Hodowla i obrazowanie ludzkich organoidów nabłonkowych nosa

Wprowadzenie do techniki
Testy oparte na hodowlach ex vivo są coraz częściej wykorzystywanym narzędziem w medycynie precyzyjnej i badaniu patofizjologii chorób. Pierwotna hodowla komórek ludzkiego nabłonka nosa (HNE) została wykorzystana w licznych badaniach mukowiscydozy^1,2,3,4,5,6,7^{,8,9,10,11,12,13}, choroba dziedziczona autosomalnie recesywnie, która wpływa na funkcję komórek nabłonkowych w wielu narządach. Posiew HNE stanowi odnawialne źródło nabłonka dróg oddechowych, które można uzyskać prospektywnie i podsumowuje właściwości elektrofizjologiczne i biochemiczne w celu zbadania aktywności transbłonowego regulatora przewodnictwa (CFTR) mukowiscydozy. Próbki komórek HNE można pobierać przy minimalnych skutkach ubocznych¹⁴, podobnie jak w przypadku popularnych wirusowych wymazów z dróg oddechowych. Niedawno opublikowano pracę badawczą opisującą model badania mukowiscydozy uzyskany z biopsji szczoteczki HNE^11,13. Chociaż podobnie jak w przypadku innych modeli wykorzystujących podstawowy HNE^2,3 i tkanki jelitowej^{15,16,17,18,19}, szczegółowa charakterystyka różnicowania i obrazowania tego modelu jest opisana tutaj do wykorzystania w badaniach nad mukowiscydozą i jako pomoc w badaniach nad innymi chorobami dróg oddechowych¹³. Model organoidu nie jest nieograniczony, jak unieśmiertelnione linie komórkowe, ale może być rozszerzony poprzez warunkowe przeprogramowanie (przy użyciu napromieniowanych i inaktywowanych fibroblastów zasilających i inhibitorów kinazy Rho) do stanu bardziej przypominającego komórki macierzyste^20,21,22,23. Przetwarzanie biopsji szczoteczki HNE przy użyciu tej metody pozwala uzyskać dużą liczbę komórek nabłonkowych do wykorzystania w wielu zastosowaniach przy wyższej przepustowości, przy jednoczesnym zachowaniu zdolności do pełnego różnicowania. Chociaż protokół ten został opracowany przy użyciu komórek zasilających, inne metodologie mogą być stosowane przez badaczy, którzy chcą uniknąć technologii ogniw zasilających^14,24.

Znaczenie tej techniki dla biologii pulmonologicznej
Znaczące badanie poświęcono zrozumieniu, w jaki sposób brak regularnego, funkcjonującego CFTR w błonie komórkowej komórek nabłonkowych powoduje dysfunkcję płuc, trzustki, wątroby, jelit lub innych tkanek. Dysfunkcyjny transport jonów nabłonkowych, szczególnie chlorków i wodorowęglanów, powoduje zmniejszenie objętości płynów wyściełających nabłonek i zmiany w wydzielinie śluzowej, co prowadzi do zastoju i niedrożności błony śluzowej. W innych chorobach dróg oddechowych, takich jak pierwotna dyskineza rzęsek, zmieniony ruch rzęsek upośledza klirens śluzowo-rzęskowy i prowadzi do zastoju śluzu i niedrożności²⁵. W związku z tym obecny model organoidu HNE został opracowany do różnych zastosowań, w zależności od projektu eksperymentalnego i zasobów badacza. Obejmuje to obrazowanie żywych komórek za pomocą barwienia żywych komórek; utrwalenie i cięcie w celu scharakteryzowania morfologii; barwienie immunofluorescencyjne przeciwciałami i obrazowanie konfokalne w całości w celu uniknięcia zakłócenia struktur wewnątrzświetlnych; oraz obrazowanie w jasnym polu i mikrooptyczna koherentna tomografia do ilościowych pomiarów częstotliwości dudnienia rzęsek i transportu śluzowo-rzęskowego¹³. Aby ułatwić ekspansję innym badaczom, do hodowli wykorzystano dostępne na rynku odczynniki i materiały eksploatacyjne. Opracowano test funkcjonalny, w którym wykorzystano popularne techniki mikroskopowe i bardziej specjalistyczny sprzęt. Ogólnie rzecz biorąc, chociaż obecny model został zaprojektowany do oceny aktywności CFTR na początku badania lub w odpowiedzi na terapię, techniki opisane w tym protokole można zastosować do innych chorób związanych z funkcjonowaniem komórek nabłonka, zwłaszcza transportu płynu w komórkach nabłonka.

