Przewlekły brak snu u młodych myszy poprzez delikatne obchodzenie się z nim

Sen odgrywa kluczową rolę w plastyczności neuronów oraz tworzeniu i eliminowaniu synaps podczas rozwoju mózgu^1,2. W szczególności sen z szybkimi ruchami gałek ocznych (REM) jest niezbędny do tworzenia stabilnych obwodów synaptycznych zarówno poprzez wzmacnianie określonych synaps, jak i przycinanie synaptyczne². Farmakologiczny brak snu we wczesnym okresie życia prowadzi do wielu deficytów fizjologicznych i behawioralnych^3,4. Oprócz farmakologicznej deprywacji snu, inne formy deprywacji snu, takie jak ciągłe drżenie, wymuszona lokomocja lub prezentacja bodźca awersyjnego, były związane z objawami podobnymi do depresji w wieku dorosłym, różnymi wzorcami aktywacji neuronów oraz zmianami w czasie snu i ciągłości snu w okresie rekonwalescencji po deprywacji^5,6,7. Gdy sen jest chronicznie ograniczony u myszy przez ponad pięć tygodni podczas rozwoju, po miesiącu regeneracji snu zaobserwowano deficyty behawioralne⁸. Podsumowując, badania te sugerują, że zakłócenia snu u nowonarodzonych gryzoni mogą wpływać na późniejsze wzorce snu, funkcjonowanie mózgu i zachowanie. Podkreślając znaczenie snu dla prawidłowego rozwoju mózgu u ludzi, wielu pacjentów z zaburzeniami neurorozwojowymi, w tym zaburzeniami ze spektrum autyzmu, zespołem stwardnienia guzowatego, zespołem łamliwego chromosomu X i zespołem nadpobudliwości psychoruchowej z deficytem uwagi, zgłasza nieprawidłowości we wzorcach snu oprócz różnych deficytów behawioralnych¹.

Biorąc pod uwagę liczbę zaburzeń neurorozwojowych, które są związane z nieprawidłowymi wzorcami snu, ważne jest zrozumienie, jak brak snu wpływa na funkcjonowanie i zachowanie mózgu. Jednak pomimo danych, które potwierdzają znaczenie snu podczas rozwoju, większość metodologii, które ograniczają lub pozbawiają zwierzęta snu, koncentruje się na osobach dorosłych. Techniki te obejmują różne testy, które wymagają wymuszonej aktywności lokomotorycznej (np. ciągła bieżnia), ciągłego zakłócania (np. obracająca się zamiatarka lub ciągła prezentacja nowego obiektu) lub przeszkadzania zwierzęciu na początku snu REM (np. platforma nad wodą)^9,10. Chociaż metody te skutecznie wykazały problemy związane z brakiem snu u dorosłych, żadna z tych metod nie jest odpowiednia dla młodych gryzoni ze względu na ich ograniczoną mobilność, wysoki popęd snu i niekorzystne skutki stresu we wczesnym okresie życia. Ze względu na znaczenie snu podczas rozwoju, ważne jest, aby zrozumieć, w jaki sposób ograniczony sen u nowonarodzonych szczeniąt wpływa na przyszłe zachowanie w wieku dorosłym.

Jedną z technik ograniczania snu, która może być stosowana u szczeniąt gryzoni, jest delikatne obchodzenie się z nimi. Delikatne obchodzenie się z gryzoniami polega na bezpośredniej interakcji badacza z gryzoniami za każdym razem, gdy obserwuje się zachowanie podczas snu. Badacze mogą używać rąk, pędzla lub prezentacji nowych obiektów, aby fizycznie zakłócić sen u nowonarodzonych gryzoni^{8,10,11,12,13,14}. Sen może być behawioralnie zdeterminowany przez brak aktywności motorycznej, drgawki miokloniczne i zamykanie oczu (u starszych młodych gryzoni). Walidacja EEG potwierdza, że zakłócanie snu przy delikatnym obchodzeniu się z nimi w oparciu o te zachowania skraca całkowity czas snu o 91% w P12 rats¹⁴. Inne techniki, które zostały użyte do pozbawienia młodych myszy, obejmują porażenie prądem i prezentację nieprzyjemnych bodźców, ale te techniki nie mogą być stosowane do przewlekłego ograniczania snu i są bardziej stresujące niż delikatne obchodzenie się z nimi7^,15. Przewlekłe ograniczenie snu można również osiągnąć za pomocą protokołu wstrząsania, który może być stosowany z lub bez implantacji elektrody EEG i związanego z tym oprogramowania komputerowego, ale ten protokół nie zapobiega całemu snu i dlatego jest mniej kontrolowany w porównaniu z delikatnym obchodzeniem się^4,16. Możliwość ograniczenia lub pozbawienia myszy snu przez wiele dni z rzędu bez specjalnego sprzętu, oprogramowania komputerowego lub implantacji elektrod jest zaletą techniki delikatnego obchodzenia się z nimi. Przewlekłe ograniczenie snu poprzez delikatne obchodzenie się z nim skutecznie ogranicza sen u noworodków gryzoni i powoduje szereg zmian w zachowaniu po okresie deprywacji snu^8,11,12,17.

