Zapis patch clamp komórek amakrynowych Starburst w płaskim preparacie bezkofeinowej siatkówki myszy

Jako łatwo dostępna część ośrodkowego układu nerwowego, siatkówka przez dziesięciolecia była użytecznym modelem w badaniach neurobiologicznych. Znakowanie genetyczne neuronów pozwoliło na szczegółową charakterystykę połączeń synaptycznych w siatkówce. Dzięki wielu dostępnym metodologiom badania funkcji i morfologii neuronów siatkówki, technika zapisu patch clamp odegrała zasadniczą rolę w naszym obecnym zrozumieniu pionowo przesyłanych sygnałów w siatkówce. Sygnały te pochodzą z absorpcji fotonów w fotoreceptorach i są wysyłane do ośrodków wzrokowych mózgu poprzez pobudzanie komórek zwojowych siatkówki (RGC). Pomimo dużej ilości zgromadzonej do tej pory wiedzy, różnorodność neuronalna w unaczynionej siatkówce ssaków pozostaje nierozwiązana i utrudnia pełne zrozumienie obwodów siatkówki, które służą normalnemu widzeniu. Dzieje się tak częściowo dlatego, że większość nagrań została wykonana na wycinkach siatkówki, aby zamienić integralność obwodu bocznego na dostęp do bardziej proksymalnych neuronów siatkówki^1-3. Aby uzyskać kompleksowy obraz tego, w jaki sposób siatkówka oblicza sygnały wzrokowe, pożądane jest rejestrowanie neuronów w płaskich mocowaniach, w których połączenia boczne, duże i małe, mogą być lepiej zachowane.

Gdy transmisja synaptyczna z fotoreceptorów do komórek dwubiegunowych zostaje przerwana z powodu wadliwego szlaku sygnałowego metabotropowego receptora glutaminianu 6 (mGluR6) w depolaryzujących komórkach dwubiegunowych^4-6 lub po prostu w wyniku utraty fotoreceptorów w zdegenerowanych siatkówkach^7-10, wiele RGC wykazuje aktywność oscylacyjną. Oscylacje te pochodzą z wielu źródeł, jednak ta obejmująca sprzężenie szczelinowe między komórkami amakrynowymi AII (AII-AC) a depolaryzującymi stożkowymi komórkami bipolarnymi (DCBC) przyciągnęła najwięcej uwagi i dlatego jest najlepiej rozumiana^1,7,11. Znaleźliśmy inne źródło, które utrzymuje się pod farmakologiczną blokadą wspomnianej sieci AII-AC/DCBC i napędza oscylacje SAC typu OFF u myszy RhoΔCTA i Nob z bezkofeinowymi siatkówkami^7,8,12. Tutaj szczegółowo opisujemy nasz protokół przygotowania płaskich mocowań siatkówki do rejestracji neuronów INL. Podejście to wykorzystuje komercyjne linie myszy (numer magazynowy Jax 006410 i 007905) do oznaczania cholinergicznych neuronów siatkówki za pomocą ekspresji białka fluorescencyjnego (tdTomato), którą można zidentyfikować pod mikroskopem fluorescencyjnym wyposażonym w optykę wzmacniającą kontrast. Niektóre wyniki eksperymentalne uzyskane za pomocą tego podejścia zostały wcześniej zgłoszone^4,5,7,13.

Zgoda etyczna – procedury z udziałem zwierząt zostały przeprowadzone zgodnie z zasadami i przepisami wytycznych National Institutes of Health dla zwierząt badawczych, zatwierdzonych przez instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami i ich wykorzystania w Baylor College of Medicine.

