinergicznych neuronów siatkówki za pomocą ekspresji białka fluorescencyjnego (tdTomato), którą można zidentyfikować pod mikroskopem fluorescencyjnym wyposażonym w optykę wzmacniającą kontrast. Niektóre wyniki eksperymentalne uzyskane za pomocą tego podejścia zostały wcześniej zgłoszone4,5,7,13.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zgoda etyczna – procedury z udziałem zwierząt zostały przeprowadzone zgodnie z zasadami i przepisami wytycznych National Institutes of Health dla zwierząt badawczych, zatwierdzonych przez instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami i ich wykorzystania w Baylor College of Medicine.

1. Rozwiązania zewnętrzne i wewnętrzne

  1. Roztwór Ringera należy stosować u ssaków podczas rozwarstwiania siatkówki oraz jako roztwór zewnętrzny w późniejszym zapisie elektrofizjologicznym. Przygotować roztwór Ringera ssaków z 10-krotnego roztworu podstawowego (bez wapnia) w dniu rejestracji i dodać kroplami CaCl2 po 15 minutach karbonowania (95%O2 i 5% CO2 ). Końcowy roztwór 1x zawiera (w mM): 120 NaCl, 5 KCl, 25 NaHCO3, 0,8 Na2HPO4, 0,1 NaH2PO4, 2 CaCl2, 1MgSO4 i 10 D-glukozy.
  2. Użyj dwóch wewnętrznych rozwiązań, aby scharakteryzować oscylacje SAC. Zbadać przydatność przygotowanych roztworów w przedłużonych zapisach patch-clampów całokomórkowych na dorosłych myszach RGC i przechowywać zweryfikowane partie w 500 μl podwielokrotnościach w temperaturze -20 °C do czasu użycia.
    1. Do rejestrowania oscylacji potencjału błonowego należy użyć wewnętrznego roztworu na bazie potasu, który zawiera (w mM): 125 K-glukonian, 8 NaCl, 4 ATP-Mg, 0,5 Li-GTP, 5 EGTA, 10 HEPES i 0,2% biocytyny (w/v). Dostosuj pH do 7,3 za pomocą KOH.
    2. Do rejestrowania pobudzających i hamujących prądów postsynaptycznych należy użyć wewnętrznego roztworu na bazie cezu, który zawiera (w mM): 100 Cs-metanosulfonianu, 8 NaCl, 4 ATP-Mg, 0,5 Li-GTP, 5 EGTA, 10 HEPES i 0,2% biocytyny (w/v). Dostosuj pH do 7,3 za pomocą CsOH.

2. Przygotowanie do Dnia Nagrania

  1. Aby przygotować membranę nitrocelulozową z otwartymi otworami, należy ręcznie przebić membranę za pomocą specjalnego dziurkacza wykonanego z igły strzykawkowej 16 G i spłaszczyć membranę między dwiema czystymi szklanymi płytkami. W przypadku siatkówki z pełnym mocowaniem wykonaj centralny otwór o średnicy 0,2 mm i otocz go 4 większymi otworami o średnicy 1-1,2 mm.
  2. Aby uzyskać niestandardowy filament do wypełniania do ładowania roztworu wewnętrznego do elektrod, stopić końcówkę pipety o pojemności 10 μl na środku i delikatnie wydłużyć stopioną część, aż ostygnie i stwardnieje. Tuż przed użyciem użyj czystej żyletki, aby przyciąć filament, aż będzie nieco dłuższy niż pipety z plastrem.
  3. Wyciągnij pipety plastrowe w programowalnym ściągaczu z rurki ze szkła borokrzemianowego z wewnętrznym żarnikiem. Mikropipety należy wyprodukować w dniu eksperymentu i natychmiast je zużyć.
    UWAGA: Do nagrywania SAC używamy następującego ustawienia ściągacza: ciepło: 484; uciąg: 0; prędkość: 25; czas opóźnienia: 1; Ciśnienie: 400 i wartość rampy 462. Średnica zewnętrzna i wewnętrzna rurek borokrzemianowych wynosi odpowiednio 1,65 mm i 1,0 mm. Rezystancja pipet wynosi 10-14 MΩ.
  4. Na godzinę przed pobraniem tkanek rozmrozić probówkę z roztworem wewnętrznym, potrząsając nią na wirze przez >30 min.

