Test fagocytozy na obecność komórek apoptotycznych w zarodkach Drosophila

U zwierząt metazoa, np. nicienia Caenorhabditis elegans, muszki owocowej Drosophila melanogaster oraz myszy i ludzi, duża liczba komórek ulega apoptozie podczas rozwoju, aby ukształtować swoje ciała, a w wieku dorosłym, aby utrzymać homeostazę^1,2. Komórki apoptotyczne muszą być szybko usunięte, ponieważ wywołują stan zapalny w otaczających tkankach, uwalniając immunogenne materiały wewnątrzkomórkowe, jeśli nie zostaną całkowicie usunięte³. Aby ułatwić szybkie usunięcie, komórki apoptotyczne prezentują tak zwane sygnały eat-me, które są rozpoznawane przez receptory pochłaniania fagocytów i są eliminowane przez fagocytozę^3,4,5^,6. Tak więc fagocytoza odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu homeostazy gospodarza, a zatem ważne jest wyjaśnienie mechanizmów molekularnych leżących u podstaw fagocytozy komórek apoptotycznych.

Mechanizmy odpowiedzialne za fagocytozę komórek apoptotycznych wydają się być ewolucyjnie zachowane wśród gatunków nicieni, much i myszy⁷. Obecnie dostępnych jest kilka testów fagocytozy do oceny pochłaniania komórek apoptotycznych u tych modelowych zwierząt. U C. elegans 131 komórek somatycznych ulega zaprogramowanej śmierci komórkowej podczas rozwoju, a zwłoki komórek są fagocytozowane przez sąsiednie komórki, które są nieprofesjonalnymi fagocytami⁸. Tak więc liczenie liczby pozostałych zwłok komórkowych u C. elegans wskazuje na poziom fagocytozy in vivo. Poszukując mutantów nicieni, które wykazują zwiększoną liczbę martwych komórek, zidentyfikowano i scharakteryzowano genetycznie kilka genów niezbędnych do fagocytozy^9,10,11,12.

Testy fagocytozy ex vivo z pierwotnymi hodowlami fagocytów, zazwyczaj makrofagów, są często stosowane u myszy. Komórki apoptotyczne są przygotowywane przy użyciu linii komórkowych, takich jak komórki Jurkat, i są mieszane z pierwotnymi fagocytami. Po kilkugodzinnej inkubacji liczy się całkowitą liczbę fagocytów i fagocytów pochłaniających w celu oceny poziomu fagocytozy. Jako zaawansowaną modyfikację tej metody, grupa Nagaty opracowała test fagocytozy ex vivo z komórkami wykazującymi ekspresję opornej na kaspazę ICAD (inhibitora DNazy aktywowanej kaspazą), w której komórki apoptotyczne nie ulegają apoptotycznej fragmentacji DNA, ale DNA jest nadal rozszczepiane, gdy komórki są fagocytozowane. Kiedy komórki te są używane jako cele apoptotyczne w teście fagocytozy, tylko DNA pochłoniętych komórek apoptotycznych jest fragmentowane i barwione przez znakowanie końca nacięcia dUTP za pośrednictwem TdT (TUNEL). Dlatego poziom pochłonięcia komórek apoptotycznych mierzy się poprzez zliczanie sygnałów TUNEL w mieszaninie fagocytów i komórek apoptotycznych¹³.

U D. melanogaster, profesjonalne fagocyty zwane hemocytami, makrofagi Drosophila, są odpowiedzialne za fagocytozę komórek apoptotycznych^14,15. Oprócz testów fagocytozy in vitro z liniami komórkowymi hodowli, dostępne są testy fagocytozy in vivo z całymi zarodkami Drosophila. Zarodki Drosophila są potężnym narzędziem do badania poziomu pochłaniania komórek apoptozy, ponieważ wiele komórek ulega apoptozie i jest fagocytozowanych przez hemocyty podczas rozwoju embrionalnego^14,15,16. Przykładem testu fagocytozy in vivo jest metoda opracowana przez grupę Franka. W ich metodzie hemocyty są wykrywane przez barwienie immunologiczne peroksydazyny, markera hemocytu, komórki apoptotyczne są barwione za pomocą barwnika jądrowego, 7-aminoaktynomycyny D w całych zarodkach Drosophila, a liczba komórek podwójnie dodatnich jest liczona jako sygnał fagocytozy¹⁷. Inny przykład testu fagocytozy na zarodkach opiera się na opisanej powyżej koncepcji metody Nagaty; jednak fagocytozę in vivo ocenia się przy użyciu zarodków zmutowanych much dCAD (Drosophila caspase-activated DNase)^18,19. Te testy fagocytozy in vivo są przydatne do bezpośredniej obserwacji fagocytozy in situ. Trudności wiążą się jednak z wykluczeniem ewentualnej stronniczości na etapie liczenia komórek fagocytozy, ponieważ ze względu na jego grubość trudno jest zaobserwować wszystkie fagocyty i komórki apoptotyczne w całych zarodkach.