Porównanie do innych metodologii
Ostatnio opracowano użyteczność tego modelu organoidowego poprzez korelację in vitro odpowiedzi modulatora CFTR organoidów pacjentów z ich odpowiedzią kliniczną¹¹. Warto zauważyć, że wykazano również, że obecny model był równoległy do odpowiedzi na prąd zwarciowy, który jest obecnie złotym standardem oceny funkcji CFTR, u tych samych pacjentów. Prąd zwarciowy różni się od testu pęcznienia, ponieważ ten pierwszy mierzy funkcję CFTR poprzez transport jonów²⁶. W przeciwieństwie do tego, ten test mierzy bardziej końcowy efekt transportu płynów, dostarczając dodatkowych informacji na temat ogólnej funkcji CFTR^{27,28,29,30,31,32}. Pomiary prądu zwarciowego nadal są powszechną i niezawodną metodą określania aktywności kanału chlorkowego CFTR^1,33. Te testy elektrofizjologiczne wymagają specjalistycznego, drogiego sprzętu, wymagają wielokrotnie więcej komórek do każdej repliki eksperymentalnej niż test organoidowy, nie mogą być łatwo zautomatyzowane i nie można ich skalować do zastosowań o wyższej przepustowości. Inny model organoidowy wywodzący się z nabłonka jelit ma dodatkowe zalety^15,16,17,18, takie jak lepsza zdolność replikacji, ale nie pochodzi z tkanki dróg oddechowych ani nie jest powszechnie dostępny. Szczotkowanie HNE uzyskuje się za pomocą niedrogich szczoteczek cytologicznych bez konieczności sedacji i przy minimalnym ryzyku. Szczotkowanie nie wymaga kontaktu z klinicystą i może być wykonywane przez przeszkolonych koordynatorów badań i inny personel badawczy¹⁴. Model organoidu HNE może być hodowany przez dowolne laboratorium z możliwością podstawowej hodowli komórek, a niektóre zastosowania można wykonać za pomocą standardowych technik mikroskopowych. Wszystkie te zalety zapewniają dodatkowy dostęp do technologii do oceny funkcji nabłonka dróg oddechowych, która w innym przypadku mogłaby być niedostępna dla niektórych laboratoriów. Ponadto organoidy HNE mogą być wykorzystywane do badania innych stanów chorobowych, które wpływają na drogi oddechowe, takich jak pierwotna dyskineza rzęsek²⁵ lub infekcja wirusowa, której organoidy jelitowe nie mogą.

Próbki HNE zostały pobrane w szpitalu Children's of Alabama. Wszystkie opisane tutaj procedury i metody zostały zatwierdzone przez IRB University of Alabama w Birmingham (UAB IRB #151030001). Aby ułatwić ekspansję i poprawić funkcję ludzkich komórek nabłonka nosa (HNE), obecne metody hodowli są zaadaptowane z dobrze znanej metody hodowli na granicy faz powietrze-ciecz (ALI)^28,34. HNE były początkowo pobierane za pomocą biopsji szczoteczki, jak opisano wcześniej^12,14, przy czym jedyną różnicą było użycie szczoteczki cytologicznej. Wszystkie etapy przetwarzania próbek i hodowli komórkowej przeprowadzono w komorze bezpieczeństwa biologicznego.