3. Rozwarstwienie siatkówki

  1. Znieczulij zwierzę 4% izofluranem w tlenie, aż zwierzę straci reakcję na uszczypnięcie palca u nogi. Złóż zwierzę w ofierze przez zwichnięcie szyjki macicy.
  2. Odetnij obie gałki oczne od nerwów wzrokowych w odległości 1-2 mm od główek nerwu wzrokowego za pomocą nożyczek do tęczówki z prostym zakończeniem.
  3. Rzuć gałki oczne na czysty ręcznik papierowy, aby usunąć krew, a następnie zanurz je w roztworze Ringera karbogenowanych ssaków. Przebij otwór w rąbku za pomocą igły 23 G i przetnij gałki oczne, przecinając wzdłuż rąbka mikronożyczkami. Usuń rogówkę i soczewkę za pomocą drobnych kleszczyków.
    1. W przypadku całego montażu siatkówki delikatnie oderwij całą siatkówkę od pigmentowanego nabłonka za pomocą cienkich kleszczyków i wykonaj cztery 1,5-2 mm ortogonalne nacięcia od krawędzi w kierunku głowy nerwu wzrokowego.
  4. Zanurz dziurkowaną membranę nitrocelulozową w naczyniu i delikatnie przeciągnij po niej siatkówkę stroną GCL do góry. Umieść głowę nerwu wzrokowego w środkowym otworze podczas przygotowywania całej siatkówki. Przenieś błonę z siatkówką do innego czystego naczynia. Delikatnie spłaszcz siatkówkę cienkim pędzlem, aby wyglądała jak krzyż maltański i połóż wszystkie cztery krawędzie na otworach.
    1. Jeśli jednorazowo ma być badana część siatkówki, należy przeciąć każdą muszlę oczną przygotowaną z kroku 3.3 na 3-4 części za pomocą żyletki z przyczepionymi resztkami pigmentowanego nabłonka. Niewykorzystane kawałki należy chronić przed światłem w karbogenicznym roztworze zewnętrznym i zużyć w ciągu 12 godzin.
  5. Osusz membranę nitrocelulozową kawałkiem suchej bibuły filtracyjnej i usuń szklistą i wewnętrzną membranę ograniczającą za pomocą kleszczy i pędzla.
  6. Upewnij się, że wszystkie krawędzie siatkówki są całkowicie przymocowane do membrany przed przeniesieniem zespołu do komory nagrywającej z uszczelnionym szklanym szkiełkiem nakrywkowym na dole. Przymocuj membranę smarem próżniowym do szkiełka nakrywkowego i ponownie nawodnij siatkówkę roztworem zewnętrznym. Uważaj, aby nie uwięzić żadnych pęcherzyków powietrza pod zespołem.
  7. Ustaw komorę na stoliku mikroskopu pionowego. Ukrwić komorę ciepłym (34-35 °C) karbogenicznym roztworem zewnętrznym w ilości ~3 ml na minutę.
  8. Najpierw zbadaj siatkówkę pod soczewką obiektywu 10x, a następnie użyj soczewki zanurzonej w wodzie 60x, aby zobaczyć neurony GCL i INL pod wpływem różnicowego kontrastu interferencyjnego (DIC) i/lub epifluorescencji. Aby uwidocznić SAC wykazujące ekspresję tdTomato, użyj białego źródła światła LED w połączeniu z filtrem wzbudzenia o długości fali 554 nm i filtrem emisyjnym o długości fali 581 nm.