Aby przezwyciężyć to ograniczenie, opracowaliśmy nowy test fagocytozy na zarodkach Drosophila. W naszej metodzie, aby łatwo policzyć hemocyty fagocytozy, całe zarodki są homogenizowane w celu przygotowania rozproszonych komórek embrionalnych. Fagocyty są wykrywane przez barwienie immunologiczne markera fagocytów, a komórki apoptotyczne są wykrywane przez TUNEL z tymi rozproszonymi komórkami embrionalnymi. Wykorzystanie rozproszonych komórek embrionalnych umożliwia nam pomiar poziomów fagocytozy in vivo, tak jakbyśmy przeprowadzili test fagocytozy in vitro, który precyzyjnie określa ilościowo poziom fagocytozy. Wszystkie genotypy much mogą być wykorzystane w tym teście, jeśli rozwiną się do stadium 16 zarodków²⁰, stadium rozwoju, w którym apoptotyczne usuwanie komórek przez fagocytozę jest najobfitsze. Zaletą tej metody jest ilościowa ocena poziomu fagocytozy, a tym samym może przyczynić się do identyfikacji nowych cząsteczek biorących udział w fagocytozie komórek apoptotycznych in vivo.

1. Przygotowanie

1. Przygotowanie talerzy agarowych ze świeżym sokiem winogronowym
   1. Dodaj 100 ml wody do 4,4 g agaru i podgrzej mieszaninę w kuchence mikrofalowej, aby rozpuścić agar.
   2. Do roztworu agaru dodać 80 ml świeżego soku winogronowego, 5 ml kwasu octowego i 5 ml etanolu.
   3. Wlać około 1,5 ml roztworu pipetą na każde szklane szkiełko i pozostawić do zestalenia.
2. Przygotowanie 6 cm talerzy z agarozą
   1. Dodaj 50 ml wody do 0,5 g agarozy i podgrzej mieszaninę w kuchence mikrofalowej, aby rozpuścić agarozę.
   2. Wlać około 2,5 ml roztworu agarozy na 6 cm naczynie za pomocą pipety.

2. Etap 16 Pobieranie zarodków

1. Zbierz dorosłe muchy i dodaj 200 samic i 200 samców do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
2. Włóż talerz świeżego agaru z sokiem winogronowym na drożdżach do probówki o pojemności 50 ml i zamknij biszkoptem.
3. Inkubować muchy w temperaturze 16 °C w świetle przez 2 - 3 dni. Zmieniaj talerz raz dziennie.
4. Przenieś muchy do ciemności w temperaturze 25 °C na 1 godzinę.
5. Wymień stary talerz na nowy bez drożdży. Pozwól muchom złożyć jaja przez 2 godziny.
6. Zebrać płytkę i inkubować w temperaturze 16 °C przez 26 godzin.
7. Zebrać zarodki z płytki za pomocą pędzla do 1 ml PBS zawierającego 0,2% (v/v) Triton X-100.
8. Umyj zarodki dwukrotnie 1 ml PBS zawierającego 0,2% (v/v) Triton X-100.
9. W celu usunięcia kosmówki należy dodać 1,2 ml roztworu podchlorynu sodu (2,2 - 3,4% Cl) do zarodków na 3 minuty.
10. Umyj zarodki 4 razy 1 ml PBS zawierającego 0,2% (v/v) Triton X-100.
11. Umieść zarodki na 6-centymetrowych talerzach z agarozą. Pobrać zarodki w stadium 16 pod mikroskopem zgodnie z opisem Roberts²⁰. Zbierz około 50 zarodków do mikroprobówki Treff o pojemności 1,5 ml za pomocą mikropipety.

