Izolacja 1-ATPazy F z pasożytniczego protisty Trypanosoma brucei

Syntazy ATP typu F to związane z błoną wirujące kompleksy wielobiałkowe, które łączą translokację protonów przez błony bakterii, mitochondriów i chloroplastów poprzez transdukcję energii z tworzeniem ATP. Molekularne szczegóły rotacyjnego mechanizmu syntezy ATP są znane głównie dzięki badaniom strukturalnym oczyszczonych bakteryjnych i mitochondrialnych syntaz ATP oraz ich podkompleksów¹. Syntaza ATP typu F jest zorganizowana w ugrupowania błonowo-wewnętrzne i błonowo-zewnętrzne. Część zewnętrzna błony, znana jako F 1-ATPaza, zawiera trzy miejsca katalityczne, w których zachodzi fosforylacja difosforanu adenozyny (ADP) do ATP lub reakcja odwrotna. F 1-ATPaza może być uwalniana eksperymentalnie z ugrupowania wewnętrznego błony, zachowując jednocześnie swoją zdolność do hydrolizy, ale nie syntezy ATP. Sektor związany z błoną, zwany F_o, pośredniczy w translokacji białek, która napędza rotację centralnej części enzymu. Sektory F₁ i_{F o} są połączone łodygami środkowymi i obwodowymi.

Pierwsze próby oczyszczenia F 1-ATPazy z pączkujących drożdży i mitochondriów serca bydlęcego sięgają lat 60. Protokoły te wykorzystywały wyekstrahowane mitochondria, które zostały zakłócone przez sonikację, frakcjonowane przez wytrącanie siarczanu amonu lub protaminy, a następnie opcjonalne etapy chromatografii i obróbkę cieplną^2,3^,4,5,6. Oczyszczanie zostało znacznie ulepszone i uproszczone dzięki zastosowaniu chloroformu, który łatwo uwalnia F 1-ATPazę z fragmentów błony mitochondrialnej⁷. Ekstrakcja chloroformem została następnie wykorzystana do ekstrakcji 1-ATPaz F z różnych źródeł zwierzęcych, roślinnych i bakteryjnych (np. wątroba szczura⁸, kukurydza^9, Arum maculatum¹⁰ i Escherichia coli¹¹). Dalsze oczyszczanie F 1-ATPazy uwalnianej przez chloroform za pomocą chromatografii powinowactwa lub chromatografii wykluczającej wielkość (SEC) dało wysoce czysty kompleks białkowy, który był odpowiedni do oznaczania struktury w wysokiej rozdzielczości za pomocą krystalografii rentgenowskiej, co udokumentowały struktury F_1-ATPazy z serca bydlęcego^12,13 i Saccharomyces cerevisiae¹⁴. Struktury F 1-ATPazy oznaczono również z organizmów trudnych do hodowli, a co za tym idzie, ilość wyjściowego materiału biologicznego była ograniczona. W tym przypadku podjednostki F 1-ATPazy zostały sztucznie wyrażone i złożone w kompleks w E. coli, a cały heterologiczny enzym oczyszczono za pomocą chromatografii powinowactwa za pomocą znakowanej podjednostki. Takie podejście doprowadziło do wyznaczenia struktur F 1-ATPazy z dwóch termofilnych gatunków bakterii, Geobacillus stearothermophilus¹⁵ i Caldalkalibacillus thermarum^16,17. Jednak ta metodologia jest raczej nieodpowiednia dla eukariotycznych_F 1-ATPaz, ponieważ opiera się na prokariotycznym aparacie proteosyntetycznym, przetwarzaniu potranslacyjnym i złożonym składaniu.

