Izolacja i ekspansja cytotoksycznych limfocytów T zabójców indukowanych cytokinami w leczeniu raka

Cytotoksyczne limfocyty T to specyficzna populacja immunologicznych komórek efektorowych, które pośredniczą w odpowiedziach immunologicznych przeciwko rakowi. Do celów adoptywnej terapii limfocytami T (ACT) opracowano kilka populacji komórek efektorowych, w tym komórki zabójcy aktywowane limfokiną (LAK), limfocyty naciekające nowoś (TIL), komórki NK (natural killer), limfocyty T γδ i komórki zabójcze indukowane cytokinami (CIK) do celów adoptywnej terapii limfocytami T (ACT)¹. Rośnie zainteresowanie komórkami CIK, ponieważ reprezentują one mieszaninę populacji komórek cytotoksycznych indukowanych cytokinami, rozszerzonych z autologicznych komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC)².

Niekontrolowany wzrost limfoidalnych komórek progenitorowych, mieloblastów i limfoblastów prowadzi do trzech głównych typów nowotworów krwi (tj. białaczki, chłoniaka i szpiczaka), guzów litych, w tym raków (np. raka płuc, raka żołądka, raka szyjki macicy) i mięsaków, wśród innych nowotworów³. Komórki CIK są mieszaniną populacji komórek, które wykazują szeroki zakres nieograniczonej aktywności przeciwnowotworowej głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC), a tym samym są obiecujące w leczeniu nowotworów hematologicznych i zaawansowanych^4,5,6,7. Komórki CIK składają się z kombinacji komórek, w tym limfocytów T (CD3 ⁺ CD56 ⁻), komórek NK-T (CD3 ⁺ CD56 ⁺) i komórek NK (^CD3 – CD56 ⁺). Optymalizacja protokołu indukcji CIK poprzez zastosowanie ustalonego harmonogramu dodawania IFN-γ, przeciwciała anty-CD3 i IL-2, powoduje ekspansję komórek CIK⁸. Zdolność cytotoksyczna komórek CIK przeciwko komórkom nowotworowym zależy głównie od zaangażowania ligandów NKG grupy 2 D (członka rodziny receptorów lektynopodobnych typu C) NKG2D do komórek nowotworowych oraz od szlaków, w których pośredniczy perforyna⁹. Wyniki badania przedklinicznego wykazały, że stymulowane przez IL-15 komórki CIK indukowały silną cytotoksyczność wobec pierwotnych i ostrych linii komórkowych białaczki szpikowej in vitro i wykazywały niższą alloreaktywność w stosunku do normalnych PBMC i fibroblastów⁹. Niedawno opublikowano wyniki jednorazowej infuzji CIK (1 x 10⁸/kg komórek CD3 ⁺ pochodzących od zdrowego dawcy) jako konsolidacji po niemieloablacyjnym przeszczepie allogenicznym w leczeniu nowotworów szpiku w badaniu klinicznym II fazy¹⁰.

W obecnym badaniu opracowaliśmy zoptymalizowaną formułę hodowli komórkowej składającą się z IFN-γ, IL-1α, przeciwciała anty-CD3 i IL-2 dodanych do pożywki komórek krwiotwórczych w celu zwiększenia produkcji CIK, a także zbadaliśmy cytotoksyczne działanie komórek CIK na ludzkie komórki przewlekłej białaczki szpikowej (K562) i komórki raka jajnika (OC-3).

Protokół kliniczny został przeprowadzony i zatwierdzony zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej Chińskiego Uniwersytetu Medycznego i Komitetu Etyki Badań Szpitalnych. Próbki krwi obwodowej pobrano od zdrowych ochotników za ich świadomą zgodą.

1. Przygotowanie materiałów

1. Odczynniki, przeciwciała i substancje chemiczne należy przechowywać zgodnie z Kartą Charakterystyki Substancji Niebezpiecznej (MSDS). Rozpuścić leki lub cytokiny w rozpuszczalnikach jako roztwory podstawowe, a następnie podwielokrotność do przechowywania w temperaturze -20 °C lub -80 °C.
   UWAGA: Szczegółowe informacje dotyczące przygotowania materiału znajdują się w Tabeli materiałów.

