LarvaSPA, czyli metoda montowania larw Drosophila do długotrwałego obrazowania poklatkowego

Obrazowanie poklatkowe na żywo to potężna metoda badania dynamicznych procesów komórkowych. Informacje przestrzenne i czasowe dostarczane przez filmy poklatkowe mogą ujawnić ważne szczegóły, które pomogą odpowiedzieć na pytania dotyczące biologii komórki. Larwa Drosophila jest popularnym modelem in vivo do badań z wykorzystaniem obrazowania na żywo, ponieważ jej przezroczysta ściana ciała pozwala na nieinwazyjne obrazowanie struktur wewnętrznych^1,2. Ponadto u Drosophila dostępne są liczne narzędzia genetyczne do fluorescencyjnego znakowania struktur anatomicznych i makrocząsteczek³. Jednak długoterminowe obrazowanie poklatkowe larw Drosophila jest trudne. W przeciwieństwie do nieruchomych wczesnych zarodków lub poczwarek, larwy Drosophila poruszają się nieustannie, co wymaga unieruchomienia w celu obrazowania na żywo. Skuteczne sposoby unieruchamiania żywych larw Drosophila obejmują montaż w oleju halowęglowym z chloroformem⁴, znieczulenie za pomocą roztworu izofluranu lub dichlorfosu⁵ i ściskanie między szkiełkiem nakrywkowym a szkiełkiem mikroskopowym⁶. Chociaż niektóre z tych metod były używane w mikroskopii, żadna z nich nie jest skuteczna w długoterminowym obrazowaniu na żywo. Opracowano inne metody obrazowania neuronów ściany ciała u pełzających larw przy użyciu konwencjonalnej mikroskopii konfokalnej lub mikroskopii świetlnej^7,8,9. Jednak metody te nie są idealne do monitorowania dynamiki komórkowej ze względu na ruch larw.

Opracowano nowe metody, aby uzyskać długoterminowe obrazowanie poklatkowe larw Drosophila. Za pomocą "chipa larwowego" z polidimetylosiloksanu (PDMS), larwy Drosophila mogą być skutecznie unieruchomione poprzez odsysanie wytwarzane przez podciśnienie w specjalistycznej mikrokomorze bez znieczulenia. Jednak ta metoda nie oferuje wysokiej rozdzielczości czasowej dla badań biologii komórki i ma ścisłe ograniczenia dotyczące wielkości zwierząt¹⁰. Inna metoda wykorzystująca urządzenie anestezjologiczne pozwoliła na obrazowanie na żywo larw Drosophila w wielu punktach czasowych i została zastosowana do badania połączeń nerwowo-mięśniowych^{11,12,13,14,15,16}. Jednak ta metoda również nie pozwala na ciągłe obrazowanie przez okres dłuższy niż 30 minut i wymaga wielokrotnego stosowania desfluranu, który może hamować aktywność neuronalną i wpływać na badany proces biologiczny^17,18. Ostatnio nowa metoda, która łączy urządzenie mikroprzepływowe i krioanestezję, została wykorzystana do unieruchamiania larw o różnych rozmiarach na krótkie okresy czasu (minuty)¹⁹. Jednak metoda ta wymaga specjalistycznych urządzeń, takich jak system chłodzenia, a dłuższe okresy unieruchomienia wymagają wielokrotnego chłodzenia larw.

Tutaj prezentujemy uniwersalną metodę unieruchamiania larw Drosophila, która jest kompatybilna z nieprzerwanym obrazowaniem poklatkowym przez ponad 10 godzin. Ta metoda, którą nazywamy "stabilizacją larw przez częściowe przyczepienie" (LarvaSPA), polega na przyklejeniu naskórka larwy do szkiełka nakrywkowego w celu obrazowania w specjalnie zbudowanej komorze obrazowania. Protokół ten opisuje, jak wykonać komorę obrazowania i jak montować larwy na różnych etapach rozwoju. W metodzie LarvaSPA pożądane segmenty ciała są przyklejane do szkiełka nakrywkowego za pomocą kleju reagującego na promieniowanie UV. Prostopadłościan PDMS dodatkowo wywiera nacisk na larwy, uniemożliwiając ucieczkę. Powietrze i wilgoć w komorze obrazowania zapewniają przeżycie częściowo unieruchomionych larw podczas obrazowania. Zalety LarvaSPA w porównaniu z innymi technikami obejmują: (1) Jest to pierwsza metoda, która pozwala na ciągłe obrazowanie na żywo nienaruszonych larw Drosophila przez wiele godzin z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną; (2) Metoda ma mniej ograniczeń co do wielkości larw; (3) Komora obrazowania i prostopadłościany PDMS mogą być produkowane przy minimalnych kosztach i nadają się do wielokrotnego użytku.