1. Hodowla komórkowa i ekspansja komórek nabłonka nosa

1. Po umyciu skóry przechowuj próbkę z biopsji nosa w 8 ml pożywki RPMI w stożkowej probówce o pojemności 15 ml na lodzie i przenieś ją do laboratorium w ciągu 4 godzin (nie więcej niż 24 godziny).
2. Zdysocjuj biopsję szczoteczki do nosa na 8 ml pożywki RPMI w stożkowej probówce o pojemności 15 ml, przepuszczając szczoteczkę cytologiczną przez końcówkę pipety o dużym otworze o pojemności 1 ml (odetnij końcówkę) kilka razy, aż szczoteczka zostanie oczyszczona z tkanki.
3. Odwirować komórki w temperaturze 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, usunąć supernatant, a następnie ponownie zawiesić osad komórkowy w 3 ml roztworu do oddzielania komórek (patrz tabela materiałów) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 16 minut w celu wytrawienia.
4. Użyj 5 ml pożywki eksplatacyjnej (Tabela 1), aby dwukrotnie przemyć komórki. Następnie dodaj komórki do kolby T75 wstępnie wysianej napromieniowanymi i inaktywowanymi fibroblastami 3T3²² (50%-60% konfluencji), aby wspólnie hodować komórki i namnażać się w pożywce ekspansyjnej przez 7-14 dni (patrz Rysunek 1 dla odpowiedniej kolonii). Przed użyciem należy przetestować napromieniowane fibroblasty 3T3, aby upewnić się, że nie mogą się namnażać, co negatywnie wpłynie na ekspansję komórek nabłonka.
   UWAGA: Wyrzuć komórki, jeśli zbieg komórek nabłonka nosa nie osiągnie 70% w ciągu 14 dni.
5. W przypadku komórek pochodzących od pacjentów z mukowiscydozą wprowadzić cztery antybiotyki (100 μg/ml tobramycyny, 2,5 μg/ml amfoterycyny B, 100 μg/ml ceftazydymu, 100 μg/ml wankomycyny, patrz tabela materiałów) do pożywki ekspandacyjnej w celu dezynfekcji komórek przez pierwsze 3 dni hodowli, a następnie zastąp pożywkę pożywką ekspansywacyjną wolną od antybiotyków, zmieniając pożywkę co 2 dni.
   UWAGA: To ograniczone stosowanie antybiotyków ma na celu zmniejszenie utraty kultur w wyniku kolonizacji bakteryjnej, jednocześnie zachęcając do proliferacji po usunięciu dodatkowych antybiotyków. Antybiotyki te mogą być dostosowane do konkretnych wyników mikrobiologicznych pacjenta, w razie potrzeby z uwzględnieniem nadwrażliwości.
6. Zbierz HNE z kokultury przy użyciu metody podwójnej trypsynizacji²², gdy komórki osiągną około 80% konfluencji. Metoda ta zapewnia, że napromieniowane i inaktywowane fibroblasty 3T3 są usuwane z kolby i nie zanieczyszczają późniejszego wysiewu organoidów.
   1. Przemyć komórki 1x DPBS, a następnie dodać 1,5 ml 0,05% trypsyny-EDTA do kolby T75 na 4 minuty w temperaturze 37 °C, aby usunąć napromieniowany i inaktywowany fibroblast 3T3 z hodowli.
   2. Przepłukać kolbę T75 1x DPBS dwukrotnie, aby dokładnie zmyć wszelkie pozostałe fibroblasty 3T3; dodać 1,5 ml 0,05% trypsyny-EDTA do kolby T75 na 10 minut w temperaturze 37 °C w celu odłączenia HNE.
   3. Zneutralizować trypsynę inhibitorem trypsyny sojowej (patrz tabela materiałów) w stosunku 1:1. Odwirować komórki o sile 500 x g przez 5 minut, a następnie usunąć supernatant. Po jednokrotnym umyciu komórek 5 ml pożywki ekspandatoryjnej, komórki są gotowe do wysiewu w celu wyhodowania organoidów.
      UWAGA: Zaleca się stosowanie HNE o numerze przejścia trzy do dalszych eksperymentów.

2. Wzrost i różnicowanie organoidów w preparatach i wkładkach kulturowych

1. Rozmrozić macierz zewnątrzkomórkową (ECM) hodowli organoidów przez noc w temperaturze 4 °C. Schłodzić końcówki pipet do temperatury 4 °C, a 15-dołkowe szkiełka do angiogenezy (patrz tabela materiałów) przez noc w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: ECM należy ustawić w temperaturze 4 °C na noc przed pobraniem komórek.
2. Pokryć szkiełka 5 μl zimnego 100% ECM na lodzie (odpipetować 5 μl zimnego 100% ECM z zimną końcówką pipety do każdego dołka 15-dołkowego szkiełka), a następnie umieścić je w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C na co najmniej 30 minut w celu konsolidacji.
3. Policz HNE pobrane z kohodowli za pomocą hemocytometru i rozcieńcz komórki do 500 komórek/μl w całkowitej liczbie za pomocą 20% ECM rozcieńczonego pożywką różnicującą (Tabela 2) na lodzie. Następnie wysiewaj 5 μl mieszaniny zimnych komórek/ECM do każdego dołka ze szkiełek pokrytych ECM.
4. Natychmiast przenieść szkiełka do inkubatora do hodowli w temperaturze 37 °C na 1 godzinę w celu konsolidacji mieszaniny komórka/ECM.
5. Nakarm komórki w każdym dołku z 15-dołkowych szkiełek angiogenezy 50 μl pożywki różnicowej. Zmieniaj pożywkę co drugi dzień, aż organoidy będą gotowe do dalszych eksperymentów.
   UWAGA: Organoidy można zwykle uwidocznić po 1-2 dniach. W każdym dołku szkiełek znajduje się 20-90 organoidów. Organoidy mogą zazwyczaj przetrwać 40-60 dni w ECM z karmieniem co drugi dzień, gdy są trzymane w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C.
6. Hodowla organoidów we wstawkach hodowlanych (patrz tabela materiałów) w celu uzyskania większej ilości do określonych zastosowań (takich jak sekcje do badań histologicznych lub immunofluorescencji) zgodnie z krokami wymienionymi poniżej.
   1. Aby wyhodować organoidy we wkładkach hodowlanych, należy przygotować ECM do hodowli organoidów, końcówki pipet i wkładki, jak wspomniano w krokach 2.1-2.2. Pokryj wkładki 100 μl zimnego 100% ECM.
   2. Wysiewanie 60 μl mieszaniny komórka/ECM (500 komórek/μL z 20% ECM w pożywce różnicowej) na wierzchu powłoki ECM w wkładce.
      UWAGA: Wszystkie inne etapy tworzenia organoidów we wkładkach są takie same, jak te przeprowadzane na szkiełkach, kroki 2.4-2.5.
   3. Dodać 600 μl pożywki różnicującej do dolnej części wkładu. Zmieniaj pożywkę co drugi dzień, aż organoidy zostaną użyte do eksperymentów, zwykle 2-3 tygodnie.