2. Izolacja PBMC

1. Przed użyciem podgrzać roztwór gradientu gęstości (tabela materiałów) do temperatury 18–20 °C. Odwróć butelkę z roztworem kilka razy, aby zapewnić dokładne wymieszanie.
2. Zebrać 3-5 ml próbki ludzkiej krwi żylnej do heparynizowanej fiolki i dobrze wymieszać, delikatnie odwracając probówkę kilka razy.
3. Przygotować 4 ml roztworu gradientu gęstości w sterylnej probówce o pojemności 15 ml.
4. Ostrożnie nałożyć 1 ml próbki krwi na roztwór gradientu gęstości.
5. Wirować przy 400 x g przez 30 minut w temperaturze 18−20 °C (wyłączyć przerwę).
6. Ostrożnie i natychmiast odessać warstwę kożucha kożuchowego komórek jednojądrzastych (około 1 ml) na raz, aby uniknąć naruszenia warstw do sterylnej probówki o pojemności 15 ml za pomocą sterylnej pipety o pojemności 1 ml.
7. Dodać co najmniej 3 objętości (~ 3 ml) soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do powłoki kożuchowej w probówce wirówkowej. Zawiesić komórki, delikatnie pipetując je w górę i w dół co najmniej 3 razy sterylną pipetą.
8. Wirować przy 400 x g przez 10 minut w temperaturze 18−20 °C. Odessać supernatant.
9. Zawiesić osad komórkowy w 5 ml podłoża podstawowego (tabela materiałów) i przenieść do kolby. Hodować komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .

3. Wprowadzenie i rozbudowa CIK

1. W dniu 0 hodować PBMC (1 x 10⁶) w świeżej pożywce podstawowej zawierającej 1 000 j.m./ml IFN-γ przez 24 godziny w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
2. W dniu 1 odświeżyć pożywkę świeżą pożywką podstawową zawierającą 50 ng/ml przeciwciała anty-CD3, 1 ng/ml rh IL-1α i 1,000 U/ml rh IL-2. Odświeżaj podłoże co 3 dni.
3. W dniu 7 odświeżyć pożywkę świeżą pożywką podstawową zawierającą 1 000 U/ml rh IL-2. Odświeżaj pożywkę co 3 dni, aż do końca ekspansji komórek (dzień 14).

4. Immunofenotypowanie do oceny komórek CIK

1. Umyj komórki CIK 10 ml sterylnego PBS. Wirować przez 10 minut przy 300 x g i temperaturze 18−20 °C, odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki za pomocą 10 ml PBS. Policz liczbę komórek i zbadaj żywotność komórek za pomocą testu wykluczania błękitu trypanowego.
2. Podziel komórki CIK na sześć sterylnych probówek o pojemności 1,5 ml o gęstości ~5–10 x 10⁵ komórek/ml PBS. Oznaczyć i traktować w następujący sposób: Probówka 1, ślepa (bez przeciwciał); Probówkę 2 dodać 20 μl izotypu IgG1-FITC; Probówka 3, dodać 20 μl izotypu IgG1-APC mAbs; Probówka 4, dodać 20 μl CD3-FITC; Probówka 5, dodać 20 μl mAb CD56-APC; i probówkę 6, dodaj 20 μl CD3-FITC i 20 μl mAb CD56-APC.
3. Delikatnie wymieszaj komórki CIK z przeciwciałami, delikatnie pipetując je w górę i w dół co najmniej 3 razy sterylną pipetą o pojemności 1 ml, a następnie inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
4. Odwirować probówki przez 10 minut przy 300 x g i temperaturze 18−20 °C. Odessać supernatant i zawiesić jednokrotnie osad komórkowy w 1 ml PBS. Delikatnie pipetować w górę i w dół co najmniej 3 razy za pomocą sterylnej pipety o pojemności 1 ml.
5. Powtórz krok 4.4.
6. Pozostaw probówki w ciemności przed analizą cytometrii przepływowej.