Oprócz opisania metody montowania larw, podajemy kilka przykładów jej zastosowania do badania rozwoju dendrytów i degeneracji dendrytów neuronów arboryzacji dendrytycznej (da) Drosophila.

1. Wykonanie komory obrazowania

1. Metalowa rama może być wykonana z aluminiowego bloku w typowym warsztacie mechanicznym. Specyfikacja ramy jest zilustrowana w Rysunek 1A.
2. Aby zbudować komorę obrazowania, uszczelnij spód metalowej ramy za pomocą długiego szkiełka nakrywkowego (22 mm x 50 mm) i kleju UV (Rysunek 1A). Utwardź klej UV za pomocą ręcznej lampy UV.

2. Wykonywanie prostopadłościanów PDMS

1. Przygotuj formę do prostopadłościanów PDMS.
   1. Przymocuj warstwy taśmy pakowej do wewnętrznej powierzchni prostokątnej (80 mm x 55 mm) szalki Petriego lub okrągłej płytki do hodowli komórkowych. Użyj jednej warstwy (0,063 mm grubości) dla larw drugiego stadium rozwojowego, 2 warstwy (0,126 mm grubości) dla wczesnych larw trzeciego stadium lub trzech warstw (0,189 mm grubości) dla larw późnego trzeciego stadium rozwojowego (Rysunek 1B).
   2. Pokrój taśmę na paski o określonej szerokości za pomocą żyletki: 1,5 mm dla taśmy 1-warstwowej i 2 mm dla taśmy 2-warstwowej lub 3-warstwowej. Szerokość i grubość paska określi wielkość larw, które może pomieścić końcowy prostopadłościan PDMS. Pozostaw co najmniej 5 mm odstępu między dwoma paskami. Usuń warstwy taśmy zakrywające przestrzeń (Rysunek 1B).
   3. Usuń kurz z wewnętrznej powierzchni płyty za pomocą taśmy klejącej. Forma jest gotowa do użycia.
2. Przygotuj mieszankę PDMS.
   1. W małym pojemniku dokładnie wymieszaj 7 g bazy PDMS i 0,7 g utwardzacza (w proporcji 10:1).
   2. Umieścić pojemnik w eksykatorze próżniowym na co najmniej 15 minut w celu usunięcia powietrza z mieszaniny.
   3. Powoli wlej około 5,5 g mieszaniny PDMS na formę, aby osiągnąć grubość 1–2 mm (Rysunek 1B).
   4. Umieścić mieszaninę PDMS w eksykatorze próżniowym ponownie na co najmniej 15 minut w celu usunięcia pozostałych pęcherzyków powietrza z mieszaniny. Rozbij kilka ostatnich pęcherzyków za pomocą końcówki pipety.
   5. Utwardzić PDMS na płaskiej powierzchni w inkubatorze ciepła w temperaturze 65 °C przez 2 godziny.
   6. Użyj żyletki, aby poluzować utwardzony PDMS wzdłuż krawędzi formy i odłącz go od formy. Przechowuj PDMS między dwoma kawałkami dużej taśmy klejącej w temperaturze pokojowej.
   7. W przypadku wczesnych i późnych larw trzeciego stadium rozwojowego, pokrój PDMS na prostopadłościany o wymiarach 8 mm x 2 mm x 1 mm (wzdłuż przerywanych linii w Rysunek 1B), umieszczając rowek utworzony przez pasek taśmy (krok 2.1.2) pośrodku dłuższego boku prostopadłościanu (Rysunek 1B,C). W przypadku larw drugiego stadium rozwojowego przytnij prostopadłościan o wymiarach 8 mm x 1 mm x 1 mm.