3. Przygotowanie i izolacja organoidów do immunofluorescencji całej góry

1. Izolacja i utrwalanie organoidów
   1. Wstępnie potraktuj 8-dołkowe szkiełka ze szklanym dnem klejem komórkowym (patrz Tabela materiałów) przez 30 minut zgodnie z Reference³⁵. Po wyrzuceniu roztworu suszyć studzienki na powietrzu przez 30 minut.
   2. Aby zebrać organoidy, usuń pożywkę z górnej części ECM, a następnie dodaj 50 μl zimnego 1x PBS do każdej studzienki z 15-dołkowych szkiełek na lodzie (1:1 z objętością ECM).
   3. Pipetować w górę i w dół 3-5 razy za pomocą 200 μl końcówki do pipety o dużej średnicy, a następnie dozować roztwór na środek studzienki szkiełek 8-dołkowych.
   4. Natychmiast usuń nadmiar płynu ze studzienek za pomocą pipety z cienką końcówką. Następnie umieścić szkiełko komorowe w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 40 minut, aby wzmocnić organoid przylegający do szklanego dna.
   5. Po dwukrotnym delikatnym umyciu 1x PBS, utrwal organoidy za pomocą 300 μl 4% paraformaldehydu w każdym dołku przez 30 minut w temperaturze pokojowej (RT).
   6. Przemyć dwukrotnie 1x PBS i przechowywać organoidy w 1x PBS w temperaturze 4 °C w celu barwienia immunologicznego przez okres do 2 tygodni.
2. Barwienie immunofluorescencyjne
   1. Aby zmniejszyć autofluorescencję, dodaj 250 μL 50 mM NH₄Cl w 1x PBS do każdej studzienki szkiełek przy RT przez 30 minut, delikatnie wstrząsając na wytrząsarce z prędkością 20 obr./min.
   2. Po dwukrotnym umyciu 1x PBS, przepuszczaj komórki 0,1% Triton X-100 przez 30 min w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając przy 20 obr./min.
   3. Po dwukrotnym przemyciu 1x PBS, dodać 300 μL roztworu blokującego, w tym 5% BSA i 0,1% Triton X-100 w 1x PBS, do każdej studzienki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
   4. Po przemyciu dodać przeciwciało pierwszorzędowe do odpowiednich studzienek, a następnie przeciwciała drugorzędowe (patrz tabela materiałów). Przygotować roztwory przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych w 2% BSA i 0,3% Triton X-100 w 1x PBS. Inkubować wszystkie przeciwciała pierwszorzędowe w temperaturze 4 °C przez 2 dni, a wszystkie przeciwciała drugorzędowe w temperaturze 4 °C przez 1 dzień.
      UWAGA: Końcowe stężenia zależą od białka pożądanego w eksperymencie. Proszę sprawdzić koncentrację zapasów w karcie katalogowej producenta. Następnie należy obliczyć końcowe stężenia na podstawie rozcieńczeń użytych w tabeli materiałów.
   5. Po inkubacji dokładnie umyć studzienki 1x PBS i dodać DAPI w 2% BSA i 0,3% Triton X-100 do każdej studzienki w celu barwienia jądrowego.
   6. Zobrazuj organoidy za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego, z obiektywem 20-60x zanurzonym w oleju (patrz tabela materiałów). Użyj trybu stosu Z, aby ustawić górną i dolną granicę obrazu i użyj zalecanego optymalnego rozmiaru kroku Z określonego przez oprogramowanie konfokalne.
      UWAGA: Zastosowano następujące cztery konfokalne długości fal wzbudzenia laserowego: 408,7 nm, 489,1 nm, 561,7 nm i 637,9 nm.

4. Przygotowanie i izolacja organoidów do sekcji histologicznej

1. Aby zebrać organoidy do badań histologicznych, usuń pożywkę z kultury i dodaj 50 μl zimnego 1x PBS do każdej studzienki szkiełek na lodzie.
2. Pipetować w górę i w dół trzy do pięciu razy za pomocą końcówki do pipety o dużej średnicy 200 μl, połączyć wszystkie roztwory z 15-dołkowego szkiełka lub wkładek hodowlanych w stożkowej probówce o pojemności 15 ml na lodzie. Dostosuj całkowitą objętość roztworu w probówce do 10 ml, dodając dodatkowo zimny 1x PBS.
3. Odwirować probówkę w temperaturze 4 °C, 300 x g przez 5 minut; odessać sklarowany osad i dodać 60 μl ciepłego histożelu (patrz tabela materiałów) w celu wymieszania z osadem organoidowym przy użyciu 200 μl końcówki do pipety o dużej średnicy.
4. Natychmiast przenieść zawiesinę do formy histologicznej. Po utrwaleniu histożelu w temperaturze pokojowej umieścić blok formy w 4% paraformaldehydzie w celu utrwalenia przez noc w temperaturze 4 °C.
5. Po zatopieniu w parafinie pokrój blok histożelu na przekroje 5 μm (na przykład za pomocą mikrotomu), przymocuj skrawki do szkiełek i wybarwij za pomocą hematoksyliny i eozyny (H&E) lub przeciwciał znakowanych immunofluorescencyjnie. Rób zdjęcia za pomocą mikroskopu jasnego pola lub odwróconego mikroskopu epifluorescencyjnego (patrz tabela materiałów).