3. Przygotowanie komórek embrionalnych

1. Umyj zarodki dwukrotnie 150 μl PBS.
2. Homogenizować zarodki 30 razy w mikroprobówce o pojemności 1,5 ml i mieszalniku granulek w obecności 200 μl kolagenazy (0,25% (w/v)) w PBS.
3. Rozproszyć komórki embrionalne przez pipetowanie 10 razy i przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 1,5 ml. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 1 minutę w łaźni wodnej. Powtórz ten krok dwukrotnie.
4. Dodać 800 μl PBS do zawiesiny komórek i odwirować przy 1400 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut.
5. Usunąć supernatant i dodać do komórek 200 μl trypsyny (0,25% (w/v)) w PBS. Rozproszyć komórki embrionalne, pipetując 50 razy.
6. Przefiltrować zawiesinę komórkową za pomocą sitka do komórek o wielkości 70 μm.
7. W celu zatrzymania aktywności trypsyny należy dodać 40 μl inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej do zawiesiny przefiltrowanych komórek. Dodać 800 μl PBS i odwirować przy 1 400 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut.
8. Usunąć supernatant, zawiesić wytrącone komórki w 200 μl PBS i odwirować w temperaturze 1400 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut.
9. Usunąć supernatant i zawiesić wytrącone komórki w 30 μl PBS.
10. Przygotować zawiesinę komórek zamontować na szkiełkach pokrytych aminopropylotrietoksysilanem i odczekać 10 - 15 minut, aż komórki przyczepią się do szkiełek.
11. Usunąć pozostały roztwór ze szkiełek za pomocą pipety. Zamontuj 60 - 70 μl PBS zawierającego 4% (w/v) PFA (paraformaldehyd) na komórkach przez 10 - 15 minut w celu utrwalenia.
12. Usuń roztwór utrwalający i umieść szkiełka szklane w PBS na dłużej niż 1 minutę.

4. Barwienie hemocytów

1. Barwienie immunologiczne przeciwciałem anty-Croquemort
   1. Szkiełka należy stopniowo moczyć w metanolu przez 10 min, w PBS zawierającym 0,2% (v/v) Triton X-100 przez 10 min, a następnie w PBS przez 10 min.
   2. Umieścić 20 μl 5% (v/v) surowicy całej świni w PBS zawierającym 0,2% (v/v) Triton X-100 na komórkach w celu zablokowania. Inkubować szkiełka w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
   3. Usuń roztwór ze szkiełek podstawowych i umieść 20 μl surowicy anty-Croquemort ^19,21 (0,1% (v/v)) w PBS zawierającym 0,2% (v/v) Triton X-100 na komórkach. Szkiełka inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.
   4. Namocz szkiełka podstawowe w PBS zawierającym 0,2% (v/v) Triton X-100 przez 10 minut 5 razy.
   5. Namocz szkiełka podstawowe w PBS przez 10 minut.
   6. Umieścić 20 μl alkalicznej anty-szczurzej IgG znakowanej fosfatazą alkaliczną (0,5% (v/v)) w PBS zawierającym 0,2% (v/v) Triton X-100 i 5% (v/v) surowicy całej świni na komórkach w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
   7. Namocz szkiełka podstawowe w PBS zawierającym 0,2% (v/v) Triton X-100 przez 10 minut 5 razy.
   8. Szkiełka podstawowe zanurzyć w buforze zawierającym 100 mM Tris-HCl, pH 9,5, 100 mM NaCl i 50 mM MgCl₂ przez 10 minut.
   9. Zamontuj na komórkach roztwór substratu fosfatazy zawierający 0,23 mg/ml 5-bromo-4-chloro-3-indolilofosforanu (BCIP), 0,35 mg/ml nitro niebieskiego tetrazolu (NBT), 100 mM Tris-HCl, pH 9,5, 100 mM NaCl i 50 mM MgCl₂
   .
   10. Obserwuj komórki pod mikroskopem pod kątem prawidłowego barwienia. Gdy w granulkach hemocytów pojawią się silne fioletowe sygnały, usuń roztwór substratu i zanurz szkiełka w buforze składającym się z 10 mM Tris-HCl, pH 8,5 i 1 mM EDTA. Zaleca się barwienie przez około 5 - 10 minut.
2. Barwienie immunologiczne przeciwciałem anty-GFP (inna opcja barwienia hemocytów)
   1. Szkiełka należy stopniowo moczyć w metanolu przez 10 min, PBS zawierające 0,2% (v/v) Triton X-100 przez 10 min, a PBS przez 10 min.
   2. Umieścić 20 μl 5% (v/v) surowicy całej świni w PBS zawierającym 0,2% (v/v) Triton X-100 na komórkach w celu zablokowania. Inkubować szkiełka w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
   3. Usunąć roztwór na szkiełkach i umieścić na komórkach 20 μl mysiego przeciwciała anty-GFP (1% (v/v))/PBS zawierającego 0,2% (v/v) Triton X-100. Inkubować szkiełka w temperaturze pokojowej przez noc.
   4. Namocz szkiełka podstawowe w PBS zawierającym 0,2% (v/v) Triton X-100 przez 10 minut 5 razy.
   5. Namocz szkiełka podstawowe w PBS przez 10 minut.
   6. Umieścić 20 μl alkalicznej anty-mysiej IgG znakowanej fosfatazą alkaliczną (0,5% (v/v)) w PBS zawierającym 0,2% (v/v) Triton X-100 i 5% (v/v) surowicy całej świni na komórkach w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
   7. Namocz szkiełka podstawowe w PBS zawierającym 0,2% (v/v) Triton X-100 przez 10 minut 5 razy.
   8. Szkiełka podstawowe należy namoczyć w buforze składającym się ze 100 mM Tris-HCl, pH 9,5, 100 mM NaCl i 50 mM MgCl₂ przez 10 minut.
   9. Zamontuj na komórkach roztwór substratu fosfatazy zawierający 0,23 mg/ml BCIP, 0,35 mg/ml NBT, 100 mM Tris-HCl, pH 9,5, 100 mM NaCl i 50 mM MgCl₂
   .
   10. Obserwuj komórki pod mikroskopem pod kątem prawidłowego barwienia. Gdy fioletowe sygnały pojawią się w całych hemocytach, usuń roztwór substratu i zanurz szkiełka w buforze składającym się z 10 mM Tris-HCl, pH 8,5 i 1 mM EDTA. Zaleca się barwienie przez około 10 - 15 minut.