5. Rozpoznawanie znaczników CD

1. Przenieść zawiesinę komórek do sterylnej probówki z okrągłym dnem o pojemności 5 ml z polistyrenu z nasadką sitkową (siatka 100 μm), delikatnie pipetując przez nasadkę. Ułóż rurki na karuzeli w kolejności.
2. Otwórz oprogramowanie do analizy cytometrii przepływowej i utwórz folder eksperymentalny. Kliknij przycisk Nowa próbka, aby dodać próbkę i probówkę do eksperymentu i nazwij probówki w następujący sposób: Probówka 1, Pusta; Rurka 2, izotyp IgG1-CD3; Rurka 3, Izotyp IgG1-CD56; Rurka 4, CD3; Rurka 5, CD56; Rura 6, CD3CD56.
3. Utwórz system bramkowania rozproszonego dla populacji komórek CIK (Rysunek 2A).
   1. Wybierz Rura 1 (Pusta) i kliknij przycisk Wykres punktowy, aby utworzyć wykres FSC-A/SSC-A. Narysuj prostokątną bramkę na całej populacji komórek z progiem FSC-A >5 x 10⁴, aby wykluczyć resztki komórek.
   2. Wybierz parametr SSC-A/SSC-H dla nowego wykresu punktowego i narysuj bramkę wielokątów wokół wszystkich pojedynczych komórek. Wybierz odpowiednio parametr Count/FITC (CD3) i Count/APC (CD56) dla nowego wykresu histogramu. Wybierz parametr FITC (CD3)/APC (CD56) dla nowego wykresu punktowego i narysuj bramkę z czterema kwadrantami, aby zdefiniować cztery subpopulacje.
   3. Rejestruj dane z 20 000 pojedynczych komórek w każdej próbce. Kliknij przycisk Załaduj próbkę, aby najpierw przeanalizować próbkę kontrolną pustą. Zidentyfikuj całą populację komórek CIK przy użyciu parametrów kanału CD56 i CD3.
4. Powtórzyć krok 5.3 w celu zbadania wszystkich próbek.
5. Otwórz pliki zawierające wartości statystyczne poszczególnych próbek, aby przeanalizować populacje komórek CIK i wydrukuj je ponownie w plikach analizy.