4. Nagrywanie z użyciem clampu krosowego całej komórki z płaskiej siatkówki

  1. Przefiltruj roztwór wewnętrzny przez filtr strzykawkowy do niestandardowego filamentu do wypełniania.
  2. Włóż filament do świeżo wyciągniętej mikropipety i dozuj roztwór wewnętrzny w pobliżu końcówki, aż roztwór pokryje srebrny drut elektrody na >5 mm. Zamocuj mikropipetę na uchwycie elektrody z kijkiem ssącym, za pomocą którego można regulować ciśnienie wewnątrz elektrody, popychając lub pociągając tłok plastikowej strzykawki o pojemności 10 ml podłączonej do rurki.
  3. Znajdź pipetę pod obiektywem i zejdź ją do ~100 μm powyżej siatkówki. W trybie wtórnika prądowego (I = 0) użyj przesunięcia DC, aby wyzerować stojący sygnał napięcia DC. Zmierz rezystancję pipety w trybie cęgów prądowych (IClamp), wstrzykując prądy o fali prostokątnej o stałej amplitudzie przez pipetę, gdy znajduje się ona w kąpieli, i zneutralizuj różnicę, obracając pokrętło Raccess. Użyj odczytu na pokrętle Raccess, aby obliczyć rezystancję pipety zgodnie z prawem Ohma.
  4. Powoli ustaw elektrodę na wysokości ~10 μm nad siatkówką. Zastosuj nadciśnienie do elektrody. Obserwuj, jak zmienia się odbicie w pobliżu końcówki pipety, gdy zbliża się ona do siatkówki. Szybko, ale delikatnie wepchnij pipetę do GCL i natychmiast zmniejsz nadciśnienie.
  5. Przesuń pipetę w kierunku oznakowanego neuronu. Unikaj kontaktu z innymi neuronami, naczyniami krwionośnymi i końcami nóg komórek Müllera. W razie potrzeby zastosuj większe nadciśnienie, aby zapobiec zatkaniu elektrody.
  6. Umieść końcówkę pipety w pobliżu linii środkowej znakowanego neuronu, aż będzie widoczny wgłębienie. Zwolnij nadciśnienie i pozwól, aby błona plazmatyczna odbiła się z powrotem na końcówkę pipety.
  7. Zastosuj do pipety prądy ujemne o natężeniu od 20 do 120 pA, aby pomóc w tworzeniu uszczelnienia giga-omowego. W razie potrzeby zastosuj delikatne ssanie, aby wciągnąć błonę plazmatyczną do pipety. Odczekaj 5 minut po utworzeniu uszczelnienia, aby pękła błona komórkowa. Pozwala to na usunięcie rozlanego roztworu wewnętrznego przez superfuzję. Rozerwij membranę przez delikatne zasysanie.
  8. Po pęknięciu membrany i w bieżącym trybie zacisku włącz balans mostka i wyreguluj go za pomocą pokrętła Raccess.
    UWAGA: W przypadku małej komórki, takiej jak SAC, wymagana jest tylko niewielka regulacja, jeśli taka istnieje. Alternatywnie, rejestruj pobudzające i hamujące prądy postsynaptyczne w trybie zacisku napięciowego (VClamp), utrzymując komórkę przy potencjałach odwrócenia odpowiednio chlorku (około -75 mV) i glutaminianu (około 0 mV). W razie potrzeby sprawdź i wyreguluj położenie pipety, aby dostosować się do sporadycznego dryfu siatkówki i/lub mikromanipulatora.
  9. Aby zarejestrować potencjał błonowy lub zmianę prądu przed, w trakcie i po leczeniu farmakologicznym, należy przygotować blokery synaptyczne (np. CNQX, AP5, pikrotoksynę, tubokurarynę itp.) i modulatory kanałów (np. flupirtynę, dopaminę, kwas meklofenamowy itp.) świeże w dniu eksperymentu z zamrożonych zapasów. Rozcieńczyć leki karbogenicznym roztworem Ringera. Nakładaj je partiami poprzez perfuzję.
  10. Po nagraniu delikatnie wyjmij pipetę z somy. Przenieś zestaw z komory do czystego naczynia. Odłącz i ponownie przymocuj siatkówkę do innej spłaszczonej membrany nitrocelulozowej bez wybitych otworów, aby zapewnić płaskość siatkówki podczas mocowania.
  11. Napraw siatkówkę, zanurzając ją w 4% paraformaldehydzie na 30 minut w temperaturze pokojowej. Usuń siatkówkę z membrany nitrocelulozowej i dokładnie ją spłucz 1x PBS. Ujawnij morfologię zarejestrowanych komórek przez barwienie O/N streptawidyną sprzężoną z barwnikiem rozcieńczoną w 1x PBS 0,4% Triton X-100 w temperaturze 4 °C14. Zamontuj siatkówkę w podłożu zapobiegającym blaknięciu i obserwuj zarejestrowane komórki za pomocą skaningowego mikroskopu konfokalnego.
    UWAGA: Zabiegi z udziałem paraformaldehydu, który jest lotny i toksyczny, powinny być przeprowadzane w komorze ciągowej dla bezpieczeństwa.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reprezentatywne nagrania SAC typu ON i OFF z bezkofeinowej siatkówki myszy są pokazane na rysunku 1. Komórki cholinergiczne zarówno w GCL, jak i INL można niezawodnie zidentyfikować za pomocą fluorescencji tdTomato i ukierunkować na zapis klamry krosowej całej komórki pod DIC (ryc. 1A), aby ujawnić oscylacje ich potencjałów błonowych (górne ślady) i prądy synaptyczne, które je napędzają (dolne ślady, ryc. 1B). Hamujące i pobudzające prądy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wiele laboratoriów rejestrowało z neuronów GCL w preparacie flat mount15-18, ale nasze procedury pozwalają na nagrywanie z neuronów INL. Niniejszym kładziemy nacisk na kilka kroków, które mają kluczowe znaczenie dla udanych rutynowych nagrań.