3. Montaż larw do długoterminowego obrazowania poklatkowego

1. Przygotuj górne szkiełko nakrywkowe do montażu.
   1. Wybierz sześć prostopadłościanów PDMS z rowkami dopasowanymi do rozmiarów larw. Postępuj zgodnie z zalecanym rowkiem i rozmiarem PDMS w oparciu o kroki 2.1.1, 2.1.2 i 2.2.7.
   2. Usuń kurz z powierzchni PDMS za pomocą taśmy klejącej.
   3. Przymocuj cztery kawałki taśmy dwustronnej (12 mm x 5 mm) na długim szkiełku nakrywkowym (22 mm x 50 mm) w celu późniejszego zamocowania prostopadłościanów PDMS. Odstępy między dwoma kawałkami taśmy dwustronnej powinny być takie same jak szerokość rowka PDMS.
   4. Nałóż małą kroplę (~1,2 μl) kleju UV w rowek każdego prostopadłościanu PDMS i dodaj sześć małych kropli kleju UV w przestrzeń między taśmą dwustronną na szkiełku nakrywkowym.
2. Przygotuj larwy do montażu.
   1. Za pomocą kleszczy oczyść larwy w wodzie, aby usunąć pokarm z powierzchni ciała.
   2. Umieść czyste larwy na małym kawałku zwilżonej bibuły na małej (35 mm) szalce Petriego bez pokrywki. Umieść małą szalkę Petriego na dużej (60 mm) szalce Petriego zawierającej kawałek suchej bibuły. W kapturze chemicznym nanieść 8–12 kropli (160–240 μl) izofluranu na suchą bibułkę za pomocą plastikowej pipety transferowej i zamknąć pokrywę dużej szalki Petriego.
   3. Odczekaj 2–3 minuty, monitorując larwy. Wyjmij larwy z dużej szalki Petriego, gdy ich haczyki gębowe przestaną się poruszać.
3. Dosiądź zwierząt.
   1. Aby zobrazować struktury po stronie grzbietowej zwierzęcia, umieść unieruchomione larwy na kleju UV między dwustronną taśmą na szkiełku nakrywkowym, tak aby naskórek grzbietowy był skierowany w stronę szkiełka nakrywkowego.
   2. Przykryj każdą larwę blokiem PDMS i dopasuj pień larwy do rowka PDMS. Pozostaw głowę i ogon larwy poza rowkiem PDMS. Unikaj blokowania przetchlinków larwy przez klej.
   3. Dociśnij końce bloku PDMS do taśmy dwustronnej bez przykładania siły do rowka. Delikatnie pociągnij za ogon larwy, aby spłaszczyć naskórek pod PDMS.
   4. Klej UV utwardzać przez 4 minuty za pomocą ręcznej lampy UV na wysokim ustawieniu (około 0,07 mW/mm²).
      UWAGA: Chroń oczy okularami ochronnymi podczas korzystania z UV lamp.
   5. Odwróć szkiełko nakrywkowe do góry nogami i powtórz krok 3.3.4.
   6. Zwilż mały kawałek papieru do soczewek (15 mm x 30 mm) 20 μl–30 μl wody. Umieść zwilżony papier do soczewek na dnie komory obrazowania (Rysunek 1A,D).
   7. Umieść szkiełko nakrywkowe na komorze tak, aby larwy były skierowane do wnętrza komory. Przyklej oba końce szkiełka nakrywkowego do metalowej powierzchni za pomocą kleju UV (Rysunek 1A,D). Grzbietowa strona larwy jest gotowa do obrazowania pod mikroskopem konfokalnym (Ryc. 1E).

4. Obrazowanie

1. Zobrazuj larwy za pomocą odpowiedniego mikroskopu. Wszystkie wyniki pokazane w tym protokole (Rysunek 2, Rysunek 3, Wideo S2, Wideo S3 i Wideo S4) zostały uzyskane przy użyciu systemu konfokalnego z obiektywem olejowym 40x (1,30 NA).

5. Odzyskiwanie komory obrazowania i prostopadłościanów PDMS

1. Po obrazowaniu usuń olej z górnego szkiełka nakrywkowego za pomocą bibuły do soczewek. Odłącz górne szkiełko nakrywkowe od metalowej ramy, wycinając żyletką przestrzeń między szkiełkiem nakrywkowym a metalową ramą. Komora obrazowania jest gotowa do ponownego użycia.
2. Odczep prostopadłościany PDMS od górnego szkiełka nakrywkowego za pomocą kleszczy. Zwiń prostopadłościany PDMS na taśmie klejącej, aby usunąć resztki kleju i kurz. Prostopadłościany PDMS są gotowe do ponownego użycia.