Ekstrakcja na bazie chloroformu była wcześniej używana do izolowania 1-ATPaz F z jednokomórkowych pasożytów dwukomórkowych Trypanosoma cruzi¹⁸ i T. brucei¹⁹, ważnych patogenów ssaków powodujących odpowiednio amerykańskie i afrykańskie trypanosomazy, oraz od monogenicznego pasożyta owadów Crithidia fasciculata²⁰. Oczyszczanie to doprowadziło jedynie do prostego opisu_F 1-ATPaz, ponieważ nie zastosowano żadnych dalszych zastosowań, aby w pełni scharakteryzować skład, strukturę i właściwości enzymatyczne kompleksu. W artykule opisano zoptymalizowaną metodę oczyszczania F 1-ATPazy z etapu cyklu życiowego hodowanych owadów T. brucei. Metoda została opracowana w oparciu o ustalone protokoły izolacji 1-ATPaz F bydła i drożdży F class=^21,22. Procedura daje wysoce czysty i jednorodny enzym odpowiedni do testów enzymatycznych i hamujących in vitro, szczegółowej charakterystyki proteomicznej za pomocą spektrometrii mas²³ i określania struktury²⁴. Protokół oczyszczania i znajomość struktury F 1-ATPazy na poziomie atomowym otwiera możliwość projektowania badań przesiewowych do identyfikacji małocząsteczkowych inhibitorów i pomocy w opracowywaniu nowych leków przeciwko afrykańskim trypanosomatomatomom. Co więcej, protokół może być dostosowany do oczyszczania F1-ATPazy z innych organizmów.

1. i roztwory

1. Przygotuj roztwory wymienione poniżej. Odgazowuje wszystkie do chromatografii cieczowej. Dodaj ADP, benzamidynę i inhibitory proteazy tuż przed użyciem.
   1. Przygotuj bufor A: 50 mM bufor Tris z kwasem solnym (Tris-HCl) o pH 8,0, 0,25 M sacharozy, 5 mM benzamidyny, 5 mM kwasu aminokapronowego (ACA) i inhibitorami proteazy (10 μM amastatyny, 50 μM bestatyny, 50 μM pepstatyny, 50 μM leupeptyny i 50 μM diprotyny A).
   2. Przygotuj bufor B: 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,25 M sacharozy, 4 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), 5 mM benzamidyny, 5 mM ACA, 1 mM ADP i inhibitory proteazy (10 μM amastatyny, 50 μM bestatyny, 50 μM pepstatyny, 50 μM leupeptyny i 50 μM diprotyny A).
   3. Przygotować bufor kolumny Q: 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 4 mM EDTA, 10 mM MgSO₄, 5 mM benzamidyny, 5 mM ACA i 1 mM ADP.
   4. Przygotować bufor elucyjny w kolumnie Q: Bufor w kolumnie Q z 1 M NaCl.
   5. Przygotuj bufor SEC: 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM MgSO₄, 100 mM NaCl, 1 mM ADP.
   6. Przygotować chloroform nasycony 2 M Tris-HCl pH 8,5. Wymieszać chloroform z 2 M Tris-HCl o pH 8,5 w stosunku około 1:1 w butelce z nakrętką, wstrząsnąć, oddzielić fazę organiczną i wodną i zmierzyć pH w górnej warstwie wodnej za pomocą paska bibuły wskaźnikowej pH. Przechowywać w temperaturze pokojowej. Tuż przed użyciem ponownie wstrząśnij i pozwól fazom się rozdzielić. Użyj dolnej warstwy chloroformu.
      UWAGA: Chloroform jest lotny i działa drażniąco na oczy i skórę. Praca pod wyciągiem. Podczas potrząsania używaj okularów ochronnych.