Świeżość i płaskość siatkówki są ważne dla jej penetracji pipetą rejestrującą. W związku z tym najważniejsze jest mocne przymocowanie siatkówki do dziurkowanej błony nitrocelulozowej i osiąga się je poprzez przejściowe wchłanianie roztworu, a n...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Joung Jang i Xin Guan za pomoc techniczną. Dziękujemy dr Rory'emu McQuistonowi z Virginia Commonwealth University za ustawienie naszego pierwszego zestawu do zacisków krosowych i porady dotyczące procedur eksperymentalnych. Dziękujemy dr Samuelowi Wu za sugestie dotyczące nagrywania cęgów napięciowych. Prace są wspierane przez granty NIH EY013811, EY022228 oraz grant na realizację projektu vision core EY002520. C-KC jest prezesem Fundacji Badawczej Siatkówki im. Alice R. McPherson w Baylor College of Medicine.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mikroskop fluorescencyjny o stałym stopniu z mikromanipulatorami DICOlympusBX51-WI
SutterMP-225
Wzmacniacz z zaciskiem krosowymA-M SystemAM2400
Konwerter ADInstrumentNI-USB-6221
Sterownik grzałkiWarner InstrumentTC-324B
Inline grzałkaWarner InstrumentSC-20
Pompa perystaltycznaŚciągaczRainin Dynamax
Sutter InstrumentP-1000
Szklana rurka z żarnikiemKing Precision GlassDostosowany
stymulatorA.M.P.I.Master-8
BiocytinSigmaB4261
NaClSigmaS6191
KClSigmaP5405
NaHCO3FisherBP328-1
Na2HPO4SigmaS0876
Na2HPO4SigmaS5011
CaCl2SigmaC5670
MgSO4SigmaM1880
D-glukozaSigmaG6152
K-glukonianSigmaG4500
ATP-MgSigmaA9187
Li-GTPSigmaG5884
EGTASigmaE0396
HEPESSigmaH4034
KOHSigmaP5958
Cs-metanosulfonianSigmaC1426
CsOHSigma232041
Filtr strzykawkowyNalgene171
ml strzykawkaRainin
10 μ l końcówka do pipetGenesee Scientific24-130RL
Streptawidyna-488ThermoFisherS-11223
10x PBSLonza17-517Q
National do pipet 1 17013002