5. Obrazowanie żywych organoidów

UWAGA: Następujące kroki są wykonywane przy użyciu automatycznego systemu obrazowania (patrz Tabela materiałów). Różne systemy obrazowania muszą dostosować te kroki zgodnie z instrukcjami producenta. Niezależnie od zastosowanego sprzętu, obrazowanie żywych organoidów wymaga komory środowiskowej o kontrolowanej temperaturze i nawilżonej z dołączonym kontrolerem gazu CO₂ .

1. Aby monitorować różnicowanie organoidów przed wykonaniem funkcjonalnego testu pęcznienia³⁶, należy ręcznie uchwycić obrazy całych preparatów za pomocą dowolnego mikroskopu jasnego pola lub automatycznego systemu obrazowania, jak opisano poniżej.
   1. Włącz zasilanie automatycznego systemu obrazowania i sterownika gazu CO₂/O₂ i poczekaj, aż system zakończy automatyczną kalibrację (~30 min).
   2. Po zakończeniu należy ustawić temperaturę systemu obrazowania na 37 °C; dodać 15 ml sterylnej wody do zbiornika nawilżającego, otworzyć zawory CO₂, zamknąć pokrywy i pozostawić system obrazowania do wstępnej inkubacji przez co najmniej 30 minut przed obrazowaniem.
   3. Otwórz oprogramowanie do automatycznego obrazowania, aby skonfigurować protokół obrazowania i wybierz lokalizację, w której chcesz zapisać nieprzetworzone dane eksperymentalne.
      UWAGA: Przykładowy plik protokołu (plik uzupełniający 1), specyficzny dla systemu obrazowania, został dostarczony jako szablon do automatycznego obrazowania organoidów w celu monitorowania różnicowania organoidów.
   4. Po spełnieniu ustawień środowiskowych należy natychmiast przenieść do dwóch 15-dołkowych szkiełek z pokrywkami do komory środowiskowej we wkładzie uchwytu szkiełka automatycznego systemu obrazowania (patrz Tabela materiałów).
   5. Wybierz studzienki, które mają zostać zobrazowane i rozpocznij obrazowanie, aby zakończyć obrazowanie żądanych studzienek.
      UWAGA: Podstawowe zalecane ustawienia to: obiektyw powietrzny 4x i 10x, kanał jasnego pola, montaż 2 x 2 dla obiektywu 4x w celu pokrycia całego obszaru studni, montaż 4 x 4 w przypadku obiektywu 10x. Ustawienia stosu Z: od trzech do sześciu warstw stosu Z, rozmiar kroku Z = 50-100 μm, jeden do dwóch plasterków poniżej punktu autofokusa i trzy do pięciu plasterków powyżej.
2. Aby zobrazować żywe organoidy do wykorzystania w teście pęcznienia wywołanego forskoliną (FIS), należy użyć mikroskopu ze zautomatyzowanym stolikiem wyposażonym w kontrolowaną środowiskowo komorę obrazowania, która umożliwia kontrolę temperatury i CO₂ .
   1. Zacznij od kroków 5.1.1-5.1.4, zastąp plik protokołu w kroku 5.1.3 plikiem dostarczonym w przykładowym pliku protokołu (plik uzupełniający 2) zawierającym ustawienia specyficzne dla przeprowadzenia testu FIS.
   2. Przed każdym eksperymentem dostosuj ustawienia ekspozycji, oceniając co najmniej trzy dołki dla każdego slajdu (skrajnie po lewej, w środku i skrajnie po prawej). Zastosuj przesunięcia współrzędnych X i Y, aby upewnić się, że cel będzie znajdował się w środku studni dla wszystkich studni.
      UWAGA: Podstawowe zalecane ustawienia to: 4x obiektyw powietrzny, Kanał 1 = Jasne pole, Kanał 2 = DAPI, montaż 2 x 2 (cztery kafelki obrazu). Ustawienia stosu Z: trzy do czterech warstw stosu Z, rozmiar kroku Z = 50-100 μm, jeden plasterek poniżej punktu autofokusa i dwa do trzech plasterków powyżej. Czas akwizycji obrazu: 8 h z 20-minutowymi interwałami (suma odczytów = 25; Odczyt 1 to T = 0).
   3. Po odpowiednim wybraniu wszystkich ustawień wybierz dołki do zobrazowania dla obu slajdów lub zaznacz wszystkie i rozpocznij bieg zgodnie z instrukcjami sprzętu.
   4. Po uruchomieniu zapisz eksperyment, zamknij oprogramowanie do obrazowania i wyłącz system obrazowania³⁷.