Tutaj opisujemy wyniki, w których chroniczny brak snu przez trzy godziny dziennie od 5 (P5) do P42 po urodzeniu znacząco wpływa na towarzyskość myszy po 30-dniowym okresie rekonwalescencji, w którym sen nie jest zakłócany. Wyniki te podkreślają długoterminowy wpływ przewlekłego ograniczenia snu podczas rozwoju na przyszłe zachowanie.

UWAGA: Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Narodowym Instytucie Zdrowia Psychicznego i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt.

1. Konfiguracja deprywacji snu

1. Użyj miękkich pędzli, aby delikatnie szturchać myszy podczas snu.
   1. Upewnij się, że pędzel zmieści się w prętach karmnika dla myszy, aby zapewnić myszom dostęp do jedzenia i wody ad libitum podczas braku snu.
   2. Nie używaj pędzli do wielu klatek, aby zapobiec przenoszeniu zapachów między klatkami. Sugerujemy, aby oznaczyć każdą szczotkę przypisaną jej klatką i ograniczyć jej użycie do tej klatki.
2. Wyznacz pomieszczenie, w którym wystąpi cała deprywacja snu.

2. Konfiguracja zwierząt

1. Losowo przypisz każdą klatkę do grupy pozbawionej snu lub grupy kontrolnej.
2. Daj myszom dostęp do jedzenia i wody ad libitum podczas eksperymentu.
3. Upewnij się, że widok myszy nie jest ograniczony przez ściółkę, materiał gniazdowy lub przedmioty wzbogacające w klatce.
   1. Usuń dodatkowe ściółce lub przedmioty wzbogacające, które mogłyby ograniczać widok myszy.
4. Jeśli jedzenie lub woda ograniczają pole widzenia myszy, przenieś je do obszaru klatki, w którym widok nie jest ograniczony.
   1. Jeśli pokarm blokuje dużą część klatki, usuń trochę jedzenia i umieść granulki na dnie klatki, aby zwierzęta miały dostęp do jedzenia w okresie braku snu.

3. Warunki dla zwierząt

UWAGA: Zdecydowaliśmy się rozpocząć trzygodzinny okres deprywacji snu o godzinie 11 rano, kiedy myszy są w połowie swojej nieaktywnej fazy, ale pora dnia i czas trwania deprywacji snu mogą być wybrane na podstawie pożądanych warunków eksperymentalnych.

1. Grupa kontrolna.
   1. Na P5 wyjąć buhaja z klatki hodowlanej i pozostawić matkę z młodymi do momentu odsadzenia (P21).
   2. Przenieś myszy przypisane do grupy kontrolnej do pokoju deprywacji snu i delikatnie szturchaj myszy pędzlem przez 10 minut dziennie przez czas trwania eksperymentu (P5 do P42).
   3. Po tych 10 minutach zwróć myszy do pomieszczenia dla zwierząt i nie przeszkadzaj im
2. Grupa deprywacji snu.
   1. W przypadku P5 wyjąć buhaja z klatki hodowlanej i pozostawić matkę ze szczeniętami do momentu odsadzenia (P21).
      UWAGA: Brak snu przed P5 może spowodować kanibalizację szczeniąt. Nie zaobserwowaliśmy znaczącej kanibalizacji w P5 i późniejszych.
      UWAGA: U młodych szczeniąt popęd do snu jest bardzo wysoki, co wymaga prawie ciągłego głaskania. W miarę rozwoju myszy, zwłaszcza po odsadzeniu, ciśnienie snu jest niższe i nie potrzebują ciągłego poganiania.
   2. Kontynuuj deprywację snu każdego dnia, aż do P42.
      UWAGA: Protokoły deprywacji snu mogą różnić się długością i w razie potrzeby wykraczać poza P42.
   3. Przenoś myszy przypisane do grupy deprywacji snu do pokoju deprywacji snu codziennie podczas cyklu światła, gdzie będą monitorowane. Dokładny czas trwania deprywacji snu można dostosować w zależności od konkretnego pytania badawczego.
      UWAGA: U nowonarodzonych myszy brak snu, który trwa dłużej niż 3 godziny, jest trudny ze względu na wzrost ciśnienia snu¹⁵.
      1. W tym czasie delikatnie szturchaj myszy pędzlem za każdym razem, gdy sen jest widoczny. Specyfika deprywacji snu została wyjaśniona w następnej sekcji.