2. Przygotowanie cząstek submitochondrialnych

1. Ponownie zawiesić pęcherzyki mitochondrialne (mitoplasty) wyizolowane przez hipotoniczną lizę²⁵ z 1 x 10¹¹ do 2 x 10¹¹ komórek procyklicznego T. brucei w 5 ml lodowatego buforu A. Próbkę należy przechowywać w chłodzie do kroku 3.2.
2. Oznaczyć stężenie białka w zawiesinie za pomocą testu białkowego kwasu bicinchoninowego (BCA) ²⁶ zgodnie z instrukcjami producenta.
   1. Użyć serii rozcieńczeń albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w ultraczystej wodzie, aby skonstruować krzywą wzorcową. Rozcieńczyć niewielką ilość próbki 20 - 100 razy ultraczystą wodą, aby dopasować ją do zakresu standardów BSA.
   2. Obliczyć całkowitą ilość białka w próbce i doprowadzić stężenie białka do 16 mg/ml, rozcieńczając je dodatkowym buforem A.
3. Fragmentuj mitoplasty na odwrócone pęcherzyki i kawałki błony przez sonikację zawiesiny 7x przez 15 s o łącznej energii od 70 do 100 J na impuls za pomocą mikrokońcówki o średnicy 3,9 mm. Jeśli homogenizator ultradźwiękowy nie wyświetla wyjściowej energii, rozpocznij optymalizację przy 50% mocy maksymalnej. Inkubować próbkę na lodzie przez 30 s między impulsami. Po sonikacji zawiesina staje się nieco ciemniejsza.
4. Osadzać fragmenty membrany przez ultrawirowanie w temperaturze 54 000 x g przez 16 godzin lub w temperaturze 98 000 x g przez 5 godzin w temperaturze 4 °C. Zdekantować supernatant i przystąpić do ekstrakcji chloroformem lub błyskawicznie zamrozić osad w ciekłym azocie i przechowywać go w temperaturze -80 °C.

3. Uwalnianie_F 1-ATPazy z błony przez chloroform

1. Zawiesić osad błon mitochondrialnych w buforze B za pomocą małego homogenizatora Dounce. Obliczyć objętość buforu B na podstawie całkowitej ilości buforu A użytego w krokach 2.1 i 2.2, korzystając z następującego wzoru: objętość (bufor B) = objętość (bufor A) x 12/21. Przenieść zawiesinę do stożkowej probówki o pojemności 15 lub 50 ml.
2. Usunąć próbkę z lodu i od tej pory przechowywać próbkę wraz ze wszystkimi roztworami, które mają być użyte, w temperaturze pokojowej.
3. Dodać chloroform nasycony 2 M Tris-HCl o pH 8,5; objętość chlorformu, który ma być dodany, jest równa połowie objętości zawiesiny. Zamknij szczelnie nakrętkę. Potrząsaj nim energicznie dokładnie przez 20 sekund. Odwirować go natychmiast przy 8 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
4. Przenieść górną mętną fazę wodną do mikroprobówek o pojemności 1,6 ml. Dodać inhibitory proteazy (10 μM amastatyny, 50 μM bestatyny, 50 μM pepstatyny, 50 μM leupeptyny i 50 μM diprotyny A) w celu zastąpienia inhibitorów usuniętych przez leczenie chloroformem. Odwirować próbki o masie 13 000 x g przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Przenieść supernatant do świeżych mikroprobówek i powtórzyć wirowanie w celu usunięcia nierozpuszczalnego materiału.

4. Chromatografia anionowymienna

1. Zrównoważyć 5-mililitrową kolumnę wymiany anionów (Q) podłączoną do systemu szybkiej chromatografii cieczowej białkowej z buforem kolumny Q przy natężeniu przepływu 5 ml/min, aż do ustabilizowania się absorbancji przy 280 nm i przewodności (około 50 ml buforu).
2. Załadować supernatant z kroku 3.3 na kolumnę zrównoważoną z natężeniem przepływu 1 ml/min. Poczekać, aż absorbancja przy 280 nm ustabilizuje się na tle. Zastosować 25-mililitrowy gradient liniowy buforu elucji kolumny Q od 0% do 100% przy natężeniu przepływu 0,5 ml/min. Zbierz frakcje o pojemności 1 ml.
3. Oznacz poszczególne frakcje odpowiadające głównemu pikowi elucji dla aktywności hydrolitycznej ATP za pomocą testu ATPazy Pullmana2 przy pH 8,0. Użyć 10 μl każdej frakcji na 1 ml mieszaniny reakcyjnej. Połącz frakcje, które wykazują aktywność ATPazy. Opcjonalnie należy oddzielić 10 μl każdej frakcji w elektroforezie w żelu poliakrylamidowym z dodecylfosforanu sodu (SDS-PAGE) i wybarwić żel za pomocą Coomassie Blue w celu wizualizacji poszczególnych podjednostek F 1-ATPazy i białek zanieczyszczających.
4. Zagęścić zbiorczą próbkę za pomocą ultrafiltracji membranowej przy użyciu kolumny wirowej z filtrem PES o mocy 100 000 MWCO do 200 - 500 μl. Przejdź do SEC lub przechowuj próbkę przez noc w temperaturze pokojowej.