5. Barwienie komórek apoptotycznych przez TUNEL

1. Namocz szkiełka podstawowe w PBS przez 5 minut.
2. Powtórz tę czynność z nowym PBS.
3. Zamontuj bufor równowagi (patrz tabela materiałów) na komórkach na 10 minut.
4. Wyjąć roztwór ze szkiełek podstawowych i umieścić 20 μl roztworu TdT zawierającego 5 μl końcowej deoksynukleotydylotransferazy i 15 μl buforu reakcyjnego na komórkach w temperaturze 37 °C na 1 godzinę.
5. Usunąć roztwór ze szkiełek podstawowych i namoczyć szkiełka w buforze składającym się z 0,5 ml buforu STOP/Wash i 17 ml wody.
6. Namocz szkiełka w PBS przez 5 minut 3 razy.
7. Zamontuj 20 μl peroksydazy anty-digoxigeniny na komórkach w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
8. Namocz szkiełka szklane w PBS przez 5 minut 4 razy.
9. Szkiełka podstawowe namoczyć w roztworze substratu peroksydazy składającym się z 30 ml 50 mM Tris-HCl o pH 7,5 zawierającym pełną mikroszpatułkę tetrahydrichlorku 3,3'-diaminobenzydyny (DAB) i 0,002% (v/v)_H2O2 przez 30 s.
10. Powtarzaj krok 5.9, aż komórki apoptotyczne zostaną zabarwione na brązowo. Namocz szkiełka szklane w wodzie, aby zatrzymać reakcję peroksydazy.
11. Umieść komórki w wodzie do obserwacji.

6. Zmierz poziom fagocytozy komórek apoptotycznych

1. Obserwuj próbki pod mikroskopem świetlnym w celu oceny poziomu fagocytozy. Policz komórki Croquemort-dodatnie lub komórki GFP-dodatnie jako hemocyty, komórki TUNEL-dodatnie jako komórki apoptotyczne i komórki podwójnie dodatnie jako hemocyty fagocytozujące.
2. Indeks fagocytarny definiuje się jako liczbę komórek podwójnie dodatnich w stosunku do całkowitej liczby komórek Croquemort-dodatnich lub komórek GFP-dodatnich. Zaleca się obserwację ponad 300 hemocytów.