1. Rozwiązania zewnętrzne i wewnętrzne

1. Roztwór Ringera należy stosować u ssaków podczas rozwarstwiania siatkówki oraz jako roztwór zewnętrzny w późniejszym zapisie elektrofizjologicznym. Przygotować roztwór Ringera ssaków z 10-krotnego roztworu podstawowego (bez wapnia) w dniu rejestracji i dodać kroplami CaCl₂ po 15 minutach karbonowania (95%_O2 i 5% CO_{2 ).} Końcowy roztwór 1x zawiera (w mM): 120 NaCl, 5 KCl, 25 NaHCO₃, 0,8 Na₂HPO₄, 0,1 NaH₂PO₄, 2 CaCl₂, 1_MgSO4 i 10 D-glukozy.
2. Użyj dwóch wewnętrznych rozwiązań, aby scharakteryzować oscylacje SAC. Zbadać przydatność przygotowanych roztworów w przedłużonych zapisach patch-clampów całokomórkowych na dorosłych myszach RGC i przechowywać zweryfikowane partie w 500 μl podwielokrotnościach w temperaturze -20 °C do czasu użycia.
   1. Do rejestrowania oscylacji potencjału błonowego należy użyć wewnętrznego roztworu na bazie potasu, który zawiera (w mM): 125 K-glukonian, 8 NaCl, 4 ATP-Mg, 0,5 Li-GTP, 5 EGTA, 10 HEPES i 0,2% biocytyny (w/v). Dostosuj pH do 7,3 za pomocą KOH.
   2. Do rejestrowania pobudzających i hamujących prądów postsynaptycznych należy użyć wewnętrznego roztworu na bazie cezu, który zawiera (w mM): 100 Cs-metanosulfonianu, 8 NaCl, 4 ATP-Mg, 0,5 Li-GTP, 5 EGTA, 10 HEPES i 0,2% biocytyny (w/v). Dostosuj pH do 7,3 za pomocą CsOH.

2. Przygotowanie do Dnia Nagrania

1. Aby przygotować membranę nitrocelulozową z otwartymi otworami, należy ręcznie przebić membranę za pomocą specjalnego dziurkacza wykonanego z igły strzykawkowej 16 G i spłaszczyć membranę między dwiema czystymi szklanymi płytkami. W przypadku siatkówki z pełnym mocowaniem wykonaj centralny otwór o średnicy 0,2 mm i otocz go 4 większymi otworami o średnicy 1-1,2 mm.
2. Aby uzyskać niestandardowy filament do wypełniania do ładowania roztworu wewnętrznego do elektrod, stopić końcówkę pipety o pojemności 10 μl na środku i delikatnie wydłużyć stopioną część, aż ostygnie i stwardnieje. Tuż przed użyciem użyj czystej żyletki, aby przyciąć filament, aż będzie nieco dłuższy niż pipety z plastrem.
3. Wyciągnij pipety plastrowe w programowalnym ściągaczu z rurki ze szkła borokrzemianowego z wewnętrznym żarnikiem. Mikropipety należy wyprodukować w dniu eksperymentu i natychmiast je zużyć.
   UWAGA: Do nagrywania SAC używamy następującego ustawienia ściągacza: ciepło: 484; uciąg: 0; prędkość: 25; czas opóźnienia: 1; Ciśnienie: 400 i wartość rampy 462. Średnica zewnętrzna i wewnętrzna rurek borokrzemianowych wynosi odpowiednio 1,65 mm i 1,0 mm. Rezystancja pipet wynosi 10-14 MΩ.
4. Na godzinę przed pobraniem tkanek rozmrozić probówkę z roztworem wewnętrznym, potrząsając nią na wirze przez >30 min.

3. Rozwarstwienie siatkówki

1. Znieczulij zwierzę 4% izofluranem w tlenie, aż zwierzę straci reakcję na uszczypnięcie palca u nogi. Złóż zwierzę w ofierze przez zwichnięcie szyjki macicy.
2. Odetnij obie gałki oczne od nerwów wzrokowych w odległości 1-2 mm od główek nerwu wzrokowego za pomocą nożyczek do tęczówki z prostym zakończeniem.
3. Rzuć gałki oczne na czysty ręcznik papierowy, aby usunąć krew, a następnie zanurz je w roztworze Ringera karbogenowanych ssaków. Przebij otwór w rąbku za pomocą igły 23 G i przetnij gałki oczne, przecinając wzdłuż rąbka mikronożyczkami. Usuń rogówkę i soczewkę za pomocą drobnych kleszczyków.
   1. W przypadku całego montażu siatkówki delikatnie oderwij całą siatkówkę od pigmentowanego nabłonka za pomocą cienkich kleszczyków i wykonaj cztery 1,5-2 mm ortogonalne nacięcia od krawędzi w kierunku głowy nerwu wzrokowego.
4. Zanurz dziurkowaną membranę nitrocelulozową w naczyniu i delikatnie przeciągnij po niej siatkówkę stroną GCL do góry. Umieść głowę nerwu wzrokowego w środkowym otworze podczas przygotowywania całej siatkówki. Przenieś błonę z siatkówką do innego czystego naczynia. Delikatnie spłaszcz siatkówkę cienkim pędzlem, aby wyglądała jak krzyż maltański i połóż wszystkie cztery krawędzie na otworach.
   1. Jeśli jednorazowo ma być badana część siatkówki, należy przeciąć każdą muszlę oczną przygotowaną z kroku 3.3 na 3-4 części za pomocą żyletki z przyczepionymi resztkami pigmentowanego nabłonka. Niewykorzystane kawałki należy chronić przed światłem w karbogenicznym roztworze zewnętrznym i zużyć w ciągu 12 godzin.
5. Osusz membranę nitrocelulozową kawałkiem suchej bibuły filtracyjnej i usuń szklistą i wewnętrzną membranę ograniczającą za pomocą kleszczy i pędzla.
6. Upewnij się, że wszystkie krawędzie siatkówki są całkowicie przymocowane do membrany przed przeniesieniem zespołu do komory nagrywającej z uszczelnionym szklanym szkiełkiem nakrywkowym na dole. Przymocuj membranę smarem próżniowym do szkiełka nakrywkowego i ponownie nawodnij siatkówkę roztworem zewnętrznym. Uważaj, aby nie uwięzić żadnych pęcherzyków powietrza pod zespołem.
7. Ustaw komorę na stoliku mikroskopu pionowego. Ukrwić komorę ciepłym (34-35 °C) karbogenicznym roztworem zewnętrznym w ilości ~3 ml na minutę.
8. Najpierw zbadaj siatkówkę pod soczewką obiektywu 10x, a następnie użyj soczewki zanurzonej w wodzie 60x, aby zobaczyć neurony GCL i INL pod wpływem różnicowego kontrastu interferencyjnego (DIC) i/lub epifluorescencji. Aby uwidocznić SAC wykazujące ekspresję tdTomato, użyj białego źródła światła LED w połączeniu z filtrem wzbudzenia o długości fali 554 nm i filtrem emisyjnym o długości fali 581 nm.