6. Podstawowe pomiary strumienia świetlnego

UWAGA: Odbywa się to za pomocą oprogramowania do ręcznej analizy obrazowania (zobacz Tabelę Materiałów). Podobną metodologię można zastosować przy użyciu oprogramowania typu open source³⁸ lub dowolnego oprogramowania, które może mierzyć obszar obszaru na obrazie.

1. W oprogramowaniu otwórz Panel pomiarów automatycznych, klikając prawym przyciskiem myszy dół ekranu, wybierz Pomiar, a następnie Wyniki pomiarów automatycznych. Pojawi się tam obszar każdego zmierzonego obszaru zainteresowania (ROI).
2. Otwórz obraz organoidu w oprogramowaniu i wybierz 5-10 organoidów z widocznymi lumenami.
   UWAGA: Lumeny będą okrągłym obszarem w środku organoidu, który wyraźnie różni się kolorem niż reszta organoidu (Rysunek 2A).
3. Korzystając z funkcji pomiaru wielokątnego zwrotu z inwestycji, przytrzymaj obraz prawym przyciskiem myszy, aby otworzyć menu i wybierz Wielokątny zwrot z inwestycji, aby obrysować pełny organoid, aby uzyskać całkowitą powierzchnię organoidu (TSA). Następnie, korzystając z tej samej funkcji, obrysuj obszar światła (LA) (Rysunek 2B).
4. Powtórzyć te czynności dla pozostałych organoidów w studzience i wszystkich studzienek w teście.
5. Eksportuj dane do programu Excel. Podziel LA przez TSA i uśrednij wszystkie organoidy z próbki, aby uzyskać podstawowy współczynnik strumienia świetlnego (BLR)^11,13.
   UWAGA: Zazwyczaj ~87% organoidów bez mukowiscydozy będzie miało BLR powyżej 0,6, a 97% będzie miało ponad 0,5, podczas gdy tylko 14% organoidów CF będzie miało BLR powyżej 0,6, a 31% będzie miało ponad 0,5.

7. Wstępna obróbka i automatyczne obrazowanie organoidów HNE

UWAGA: Wszystkie etapy obróbki wstępnej są przeprowadzane w czystej komorze bezpieczeństwa biologicznego. Przed wykonaniem kroku 7.1 należy wstępnie skonfigurować automatyczny system obrazowania i oprogramowanie do rejestrowania testu. Inkubacja za pomocą DAPI jest opcjonalna, ale jest zalecana jako zabezpieczenie przed awarią, jeśli jakość obrazów w jasnym polu jest zagrożona. W takim przypadku zamiast tego można przeanalizować kanał DAPI (377 nm).

1. Organoidy należy wstępnie inkubować w studzience składającej się z 15-dołkowych szkiełek z 50 μl pożywki różnicującej zawierającej DAPI z lub bez 100 μM CFTRinh-172 (patrz tabela materiałów) w inkubatorze o temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Podczas inkubacji organoidów należy wykonać krok 5.2.1, stosując niestandardowy protokół oznaczania pęcznienia zgodnie z plikiem uzupełniającym 2.
2. Usunąć pożywkę do wstępnej inkubacji za pomocą szklanej pipety Pasteura z aspiracją. Dodać 10 μM forskoliny i 100 μM IBMX (koktajli stymulacyjnych) (patrz Tabela Materiałów), aby uzyskać całkowitą objętość 50 μL pożywki różnicującej do każdej studzienki.
   UWAGA: Upewnij się, że do studzienek nie zostały wprowadzone żadne pęcherzyki. Bąbelki na obrazach wpłyną na automatyczną analizę.
3. Niezwłocznie rozpocznij protokół obrazowania FIS, postępując zgodnie z krokami od 5.2.2 do 5.2.4. Pobieraj obrazy co 20 minut w każdym dołku, z łącznym czasem pracy wynoszącym 8 godzin.