W celu zbadania fagocytozy komórek apoptotycznych, zarodki Drosophila w stadium rozwojowym 16 zostały zebrane i przygotowane jako rozproszone komórki. Hemocyty, makrofagi Drosophila, zostały wybarwione metodą immunocytochemiczną dla markera hemocytu "Croquemort"17,22 przy użyciu specyficznego przeciwciała19,21, a komórki apoptotyczne zostały wybarwione przez TUNEL w rozproszonych komórkach embrionalnych (Rysunek 1A). Croquemort, receptor związany z Drosophila CD36, ulega specyficznej ekspresji na wszystkich embrionalnych hemocytach22 i wykazano, że genetycznie jest zaangażowany w usuwanie komórek apoptotycznych w zarodkach Drosophila17. Komórki Croquemort-dodatnie mają fioletowe sygnały w małych ziarnistościach swoich komórek. Komórki TUNEL-dodatnie wykazują brązowy sygnał w całych ciałach. Komórki TUNEL-dodatnie są mniejsze niż inne komórki, a niektóre znajdują się wewnątrz komórek Croquemort-dodatnich, które są uważane za martwe komórki fagocytozowane. We wszystkich komórkach embrionalnych zwykle obserwuje się od 2 do 10% komórek Croquemort-dodatnich i 1-5% komórek TUNEL-dodatnich.

U Drosophila istnieją dwie ścieżki sygnałowe do pochłaniania komórek apoptotycznych. Dwa receptory fagocytozy dla odpowiednich szlaków, Draper i integryna αPS3βν, niezależnie rozpoznają martwe komórki19,21,23,24,25. Draper jest białkiem transbłonowym, które posiada nietypowe sekwencje podobne do naskórkowego czynnika wzrostu (EGF) w regionie zewnątrzkomórkowym oraz dwa fosforylujące motywy NPxY i YxxL w części wewnątrzkomórkowej26. Integryna αPS3βν jest również receptorem transbłonowym składającym się z heterodimeru podjednostek α i β25. Rysunek 1B pokazuje stosunek hemocytów fagocytozujących do całkowitej liczby hemocytów w pojedynczych zmutowanych zarodkach typu dzikiego lub drpr lub Itgbn. Licząc wszystkie komórki Croquemort-dodatnie (całkowite hemocyty) oraz podwójnie dodatnie komórki Croquemort i TUNEL (hemocyty fagocytozujące), obliczyliśmy indeks fagocytarny jako liczbę hemocytów fagocytozujących do całkowitej liczby hemocytów. Indeks fagocytarny był niższy w mutancie drpr lub Itgbn niż w typie dzikim, podczas gdy liczba hemocytów i komórek apoptotycznych była podobna (Rysunek 1C-D), co wskazuje, że te dwa geny są wymagane do pochłonięcia komórek apoptotycznych, jak wcześniej informowano.

Gdy przeciwciało anty-Croquemort nie jest dostępne lub badane są zmutowane linie ze zmienioną ekspresją Croquemorta, musimy wybrać inną opcję wykrywania hemocytów. Zarodki ze sterownikiem GAL4 kontrolowanym przez promotor specyficzny dla hemocytów (srpHemo-GAL4) i genem GFP kontrolowanym przez sekwencję aktywacji w górę (UAS), w tym miejsce wiązania GAL4 (UAS-EGFP), mają hemocyty znakowane GFP27, co umożliwia nam wykrywanie hemocytów za pomocą anty-GFP. Rysunek 2A pokazuje obraz uzyskany po wykryciu hemocytów i komórek apoptotycznych z barwieniem immunologicznym za pomocą przeciwciała anty-GFP oraz TUNEL w komórkach embrionalnych z srpHemo-GAL4UAS-EGFP. Podczas gdy przeciwciało anty-Croquemort barwi małe granulki w komórkach, przeciwciało anty-GFP barwi całe hemocyty. Podobnie jak w przypadku Rysunek 1A, we wszystkich komórkach embrionalnych obserwuje się 2 - 6% komórek GFP dodatnich i 1 - 5% komórek TUNEL-dodatnich. Niektóre komórki TUNEL-dodatnie są wykrywane wewnątrz komórek GFP-dodatnich, które są uważane za martwe komórki fagocytozowane. Nokaut za pośrednictwem RNAi jest łatwy do oceny dowolnych genów pod kątem ich udziału w fagocytozie poprzez krzyżowanie muszek z UAS-dsRNA genów kandydujących z srpHemo-GAL4UAS-EGFP. Knockdown drpr lub Itgbn za pośrednictwem RNAi zmniejszył indeks fagocytarny (Figura 2B), podczas gdy liczba hemocytów i komórek apoptotycznych w komórkach embrionalnych była porównywalna (Figura 2C-2D), co ponownie wskazuje, że te receptory fagocytozy są zaangażowane w fagocytozę komórek apoptotycznych. Podobne indeksy fagocytarne uzyskuje się z obu metod wykrywania hemocytów, co sugeruje, że obie są zgodne.