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Choi, H., et al. Intrinsic bursting of AII amacrine cells underlies oscillations in the rd1 mouse retina. J Neurophysiol. 112 (6), 1491-1504 (2014).
  2. Gregg, R. G., et al. Nyctalopin expression in retinal bipolar cells restores visual function in a mouse model of complete X-linked congenital stationary night blindness. J Neurophysiol. 98 (5), 3023-3033 (2007).
  3. Hellmer, C. B., Ichinose, T. Recording light-evoked postsynaptic responses in neurons in dark-adapted, mouse retinal slice preparations using patch clamp techniques. J Vis Exp. (96), (2015).
  4. Tu, H. Y., Bang, A., McQuiston, A. R., Chiao, C. C., Chen, C. K. Increased dendritic branching in direction selective retinal ganglion cells in nob1 mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (13), (2014).
  5. Tu, H. Y., Chen, Y. J., Chiao, C. C., McQuiston, A. R., Chen, C. K. J. Rhythmic membrane potential fluctuations of cholinergic amacrine cells in mice lacking ERG b-waves. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (7), (2015).
  6. Demas, J., et al. Failure to maintain eye-specific segregation in nob, a mutant with abnormally patterned retinal activity. Neuron. 50 (2), 247-259 (2006).
  7. Tu, H. Y., Chen, Y. J., McQuiston, A. R., Chiao, C. C., Chen, C. K. A Novel Retinal Oscillation Mechanism in an Autosomal Dominant Photoreceptor Degeneration Mouse Model. Front Cell Neurosci. 9, 513(2015).
  8. Borowska, J., Trenholm, S., Awatramani, G. B. An intrinsic neural oscillator in the degenerating mouse retina. J Neurosci. 31 (13), 5000-5012 (2011).
  9. Margolis, D. J., Detwiler, P. B. Cellular origin of spontaneous ganglion cell spike activity in animal models of retinitis pigmentosa. J Ophthalmol. , (2011).
  10. Stasheff, S. F. Emergence of sustained spontaneous hyperactivity and temporary preservation of OFF responses in ganglion cells of the retinal degeneration (rd1) mouse. J Neurophysiol. 99 (3), 1408-1421 (2008).
  11. Trenholm, S., Awatramani, G. B. Origins of spontaneous activity in the degenerating retina. Front Cell Neurosci. 9, 277(2015).
  12. Trenholm, S., et al. Intrinsic oscillatory activity arising within the electrically coupled AII amacrine-ON cone bipolar cell network is driven by voltage-gated Na+ channels. J Physiol. 590 (Pt 10), 2501-2517 (2012).
  13. Chen, C. K. J., et al. Cell-autonomous changes in displaced cholinergic amacrine cells lacking Gbeta5. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (7), (2015).
  14. O'Brien, B. J., Isayama, T., Richardson, R., Berson, D. M. Intrinsic physiological properties of cat retinal ganglion cells. J Physiol. 538 (Pt 3), 787-802 (2002).
  15. Lee, S., et al. An Unconventional Glutamatergic Circuit in the Retina Formed by vGluT3 Amacrine Cells. Neuron. 84 (4), 708-715 (2014).
  16. Hoggarth, A., et al. Specific wiring of distinct amacrine cells in the directionally selective retinal circuit permits independent coding of direction and size. Neuron. 86 (1), 276-291 (2015).
  17. Margolis, D. J., Gartland, A. J., Singer, J. H., Detwiler, P. B. Network oscillations drive correlated spiking of ON and OFF ganglion cells in the rd1 mouse model of retinal degeneration. PLoS One. 9 (1), e86253(2014).
  18. Schmidt, T. M., Kofuji, P. An isolated retinal preparation to record light response from genetically labeled retinal ganglion cells. J Vis Exp. (47), (2011).
  19. Ivanova, E., Yee, C. W., Sagdullaev, B. T. Increased phosphorylation of Cx36 gap junctions in the AII amacrine cells of RD retina. Front Cell Neurosci. 9, 390(2015).
  20. Enoki, R., Koizumi, A. A method of horizontally sliced preparation of the retina. Methods Mol Biol. 935, 201-205 (2013).
  21. Akrouh, A., Kerschensteiner, D. Morphology and function of three VIP-expressing amacrine cell types in the mouse retina. J Neurophysiol. 114 (4), 2431-2438 (2015).
  22. Wei, W., Elstrott, J., Feller, M. B. Two-photon targeted recording of GFP-expressing neurons for light responses and live-cell imaging in the mouse retina. Nat Protoc. 5 (7), 1347-1352 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Metoda Patch Clamp w konfiguracji whole cellneurobiologia siatk wkifluorescencja tdTomatowarstwa kom rek zwojowychwewn trzna warstwa j drowaobwody neuronalne siatk wki

Powiązane artykuły