4. Nagrywanie z użyciem clampu krosowego całej komórki z płaskiej siatkówki

1. Przefiltruj roztwór wewnętrzny przez filtr strzykawkowy do niestandardowego filamentu do wypełniania.
2. Włóż filament do świeżo wyciągniętej mikropipety i dozuj roztwór wewnętrzny w pobliżu końcówki, aż roztwór pokryje srebrny drut elektrody na >5 mm. Zamocuj mikropipetę na uchwycie elektrody z kijkiem ssącym, za pomocą którego można regulować ciśnienie wewnątrz elektrody, popychając lub pociągając tłok plastikowej strzykawki o pojemności 10 ml podłączonej do rurki.
3. Znajdź pipetę pod obiektywem i zejdź ją do ~100 μm powyżej siatkówki. W trybie wtórnika prądowego (I = 0) użyj przesunięcia DC, aby wyzerować stojący sygnał napięcia DC. Zmierz rezystancję pipety w trybie cęgów prądowych (I_Clamp), wstrzykując prądy o fali prostokątnej o stałej amplitudzie przez pipetę, gdy znajduje się ona w kąpieli, i zneutralizuj różnicę, obracając pokrętło Raccess. Użyj odczytu na pokrętle Raccess, aby obliczyć rezystancję pipety zgodnie z prawem Ohma.
4. Powoli ustaw elektrodę na wysokości ~10 μm nad siatkówką. Zastosuj nadciśnienie do elektrody. Obserwuj, jak zmienia się odbicie w pobliżu końcówki pipety, gdy zbliża się ona do siatkówki. Szybko, ale delikatnie wepchnij pipetę do GCL i natychmiast zmniejsz nadciśnienie.
5. Przesuń pipetę w kierunku oznakowanego neuronu. Unikaj kontaktu z innymi neuronami, naczyniami krwionośnymi i końcami nóg komórek Müllera. W razie potrzeby zastosuj większe nadciśnienie, aby zapobiec zatkaniu elektrody.
6. Umieść końcówkę pipety w pobliżu linii środkowej znakowanego neuronu, aż będzie widoczny wgłębienie. Zwolnij nadciśnienie i pozwól, aby błona plazmatyczna odbiła się z powrotem na końcówkę pipety.
7. Zastosuj do pipety prądy ujemne o natężeniu od 20 do 120 pA, aby pomóc w tworzeniu uszczelnienia giga-omowego. W razie potrzeby zastosuj delikatne ssanie, aby wciągnąć błonę plazmatyczną do pipety. Odczekaj 5 minut po utworzeniu uszczelnienia, aby pękła błona komórkowa. Pozwala to na usunięcie rozlanego roztworu wewnętrznego przez superfuzję. Rozerwij membranę przez delikatne zasysanie.
8. Po pęknięciu membrany i w bieżącym trybie zacisku włącz balans mostka i wyreguluj go za pomocą pokrętła Raccess.
   UWAGA: W przypadku małej komórki, takiej jak SAC, wymagana jest tylko niewielka regulacja, jeśli taka istnieje. Alternatywnie, rejestruj pobudzające i hamujące prądy postsynaptyczne w trybie zacisku napięciowego (V_Clamp), utrzymując komórkę przy potencjałach odwrócenia odpowiednio chlorku (około -75 mV) i glutaminianu (około 0 mV). W razie potrzeby sprawdź i wyreguluj położenie pipety, aby dostosować się do sporadycznego dryfu siatkówki i/lub mikromanipulatora.
9. Aby zarejestrować potencjał błonowy lub zmianę prądu przed, w trakcie i po leczeniu farmakologicznym, należy przygotować blokery synaptyczne (np. CNQX, AP5, pikrotoksynę, tubokurarynę itp.) i modulatory kanałów (np. flupirtynę, dopaminę, kwas meklofenamowy itp.) świeże w dniu eksperymentu z zamrożonych zapasów. Rozcieńczyć leki karbogenicznym roztworem Ringera. Nakładaj je partiami poprzez perfuzję.
10. Po nagraniu delikatnie wyjmij pipetę z somy. Przenieś zestaw z komory do czystego naczynia. Odłącz i ponownie przymocuj siatkówkę do innej spłaszczonej membrany nitrocelulozowej bez wybitych otworów, aby zapewnić płaskość siatkówki podczas mocowania.
11. Napraw siatkówkę, zanurzając ją w 4% paraformaldehydzie na 30 minut w temperaturze pokojowej. Usuń siatkówkę z membrany nitrocelulozowej i dokładnie ją spłucz 1x PBS. Ujawnij morfologię zarejestrowanych komórek przez barwienie O/N streptawidyną sprzężoną z barwnikiem rozcieńczoną w 1x PBS 0,4% Triton X-100 w temperaturze 4 °C¹⁴. Zamontuj siatkówkę w podłożu zapobiegającym blaknięciu i obserwuj zarejestrowane komórki za pomocą skaningowego mikroskopu konfokalnego.
    UWAGA: Zabiegi z udziałem paraformaldehydu, który jest lotny i toksyczny, powinny być przeprowadzane w komorze ciągowej dla bezpieczeństwa.