5. Chromatografia wykluczająca rozmiar

1. Zrównoważyć kolumnę SEC podłączoną do systemu chromatografii cieczowej z co najmniej 48 ml (objętości dwóch kolumn) buforu SEC przy natężeniu przepływu 0,5 ml/min.
2. Nałożyć próbkę na kolumnę i przeprowadzić chromatografię z natężeniem przepływu 0,25 ml/min. Zebrać frakcje o pojemności 0,25 ml.
3. Uruchom 10 μl frakcji, które odpowiadają pikom śladu absorpcji UV_280nm na SDS-PAGE i zabarwić je kolorem Coomassie Blue. Pierwszy główny pik_zawiera 1-ATPazę F. Oznaczyć frakcje odpowiadające temu pikowi dla aktywności hydrolitycznej ATP i czułości azydku za pomocą testu ATPazy Pullmana. Określić stężenie białka za pomocą testu BCA.
4. Oczyszczoną F1-ATPazę należy przechowywać w temperaturze pokojowej i zużyć w ciągu 3 dni po oczyszczeniu do dalszych zastosowań. Alternatywnie, należy zagęścić próbkę za pomocą kolumny wirowej z filtrem PES o pojemności 100 000 MWCO do > 1,5 mg/ml, wytrącić ją przez zmieszanie z nasyconym siarczanem amonu dostosowanym do pH 8,0 (1,2x objętość) i przechowywać w temperaturze 4 °C.

Typowe oczyszczanie (Rysunek 1) rozpoczyna się od mitochondrialnych pęcherzyków (mitoplastów) wyizolowanych na gradiance Percoll z hipotonicznie lizowanych komórek T. brucei 10 do 2 x 1011 procyklicznych komórek T. brucei25 hodowanych w standardowym, bogatym w glukozę SDM-79 medium27. Mitoplasty są rozdrabniane przez sonikację, przędzone, a supernatant zawierający matrycę jest odrzucany. Błony mitochondrialne są traktowane chloroformem w celu uwolnienia F1-ATPazy. Po odwirowaniu faza organiczna i wytrącona interfaza są odrzucane. Faza wodna jest frakcjonowana metodą chromatografii jonowymiennej na czwartorzędowym ammoniaku, silnym wymieniaczu anionowym (Rysunek 2A). Frakcje, które odpowiadają głównemu pikowi elucji i zawierająF-1-ATPazę, są łączone i koncentrowane. Materiał ten służy jako wsad dla SEC, który eliminuje resztkowe zanieczyszczenia. Głównym zanieczyszczeniem jest dehydrogenaza dihydrolipoylowa, która wymywa się z kolumny SEC jako dyskretny pik, oznaczony ciemnozielonym paskiem w Rysunek 2B. 1-ATPaza F eluuje w pierwszym dominującym, w dużej mierze symetrycznym piku (Figura 2B).