8. Automatyczna analiza testu pęcznienia wywołanego forskoliną na organoidach HNE

1. Otwórz oprogramowanie do automatycznej analizy obrazowania, znajdź eksperyment zapisany wcześniej w kroku 7.3 i wyświetl obrazy eksperymentu.
2. Wybierz okno naczynia, które ma zostać ocenione, i wybierz opcję zawierającą przetworzone obrazy, które zostały zszyte i rzutowane z osi. Ten krok powinien dostarczyć obrazu całej studni ze wszystkimi organoidami w ramce obrazowania w celu oceny maskowania i pomiarów.
3. Wybierz obraz studni do oceny. Wybierz pozycję Analizuj. Powtórz ten proces dla innych obrazów, aby zapewnić odpowiednie maskowanie dla wszystkich obrazów uwzględnionych w pomiarach automatycznych. Zapisz parametry ustawień.
4. Po zakończeniu analizowania ustawień zastosuj zmiany. Oprogramowanie zmieni pomiary w oparciu o ustawienia.
   UWAGA: Po zakończeniu wstępnego przetwarzania obrazu należy przeprowadzić kontrolę jakości (QC) w celu zapewnienia spójnego maskowania. Obejmują one ręczny przegląd wszystkich studzienek, aby upewnić się, że organoidy znajdują się w ramce obrazowania, pęcherzyki lub zanieczyszczenia nie są niewłaściwie zamaskowane, a także sprawdzenie maskowania w jasnym polu i kanałach DAPI.
5. Eksportuj dane do analizy podsumowującej (w tym wykresów i analizy statystycznej).

Ekspansja HNE jest niezbędna dla kwitnącej hodowli organoidów. HNE z udanego pobrania próbki powinny zwiększyć się do ponad 70% zbieżności około 10 dni. Przykład udanych i nieudanych próbek pokazano odpowiednio na Rysunek 1A i Rysunek 1B. Komórki muszą zostać odrzucone, jeśli nie mogą osiągnąć 70% zbieżności w ciągu 14 dni po kohodowli z napromieniowanymi komórkami 3T3. Wszelkie zanieczyszczone komórki należy natychmiast wyrzucić, jeśli nie można ich szybko uratować za pomocą dodatkowych środków przeciwdrobnoustrojowych.

Wzrost organoidów został porównany w 15-dołkowych preparatach i wkładkach hodowlanych. Wkładki hodowlane są grubsze i bardziej oddalone od obiektywu niż optycznie zoptymalizowane szkiełka, co wpływa na obraz i rozdzielczość. Mimo to nie zaobserwowano znaczącej różnicy w morfologii w tych dwóch metodach hodowli, jak pokazano na Rysunek 2. Różnice morfologiczne można zaobserwować między organoidami bez mukowiscydozy i mukowiscydozą, jak pokazano na Rysunek 3A. Organoidy inne niż mukowiscydoza mają zwykle większe światło zawierające w sobie więcej płynu. W przeciwieństwie do tego, organoidy mukowiscydozy mają zwykle mniejsze światło z mniejszą ilością płynu, a czasami są wypełnione śluzem i zanieczyszczeniami. Rozmiar strumienia świetlnego został zmierzony ręcznie (Rysunek 3B), a bazowy współczynnik lumenów został obliczony i pokazany w Rysunek 3C. Organoidy o przekroju poprzecznym scharakteryzowano za pomocą barwienia H&E i immunofluorescencji. Reprezentatywne obrazy są pokazane w Rysunek 4A,B. Markery nabłonka dróg oddechowych, takie jak rzęski, śluz i ścisłe połączenie, są wykazane w organoidach za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego w całości pokazanego na Rysunek 5A-D. W zależności od zastosowania można zastosować immunofluorescencję przekrojową lub całkowitą. Metoda całościowego montażu zachowuje trójwymiarową naturę organoidu, utrzymując jego wnętrze w stanie nienaruszonym, jak pokazano w wcześniej opublikowanym work13.

Funkcja CFTR została oceniona za pomocą testu na pęcznienie wywołane forskoliną (FIS) przy użyciu automatycznego systemu obrazowania. Tylko 15-dołkowe szkiełka są używane do testów funkcjonalnych ze względu na lepszą rozdzielczość obrazu. Reprezentatywny eksperyment z dawką i odpowiedzią forskoliny u ochotników bez mukowiscydozy (n = 5 osób) pokazano w Rysunek 6A, aby zilustrować uzasadnienie zoptymalizowanego czasu obrazowania i analizy. Dane porównujące reakcje organoidów innych niż mukowiscydoza i mukowiscydozy są szczegółowo opisane w poprzednich publikacjach11,13. Dawka-odpowiedź pokazuje przyrostową zmianę aktywności CFTR w celu zademonstrowania najlepszego podejścia do pomiarów. Oceniono czas trwania testu wynoszący 1 h i 8 h ( Rysunek 6B, C), a także analizę przy użyciu średniej zmiany ułamkowej (AFC) w funkcji pola pod krzywą (AUC) jest widoczna w Rysunki 6C,D. Opierając się na naszych wcześniejszych doświadczeniach, obrzęk u większości osób i stanów utrzymuje się na stałym poziomie po 8 godzinach, a w niektórych przypadkach powoduje pękanie organoidów w tym czasie. W związku z tym testy ograniczono tylko do 8 godzin. Przy tej wydłużonej długości testu pęcznienie staje się nieliniowe. Użycie AUC uwzględnia również zarówno zmiany wielkości, jak i tempo zmian. W związku z tym AUC w ciągu 8 godzin zastosowano dla wszystkich testów FIS w końcowej metodologii.