Reprezentatywne nagrania SAC typu ON i OFF z bezkofeinowej siatkówki myszy są pokazane na rysunku 1. Komórki cholinergiczne zarówno w GCL, jak i INL można niezawodnie zidentyfikować za pomocą fluorescencji tdTomato i ukierunkować na zapis klamry krosowej całej komórki pod DIC (ryc. 1A), aby ujawnić oscylacje ich potencjałów błonowych (górne ślady) i prądy synaptyczne, które je napędzają (dolne ślady, ryc. 1B). Hamujące i pobudzające prądy synaptyczne ujawniają się poprzez utrzymywanie komórek odpowiednio przy napięciu 0 mV i -75 mV w warunkach zacisku napięcia (ryc. 1B, dolne ścieżki). Typowe poziomy arboryzacji dendrytycznej i stratyfikacji SAC w IPL (ryc. 1C) można uwidocznić za pomocą barwienia streptawidyną post hoc dla wewnętrznie dializowanej biocytyny. Rytmiczność i częstotliwość fluktuacji potencjału błonowego oraz zmian prądu postsynaptycznego można określić ilościowo, obliczając gęstość widmową mocy. Blokada farmakologiczna lub jej brak może być wykorzystana do rozpoznania różnych mechanizmów synaptycznych leżących u podstaw oscylacji potencjału błonowego7.

Ryc. 1. Morfologia i potencjały błonowe komórek amakrynowych ON i OFF w siatkówce myszy Nob. (A) Zarówno ON-SAC w GCL, jak i OFF-SAC w INL były łatwo identyfikowane przez ekspresję tdTomato sterowaną przez Cre i kierowane do rejestracji w DIC. Podziałka wynosi 20 μm, jak wskazano. (B) Górne ślady to zmiany potencjału błony zarejestrowane z ON- i OFF-SAC, jak wskazano. Dolne ślady to reprezentatywny rytmiczny pobudzający prąd postsynaptyczny (EPSC), który napędza oscylację potencjału błonowego i arytmiczny hamujący prąd postsynaptyczny (IPSC). (C) Charakterystyka histologiczna post hoc zarejestrowanych komórek wskazuje na typową morfologię dendrytyczną SAC i poziomy stratyfikacji w IPL. Podziałka wynosi 50 μm, jak wskazano. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.