Postęp oczyszczania jest śledzony przez test białka BCA (lub inny powszechny test białkowy), SDS-PAGE i monitorowanie aktywności ATPazy. Szybkość hydrolizy ATP jest mierzona za pomocą testu regenerującego ATP Pullmana2, w oparciu o spadek absorbancji NADH w sprzężonej reakcji. Azydek sodu, uznany inhibitor F 1-ATPazy, stosuje się w stężeniu 2 mM w celu określenia proporcji hydrolizy ATP specyficznej dla F1-ATPazy. Zazwyczaj materiał wejściowy zawiera około 150 - 300 mg białka mitochondrialnego, w zależności od liczby komórek wykorzystywanych jako źródło pęcherzyków mitochondrialnych. Na tym etapie proporcja wrażliwa na azydki w całkowitej aktywności ATPazy wynosi około 30% do 40%. Po ekstrakcji chloroformem ponad 90% aktywności ATPazy w próbce jest przypisywane do 1-ATPazy F. Oczyszczona F 1-ATPaza jest praktycznie całkowicie wrażliwa na traktowanie azydkiem (minimalną resztkową aktywność ATPazy można przypisać autolizie ATP w tle) i stanowi około 1% masy białka wejściowego, z przybliżoną wydajnością 1 - 1,5 mg F1-ATPazy na 1 x 1011 komórek (Tabela 1). Typowy wzór pasma po oddzieleniu oczyszczonejF 1-ATPazy na żelu SDS-PAGE, a następnie barwieniu Coomassie Blue jest pokazany na Rysunek 2C. Białka zostały zidentyfikowane za pomocą odcisków palców masy peptydów i szczegółowo scharakteryzowane za pomocą różnych podejść do spektrometrii mas23. Sporadyczne słabe pasma widoczne powyżej pasma podjednostek β reprezentują podkompleksy głowicy α3β 3 (dimery i oligomery podjednostek α i β) i są pozbawione jakichkolwiek zanieczyszczeń wykrywalnych przez czułe techniki spektrometrii mas. Oczyszczona F 1-ATPaza może być przechowywana przez okres do kilku dni w buforze SEC w temperaturze pokojowej. Alternatywnie, 1-ATPaza F stężona do ≥2 mg/ml może być wytrącona przez równą objętość nasyconego siarczanu amonu w buforze SEC, o pH dostosowanym do 8,0 i przechowywana w temperaturze 4 °C. Przez co najmniej sześć miesięcy po wytrąceniu aktywny enzym bez widocznej degradacji jakiejkolwiek podjednostki można otrzymać poprzez ponowne rozpuszczenie wytrąconego materiału w buforze SEC lub podobnym roztworze. Jednak przechowywanie dłuższe niż jeden miesiąc nie nadaje się do krystalizacji, jak określono empirycznie.

Rysunek 1: Schemat procedury oczyszczania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Dwuetapowe oczyszczanie 1-ATPazy F uwalnianej przez chloroform metodą chromatografii cieczowej. (A) Profil elucji chromatografii anionowymiennej (górny panel) i wybrane frakcje rozdzielone na 10% - 20% żelu Tris-glycine SDS-PAGE barwionym barwnikiem Coomassie Blue (dolny panel). Niebieski ślad: absorbancja UV przy 280 nm; czerwony ślad: stężenie NaCl w buforze elucyjnym; Wejście: 1-ATPaza F uwalniana przez chloroform; FT: przepływowy. (B) Profil elucyjny SEC (górny panel) i wybrane frakcje wydzielone na żelu SDS-PAGE wybarwionym barwnikiem Coomassie Blue (dolny panel). Wejście: zbiorcze frakcje z chromatografii anionowymiennej zawierające F1-ATPazę. Oznaczone kolorami paski w panelach A i B oznaczają frakcje w profilach elucji, które zostały przeanalizowane przez SDS-PAGE i odpowiadające im pasy w odpowiednim żelu. (C) Tożsamość poszczególnych białek wyizolowanej F1-ATPazy zidentyfikowanej za pomocą spektrometrii mas. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Przykład typowego postępu i wydajności oczyszczania F 1-ATPazy z mitochondriów wyizolowanych z 1 x 1011 procyklicznych komórek T. brucei.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.