6. Hodowla i barwienie ludzkich komórek K562 przewlekłej białaczki szpikowej i komórek OC-3 raka jajnika

1. Ogniwa K562
   1. Hodować komórki K562 w kompletnych pożywkach (pożywka podstawowa RPMI zawierająca 10% płodowej surowicy bydlęcej [FBS] i 50 U/ml antybiotyków i dostosować glukozę do 4,5 g/l) o gęstości 0,5−1 x 10⁶ komórek/ml w kolbie do hodowli komórkowej i inkubować w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
   2. Przenieść pożywkę hodowlaną zawierającą komórki K562 do sterylnych probówek o pojemności 50 ml i zagnieżdżać komórki w temperaturze 300 x g przez 10 minut w temperaturze 18−20 °C w dniu doświadczenia.
   3. Odessać supernatant, ponownie zawiesić komórki w 5 ml sterylnego PBS i delikatnie wymieszać.
   4. Granulować komórki w ilości 300 x g przez 10 minut. Odessać supernatant, ponownie zawiesić komórki w PBS i dostosować komórki K562 do stężenia 0,5-1 x 10⁶ komórek/ml.
   5. Dodać 0,5 μl barwnika CFSE do 1 ml zawiesiny komórek K562 w sterylnej probówce o pojemności 15 ml o końcowym stężeniu 5 μM. Delikatnie wymieszać zawiesinę, pipetując w górę i w dół co najmniej 3 razy.
   6. Pozostawić probówkę w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ na 10–15 minut.
   7. Dodać 9 ml PBS do probówki i osadzać komórki w masie 300 x g przez 10 minut. Zdekantować supernatant, a następnie zawiesić osad komórkowy w 10 ml kompletnej pożywki. Przenieść zawiesinę komórkową do kolby do hodowli komórkowej i umieścić w inkubatorze.
2. Ogniwa OC-3
   1. Hodowla komórek OC-3 w kompletnych pożywkach (pożywka DMEM/F12 zawierająca 10% FBS i 50 U/ml antybiotyków) o gęstości 0,5–1 x 10⁶ komórek w kolbie do hodowli komórkowej w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
   2. Odessać pożywkę hodowlaną i przemyć komórki PBS na 1 dzień przed eksperymentem.
   3. Odłączyć komórki, dodając 1 ml roztworu enzymu dysocjacji komórek (tabela materiałów) i inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
   4. Zawieś komórki, dodając 5 ml PBS i delikatnie wymieszaj. Osadzać komórki w masie 300 x g przez 10 minut i odsysać supernatant. Ponownie zawiesić komórki w PBS i dostosować komórki do stężenia 0,5–1 x 10⁶ komórek/ml.
   5. Dodać 0,5 μl barwnika CFSE do 1 ml zawiesiny komórek OC-3 w sterylnej probówce o pojemności 15 ml o końcowym stężeniu 5 μM. Delikatnie wymieszać zawiesinę, pipetując w górę iw dół co najmniej 3 razy.
   6. Pozostawić probówkę w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ na 10–15 minut.
   7. Dodać 9 ml PBS do probówki i osadzać komórki w ilości 300 x g przez 10 minut. Zdekantować supernatant, a następnie zawiesić osad komórkowy z kompletną pożywką. Wysiać 5 x 10 5 komórek/studzienkę na 6-dołkową płytkę i inkubować w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO_{2 przez} noc.