Komora obrazowania larw jest skonstruowana poprzez sklejenie ze sobą specjalnie wykonanej metalowej ramy i dwóch szkiełek nakrywkowych. Konstrukcja metalowej ramy jest określona na rysunku 1A. Larwy Drosophila wewnątrz komory przykleja się do górnego szkiełka nakrywkowego za pomocą kleju UV i prostopadłościanów PDMS. Rowek na prostopadłościonie PDMS i taśma dwustronna prostopadłościan są przymocowane, aby stworzyć przestrzeń do trzymania larw (ryc. 1B, C). PDMS wywiera również delikatny nacisk, aby spłaszczyć ścianę ciała larwy i fizycznie ograniczyć ruch larw. Na koniec na dnie komory umieszcza się mały kawałek mokrego papieru do soczewek, aby zapewnić wilgoć. Ten układ może unieruchomić larwy Drosophila na dłużej niż 10 godzin w celu ciągłego obrazowania. Większość zwierząt jest żywa po 10 godzinach i można je odzyskać, aby dorosnąć do stadium poczwarki. Komora obrazowania może pomieścić jednocześnie do dziewięciu larw. Rysunek 1D przedstawia sześć larw w późnym stadium trzecim w stadium rozwojowym zamontowanych w komorze. Pnie larw są nieruchome, podczas gdy ich głowy i ogony mogą się swobodnie poruszać (Rysunek 1E i Wideo S1). Metoda ta została z powodzeniem wykorzystana do obrazowania larw w drugim stadium do wędrujących larw w trzecim stadium za pomocą ciągłego obrazowania w wysokiej rozdzielczości przez okres do 15 godzin. Komora jest przeznaczona do obrazowania za pomocą mikroskopów pionowych, ale konfiguracja działa również w przypadku mikroskopów odwróconych, po prostu obracając komorę.

Tutaj demonstrujemy zastosowanie LarvaSPA w badaniu dynamiki neuronalnych dendrytów i degeneracji dendrytów na przykładzie neuronów klasy IV da (C4 da) jako modelu (Rysunek 2, Rysunek 3, Filmy S2–S4). Neurony C4 da są somatosensorycznymi nocyceptorami zlokalizowanymi na ścianie ciała larwy, których dendryty unerwiają naskórek larwy1,20,21,22. Dendryty C4 wykazują bardzo dynamiczne zachowania wzrostowe w trakcie rozwoju larw, co skutkuje całkowitym pokryciem powierzchni ciała lub wypełnieniem przestrzeni23. Neurony C4 da zostały również z powodzeniem wykorzystane do badania degeneracji i regeneracji dendrytów po urazie fizycznym24,25,26,27.

Do obrazowania dynamiki dendrytów, larwy od 48 godzin po złożeniu jaj (AEL) w drugim stadium do 120 godzin AEL w trzecim stadium wędrowania zostały zamontowane w komorze obrazowania w celu obrazowania poklatkowego za pomocą punktowej skaningowej mikroskopii konfokalnej. Filmy poklatkowe zostały wykonane w odstępie 3 minut, aby uchwycić zachowania wzrostu dendrytów C4 da oznaczonych przez ppk-CD4-tdTom lub UAS-CD4-tdTom sterowanych przez ppk-Gal46. Przez cały okres obrazowania (do 12 godzin) gałęzie dendrytowe wysokiego rzędu neuronów C4 wykazywały złożone zachowania wzrostowe, w tym wydłużanie, wycofywanie, tworzenie gałęzi i eliminację gałęzi (Rysunek 2A–2F), co wskazuje na zdrowie neuronów. Nasze filmy uchwyciły również homotypowe odpychania dendro-dendrytowe, w których końcówki dendrytów cofały się po kontakcie z innymi dendrytami (Rysunek 2F). Ogólnie rzecz biorąc, wyniki te pokazują, że obrazowanie poklatkowe za pomocą LarvaSPA jest skuteczne w badaniu rozwoju neurologicznego.

Aby zobrazować degenerację dendrytów, użyliśmy lasera MaiTai do przecięcia pierwotnych dendrytów w pobliżu ciał komórek neuronalnych C4. Larwy zostały odzyskane i umieszczone w komorze do obrazowania począwszy od 1,5 godziny po urazie (AI) (Ryc. 3, Wideo S4). Filmy rejestrowały kluczowe wydarzenia podczas degeneracji dendrytów, w tym pęcznienie dendrytów, fragmentację dendrytów i usuwanie szczątków dendrytów. W tym samym eksperymencie ciało tłuszczowe larw zostało również zmodyfikowane tak, aby wydzielało aneksynę V-GFP (AV-GFP), czujnik, który znakuje eksternalizację fosfatydyloseryny (PS) na powierzchni komórki27. Zaobserwowaliśmy specyficzne znakowanie dendrytów degenerujących się przez AV-GFP (Rysunek 3), co sugeruje, że PS został wystawiony na powierzchnię dendrytów degenerujących, aby służyć jako sygnał zjadania dla późniejszego usunięcia przez fagocytozę27.