Rysunek 1: Barwienie komórek embrionalnych za pomocą przeciwciała anty-Croquemort i TUNEL. (A) Obrazy jasnego pola rozproszonych komórek embrionalnych szczepu w1118 poprzez barwienie immunologiczne przeciwciałem anty-Croquemort i TUNEL. Pokazane są powiększone widoki reprezentatywnych dodatnio lub ujemnie zabarwionych komórek (4 górne panele) i pola o małej mocy (dolny panel). Podziałka skali, 5 μm (góra); 50 μm (na dole). (B) Stosunek hemocytów Croquemort-dodatnich z sygnałem TUNEL do wszystkich hemocytów Croquemort-dodatnich w mutancie drpr lub Itgbn analizowano na rozproszonych komórkach embrionalnych. (C) Stosunek hemocytów Croquemort-dodatnich do wszystkich komórek w mutancie drpr lub Itgbn analizowano z rozproszonymi komórkami embrionalnymi. (D) Stosunek komórek apoptotycznych TUNEL-dodatnich do wszystkich komórek w mutancie drpr lub Itgbn analizowano z rozproszonymi komórkami embrionalnymi. Genotypów; w1118 (kontrola typu dzikiego), drprΔ5 (mutant drpr) i Itgbn2 (integryna βν mutant). Dane były reprezentatywne dla trzech niezależnych eksperymentów i analizowane za pomocą testu t-Studenta. W każdym eksperymencie zaobserwowano około 300 hemocytów Croquemort-dodatnich, a wartości reprezentują średnią±S.D. trzech mikroskopijnych pól. *; p <0,05, n.s.; różnica nie jest znacząca. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Barwienie komórek embrionalnych za pomocą anty-GFP i TUNEL. (A) Obrazy jasnego pola rozproszonych komórek embrionalnych szczepu srpHemo-GAL4UAS-EGFP/+ poprzez barwienie immunologiczne przeciwciałem anty-GFP i TUNEL. Pokazane są powiększone widoki reprezentatywnych dodatnio lub ujemnie zabarwionych komórek (4 górne panele) i pola o małej mocy (dolny panel). Podziałka = 5 μm (góra); 50 μm (na dole). (B) Stosunek hemocytów GFP-dodatnich z sygnałem TUNEL do wszystkich hemocytów GFP-dodatnich w muszkach knockdown drpr lub Itgbn za pośrednictwem RNAi analizowano z rozproszonymi komórkami embrionalnymi. (C) Stosunek hemocytów GFP-dodatnich do wszystkich komórek w muchach knockdown drpr lub Itgbn za pośrednictwem RNAi analizowano z rozproszonymi komórkami embrionalnymi. (D) Stosunek TUNEL-dodatnich komórek apoptotycznych do wszystkich komórek w muchach knockdown drpr lub Itgbn za pośrednictwem RNAi analizowano z rozproszonymi komórkami embrionalnymi. Genotypów; RNAi - : y w/w; srpHemo-GAL4 UAS-EGFP/+, RNAi drpr: y w/w; srpHemo-GAL4 UAS-EGFP/+; UAS-drpr-IR/+, RNAi Itgbn: y w/w; srpHemo-GAL4 UAS-EGFP/+; UAS-Itgbn-IR/+. Dane były reprezentatywne dla trzech niezależnych eksperymentów i analizowane za pomocą testu t-Studenta. W każdym eksperymencie zaobserwowano około 300 hemocytów GFP-dodatnich, a wartości reprezentują średnią±S.D. trzech mikroskopijnych pól. *; p <0,05, n.s.; różnica nie jest znacząca. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.