4. Niedobór snu

1. Delikatnie szturchnij mysz pędzlem, jeśli podejrzewa się, że śpi, dopóki nie zaobserwujesz reakcji. Alternatywnie, odwróć myszy i przewróć je na plecy, aby zakłócić sen.
   1. Rozważ, że mysz śpi, jeśli wystąpi którakolwiek z poniższych sytuacji: brak aktywności, drganie (szczególnie u szczeniąt) lub jeśli ich oczy są zamknięte (u myszy starszych niż P12).
   2. Weź pod uwagę, że myszy nie śpią, jeśli się poruszają, próbują przewrócić się po leżeniu na plecach lub pielęgnują się.
2. Jeśli matka zakrywa młode podczas braku snu, delikatnie odepchnij ją od szczeniąt, aby widok szczeniąt był nieograniczony.

5. Pozbawienie po snach

1. Po zakończeniu trzygodzinnego okresu pozbawienia snu włóż z powrotem pościel i wszelkie jedzenie, które mogły zostać usunięte, i załóż pokrywę z powrotem na klatkę.
2. Umieść klatki z powrotem w pomieszczeniu dla zwierząt do następnego dnia pozbawienia snu.

6. Kolejne eksperymenty

1. W zależności od celu badania deprywacji snu przystępuj do kolejnych eksperymentów.
   1. Zbierz surowicę od zwierząt, aby określić poziom kortykosteronu¹⁸.
   2. Wykonaj dowolny z wielu testów behawioralnych, w tym Open field, RotaRod, Elevated Plus Maze, Social behavior test, Marble Burying, itp.^8,19,20 Te testy behawioralne również uniemożliwią zwierzętom spanie, więc powinno to być brane pod uwagę przy określaniu, ile dni ciągłego pozbawienia snu należy zastosować.

Aby zbadać wpływ chronicznego ograniczenia snu na zachowanie, śpimy myszy z ograniczeniami przez trzy godziny dziennie między 11:00 a 14:00 od P5 do P428. Po ograniczeniu snu myszy pozostawiono w spokoju przez cztery tygodnie i pozwolono im zregenerować się po ograniczeniu snu. Myszy zostały przetestowane pod kątem zachowania po czterotygodniowym okresie rekonwalescencji. Trzykomorowy test zachowań społecznych wykorzystano do oceny towarzyskości (preferencja dla nowej myszy w porównaniu z nowym obiektem) i nowinki społecznej (preferencja dla nowej myszy w porównaniu ze znaną myszą). W teście towarzyskości samice z ograniczeniami snu spędzały więcej czasu na obwąchiwaniu obcej myszy niż samice kontrolne (p < 0,05) (Ryc. 1A), a samce z ograniczeniami snu miały tendencję do spędzania więcej czasu na wąchaniu obiektu w porównaniu z samcami z grupy kontrolnej (p = 0,077) (Rysunek 1A). W fazie testów nowości społecznej samice myszy z ograniczeniami snu spędzały więcej czasu na wąchaniu nowej myszy niż samice z grupy kontrolnej (p < 0,01) (Rysunek 1B).

Ryc. 1: Przewlekłe ograniczenie snu zmienia zachowania społeczne po 4-tygodniowym okresie regeneracji snu. (A) Test towarzyskości: Czas spędzony na wąchaniu ujawnia, że samce myszy, które miały ograniczony sen, spędzały więcej czasu na wąchaniu nowego obiektu w porównaniu z samcami z grupy kontrolnej (p = 0,077). Samice myszy z ograniczonym snem spędzały więcej czasu na wąchaniu obcej myszy w porównaniu z samicami kontrolnymi (*p < 0,05). Samice myszy z ograniczonym snem również spędzały więcej czasu na wąchaniu obiektu w porównaniu z samicami kontrolnymi (p = 0,065). (B) Test nowości społecznej: Czas spędzony na wąchaniu nowej lub znajomej myszy ujawnił, że samice myszy z ograniczeniami snu spędzały statystycznie istotnie więcej czasu na wąchaniu nowej myszy w porównaniu z samicami myszy, które nie były ograniczone snem (**p < 0,01). Słupki reprezentują środki ± SEM u 11 kontrolnych samców, 13 samców z ograniczeniami snu, 22 kontrolnych samic i 17 samic myszy z ograniczeniami snu. Dane analizowano za pomocą testów post hoct-tests po ANOVA. Ten rysunek został zmodyfikowany za zgodą Sare et al. 20168. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.