7. Test cytotoksyczny

1. Kohodowla komórek CIK i K562 (CIK-K562)
   1. Policzyć komórki K562 z kroku 6.1.7 i przetestować żywotność komórek za pomocą testu wykluczenia błękitu trypanowego. Dodaj 1 ml komórek K562 do każdej studzienki na płytce 6-dołkowej o gęstości 5 x 10⁵/ml.
   2. Dodać 1 ml podłoża podstawowego z komórkami CIK lub bez komórek CIK z kroku 3.4 do płytki 6-dołkowej z kroku 7.1.1 w następujący sposób: Studzienka 1 = ślepa próba, same komórki K562 (5 x 10⁵); Cóż, 2 = same komórki K562 barwione CFSE (5 x 10⁵); Studnia 3 = komórki CIK (E [efektor], 25 x 10⁵) + komórki K562 barwione CFSE (T [cel], 5 x 10⁵); Dobrze 4 = komórki CIK (E, 50 x 10⁵) + komórki K562 barwione CFSE (T, 5 x 10⁵).
   3. Wymieszać zawiesiny komórek, delikatnie pipetując je w górę i w dół co najmniej 3 razy. Umieścić płytkę w inkubatorze na 24 godziny.
2. Kohodowla komórek CIK i OC-3 (CIK-OC-3)
   1. Dodać 1 ml podłoża podstawowego z komórkami CIK lub bez komórek CIK z kroku 3.4 do płytki 6-dołkowej z kroku 6.2.7 w następujący sposób: Studzienka 1 = ślepa, same komórki OC-3 (5 x 10⁵); Cóż, 2 = same komórki OC-3 barwione CFSE (5 x 10⁵); No 3 = komórki CIK (E, 25 x 10⁵) + komórki OC-3 barwione CFSE (T, 5 x 10⁵); Cóż, 4 = komórki CIK (E, 50 x 10⁵) + komórki OC-3 barwione CFSE (T, 5 x 10⁵).
   2. Wymieszać zawiesiny komórek, delikatnie pipetując je w górę i w dół co najmniej 3 razy. Umieścić płytkę w inkubatorze na 24 godziny.
3. Barwienie barwnikiem 7-aminoaktynomycyny D (7-AAD)
   1. Zawiesinę komórek CIK-K562 z kroku 7.1.3 należy pobrać bezpośrednio do sterylnej probówki o pojemności 15 ml.
   2. Pobrać zarówno zawiesinę, jak i przylegające komórki z grup CIK-OC-3 z kroku 7.2.2.
      1. Przenieść zawiesinę komórek do sterylnej probówki o pojemności 15 ml. Umyj studzienkę 1 ml sterylnego PBS, zbierz PBS i dodaj do probówki. Dodać 0,5 ml roztworu enzymu dysocjacji komórek i inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
      2. Dodać 1 ml roztworu z tej samej probówki do odpowiedniego dołka i delikatnie wymieszać komórki, pipetując je w górę i w dół co najmniej 3 razy za pomocą sterylnej pipety o pojemności 1 ml. Zbierz wszystkie komórki w tej samej probówce.
   3. Wirować przy 300 x g przez 10 minut, odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml sterylnego PBS. Osadzać komórki w stężeniu 300 x g przez 10 minut, odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 100 μl sterylnego PBS.
   4. Dodaj 5 μl barwnika 7-AAD (zapas 50 ng/μl) do zawiesiny komórek. Delikatnie wymieszaj komórki, pipetując je w górę i w dół co najmniej 3 razy za pomocą sterylnej pipety o pojemności 1 ml. Inkubować przez 10 minut i pozostawić w ciemności przed analizą.
4. Test zdolności cytolitycznych
   1. Wymieszać zawiesinę komórek z kroku 7.3.4 i powtórzyć kroki 5.1 i 5.2 jeden raz.
   2. Kliknij przycisk Nowa próbka, aby dodać próbkę i probówkę do eksperymentu i nazwij probówki w następujący sposób: Probówka 1, tylko komórki K562 (lub OC-3); Probówka 2, tylko ogniwa K562 (lub OC-3) barwione CFSE; Rura 3, E:T = 5:1; Rura 4, E:T = 10:1.
   3. Utwórz system bramkowania rozproszonego dla testu cytolitycznego (Rysunek 3A).
      1. Wybierz Rura 1 i kliknij przycisk Wykres punktowy, aby utworzyć wykres FSC-A/SSC-A. Narysuj bramkę prostokątną nad wszystkimi zdarzeniami z progiem FSC-A >5 x 10⁴, aby wykluczyć resztki komórek.
      2. Wybierz parametr SSC-A/CFSE dla nowego wykresu kropkowego. Wybierz parametr 7-AAD/CFSE dla nowego wykresu kropkowego i narysuj bramkę czterokwadrantową, aby zdefiniować cztery subpopulacje.
      3. Kliknij przycisk Załaduj próbkę, aby najpierw przeanalizować ślepą próbkę kontrolną.
      4. Dostosuj napięcie SSC-A i FSC-A. Zidentyfikuj populację martwych komórek przy użyciu parametrów kanału CFSE i 7-AAD. Zapisz dane z > 20 000 komórek CFSE⁺ w każdej próbce.
   4. Powtórzyć ppkt 7.4.6 dla badania wszystkich próbek.
   5. Otwórz pliki zawierające wartości statystyczne każdej pojedynczej próbki, aby przeanalizować populacje komórek niezdolnych do życia i wyeksportować dane do plików analizy.

Celem obecnego protokołu jest wyizolowanie i ekspansja indukowanych przez cytokiny limfocytów T zabójcy (CIK) z monocytów krwi obwodowej oraz ocena cytotoksycznego działania CIK odpowiednio przeciwko hematologicznym komórkom nowotworowym i litym komórkom nowotworowym. Indukcję CIK zidentyfikowano na podstawie rozpoznania CD3/CD56. Rysunek 1A pokazuje protokół do wprowadzania i rozszerzania CIK. Reprezentatywne wyniki strategii bramkowania do analizy subpopulacji limfocytów T CD3 + CD56 + od zdrowych dawców zilustrowano w Rysunek 1B. Rysunek 1C przedstawia analizę statystyczną proporcji CIK od trzech osób.