Rysunek 1: Komora obrazowania do montażu LarvaSPA. (A) Schematy komory obrazowania ze szczegółowymi specyfikacjami, przedstawiające zarówno widok z góry, jak i widok z boku. Jasnoniebieskie cieniowanie w widoku z góry wskazuje na zwilżony papier do soczewek. Komora jest uszczelniona szkiełkiem nakrywkowym górnym i szkiełkiem nakrywkowym dolnym. Pozycja zamontowanej larwy jest zilustrowana. (B) Schematy formy PDMS (widok z góry) i formy po napełnieniu mieszaniną PDMS (widok z boku). Paski w kolorze szarym oznaczają odpowiednio dwa paski taśmy 1-warstwowej, dwie 2-warstwowe i dwie 3-warstwowe. Żółte cieniowanie w widoku z boku wskazuje na mieszaninę PDMS w formie. Przerywane linie wskazują, gdzie należy przyciąć utwardzony PDMS. Widok boczny diagramu nie jest rysowany w skali. (C) Fotografie pokazujące widok z góry i z boku prostopadłościanu PDMS. Podziałka = 1 mm. (D) Fotografie przedstawiające komorę obrazowania przed zamontowaniem oraz komorę obrazowania z sześcioma unieruchomionymi larwami Drosophila w późnym trzecim stadium rozwojowym zamontowanymi grzbietową stroną do góry. Podziałka = 10 mm. (E) Bliższe spojrzenie na larwę w (D). Podziałka = 1 mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Obrazowanie poklatkowe dynamiki dendrytów. (A-F) Wybrane klatki z filmów poklatkowych dendrytów neuronów klasy IV da w określonych punktach czasowych po rozpoczęciu obrazowania. Zdjęcia larw wykonano 48 godzin AEL (A i F), 72 h AEL (B), 96 godzin AEL (C) i 120 godzin AEL (D). Neurony są oznaczone przez ppk>CD4-tdTom (A, D, E i F) lub ppk >CD4-tdTom (B i C). Niebieskie strzałki wskazują retrakcję dendrytów w porównaniu z poprzednim punktem czasowym. Żółte strzałki wskazują wydłużenia dendrytów w porównaniu z poprzednim punktem czasowym. (E) Morfologia dendrytów pod koniec 12 godzin obrazowania. (F) Następujące po sobie klatki z 3-minutowymi interwałami w filmie ilustrującym jak gałąź dendrytu u drugiej larwy w stadium rozwojowym rozciągała się (żółte strzałki) a następnie cofała (niebieskie strzałki) po tym jak zetknęła się z innym dendrytem. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ryc. 3: Obrazowanie poklatkowe degeneracji dendrytów i naświetlanie sygnału zjadania mnie. Wybrane klatki z filmu poklatkowego przedstawiające degenerujące się dendryty neuronu da klasy IV po urazie laserowym. Dendryty były oznaczone przez ppk>CD4-tdTom. Sygnał PS eat-me na dendrytach degenerujących się został wykryty przez Annexin-GFP (AV-GFP), który jest wydzielany przez ciało tłuszczowe. Żółte strzałki wskazują gałęzie z oznaczeniem AV-GFP. Niebieskie strzałki wskazują dendryty ulegające fragmentacji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wideo S1: Trzecia larwa w stadium rozwojowym jest unieruchomiona w wcięciu prostopadłościanu PDMS. Kliknij tutaj, aby obejrzeć ten film. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać.)

Wideo S2: Dendryty dynamicznie się wysuwają i chowają w drugiej larwie w stadium rozwojowym. Kliknij tutaj, aby obejrzeć ten film. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać.)

Wideo S3: Dendryty dynamicznie się rozciągają i chowają u wędrującej larwy w trzecim stadium rozwojowym. Kliknij tutaj, aby obejrzeć ten film. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać.)

Wideo S4: Dendryty ulegają degeneracji i odsłaniają fosfatydyloserynę po urazie laserowym u larwy trzeciego stadium rozwojowego. Kliknij tutaj, aby obejrzeć ten film. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać.)

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.