Rysunek 2A pokazuje, że proporcja komórek CD3+CD56+ (0,65% dla oryginalnego PBMC, lewy dolny panel i 27,4% dla komórek CIK zebranych w dniu 14, prawy dolny panel) znacznie wzrosła po 14 dniach ekspansji. W naszym systemie hodowli komórki CIK dały około pół setki razy większe zmiany w porównaniu z pierwotną liczbą PBMC (Rysunek 2B).

Rysunek 3 pokazuje cytotoksyczne działanie CIK na ludzkie komórki K562 przewlekłej białaczki szpikowej i komórki OC-3 ludzkiego raka jajnika. Komórki K562 lub OC-3 (cel, T) wybarwiono barwnikiem niefluorescencyjnym (CFSE), który został rozszczepiony przez wewnątrzkomórkowe esterazy w żywotnych komórkach, a następnie stał się barwnikiem wysoce fluorescencyjnym. W badaniu kokultury cytotoksycznej komórki K562 lub OC-3 barwione CFSE były poddawane jednoczesnej obróbce z komórkami CIK przez 24 godziny. Pod koniec inkubacji wszystkie komórki zebrano i wybarwiono barwnikiem 7-AAD, który jest barwnikiem wiążącym kwasy nukleinowe, który jest używany jako sonda żywotności do wykluczania martwych komórek. Rozmiar i ziarnistość komórek CIK i CFSE+ są zilustrowane na Rysunek 3A. Komórki K562 barwione CFSE (komórki docelowe, T) poddano współdziałaniu komórek CIK (komórki efektorowe, E) w stosunku E / T = odpowiednio 0: 1, 5: 1 i 10: 1. Oceniono wszystkie komórki 7-AAD + komórek CFSE + K562. Wyniki statystyczne pochodziły z trzech niezależnych eksperymentów. Podstawowa liza oznacza procent śmierci komórki przy braku komórek efektorowych (E:T = 0:1). Rysunek 3B pokazuje oczywistą cytotoksyczność CIK wobec komórek OC-3 (E:T = 10:1) po 24 godzinach inkubacji.

Rysunek 1: Schemat blokowy indukcji i ekspansji komórek zabójczych indukowanych przez cytokiny. (A) PBMC od zdrowych dawców, którzy wyrazili zgodę, były początkowo narażone na rhIFN-γ (dzień 0), a następnie rhIL-2, rhIL-1α i mAb anty-CD3 (dzień 1) co 3 dni (dzień 4). Następnie pożywkę odświeżano pożywką zawierającą rhIL-2 co 3 dni, a komórki zbierano w 14 dniu. (B) Morfologia komórek CIK w ciągu 7 dni od indukcji. Aktywację i ekspansję komórek CIK przeprowadzono zgodnie z opisem w protokole. Komórki obserwowano pod mikroskopem świetlnym odpowiednio w dniach 1, 5 i 7 (powiększenie = 40x, podziałka = 200 μm). (C) Liczenie komórek przeprowadzano co tydzień. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Proporcja limfocytów T CD3 + CD56 + z reprezentatywnej próbki PBMC. (A) Limfocyty rozpoznano na podstawie określonej wielkości i ziarnistości. Wybrana populacja pojedynczych komórek do analizy metodą cytometrii przepływowej. (B) Analizę statystyczną skuteczności ekspansji CIK u trzech zdrowych dawców przeprowadzono za pomocą testu t (*, p < 0,01). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 3: Cytotoksyczne działanie komórek CIK na ludzką przewlekłą białaczkę szpikową K562 i komórki OC-3 ludzkiego raka jajnika. (A) Po kohodowli z komórkami CIK przez 24 godziny, komórki docelowe K562 rozpoznano i bramkowano na podstawie barwienia barwnika CFSE. Kwadrantowa ilustracja całkowitej populacji komórek pod wybranym parametrem 7-AAD/CFSE oraz skumulowanej cytotoksyczności komórek CIK przy wskazanym stosunku E:T. (B) Cytotoksyczne działanie komórek CIK na komórki OC-3 w stosunku E:T = 10:1. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy deklarują brak konkurujących ze sobą konfliktów interesów finansowych.