Rysunek 1: Obrazy w jasnym polu HNE w kokulturze. HNE namnażają się w podłożach ekspandacyjnych z napromieniowanymi i inaktywowanymi fibroblastami 3T3 przez 10 dni. Do obrazowania komórek używa się mikroskopu odwróconego jasnego pola. (A) HNE dobrze rosną w dużym skupisku (strzałka). Natomiast w (B) HNE słabo rosną w dwóch małych skupiskach (czarne strzałki) otaczających napromieniowane komórki 3T3. Podziałka = 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Tworzenie organoidów HNE w 15-dołkowym szkiełku i wkładce hodowlanej. Obrazy organoidów w jasnym polu zostały uchwycone za pomocą mikroskopu odwróconego jasnego pola przez 21 dni. Organoidy w szkiełku 15-dołkowym (A) mają bardziej precyzyjne i ostrzejsze obrazy niż te we wstawce hodowlanej (B). Nie zaobserwowano różnic morfologicznych między organoidami hodowanymi na szkiełku podstawowym a wkładką. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Wielkość światła organoidu (panel A) i pomiary strumienia świetlnego (panel B i C). (A) Organoidy inne niż CF mają zazwyczaj większy prześwit i więcej płynu niż organoidy CF (F508del/F508del). (B) Metoda ręcznego pomiaru całkowitej powierzchni (TSA) wskazywanej przez czerwony kontur i powierzchni świetlnej (LA) wskazanej zielonym konturem w pojedynczym organoidzie. (C) Przykład wykorzystania całkowitej powierzchni i powierzchni światła do obliczenia podstawowego współczynnika strumienia świetlnego (LA: TSA) w organoidach od podmiotu niechorego na mukowiscydozę w porównaniu z podmiotem z mukowiscydozą. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Przekrój organoidów zatopionych w parafinie. (A) Przykład barwienia H&E w organoidach od podmiotu niezwiązanego z mukowiscydozą i mukowiscydozą (F508del/F508del). (B) Barwienie immunofluorescencyjne rzęsek w organoidzie. Kolor zielony to rzęski (biała strzałka) wybarwione acetylowaną tubuliną i przeciwciałem drugorzędowym znakowanym FITC, a niebieski to jądra znakowane DAPI. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Konfokalne obrazy immunofluorescencji całej góry w organoidach. (A,C) Maksymalne obrazy projekcyjne dwóch reprezentatywnych organoidów. (B,D) Trójwymiarowe obrazy rekonstrukcyjne odpowiednio (A) i (C). Na platformie mikroskopu konfokalnego zamontowano 8-dołkowy szkiełko podstawowe, a do stworzenia mikrofotografii użyto obiektywu o powiększeniu 40x. Do obrazowania i rekonstrukcji obrazów zastosowano oprogramowanie do analizy obrazowej. Białe strzałki wskazują śluz (w B) i rzęski (w C) w świetle organoidów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Uzasadnienie długości testu pęcznienia i metod analizy. Forskolina (FSK) wywołany obrzęk (FIS) test do badania funkcji CFTR na pierwotnych komórkach nabłonka nosa. Różną dawkę forskoliny wskazaną na rysunkach podawano 21-dniowym organoidom w pożywce różnicującej; Pęcznienie organoidów było natychmiast rejestrowane za pomocą automatycznego imagera przez 8 godzin. Po 8 godzinach obrzęk jest widoczny w (A) (n = 5, osoby bez mukowiscydozy) przy użyciu średniej zmiany ułamkowej (AFC). Dawka-odpowiedź FSK jest porównywana z AFC po 1 godzinie (B) vs. po 8 godzinach (C), co sugeruje, że test 8 godzin może powodować bardziej znaczącą różnicę w pęcznieniu między różnymi dawkami FSK niż te po 1 godzinie. AFC (C) w porównaniu z obszarem pod krzywą, porównuje się AUC (D) po 8 godzinach, co wskazuje, że AUC może odzwierciedlać niewielką różnicę w obrzęku niż AFC. Oś X w panelach (B-D) reprezentuje różne warunki obróbki odpowiadające symbolom w legendzie rysunku. Wszystkie słupki błędów na rysunkach wskazują odchylenie standardowe. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Wszystkie komponenty do tworzenia nośnika rozszerzeń. Opisano szczegółowe informacje na temat stężenia zapasu odczynników, przechowywania zapasów, ilości zapasów potrzebnych do wytworzenia pożywki o pojemności 500 ml oraz stężenia końcowego. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Wszystkie składniki do tworzenia nośników różnicujących. Opisano szczegółowe informacje na temat stężenia zapasu odczynników, przechowywania zapasów, ilości zapasów potrzebnych do wytworzenia pożywki o pojemności 500 ml oraz stężenia końcowego. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Plik uzupełniający 1: Przykładowy plik protokołu specyficzny dla systemu obrazowania jest dostarczany jako szablon do automatycznego obrazowania organoidów w celu monitorowania różnicowania organoidów. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Przykładowy plik protokołu zawierający ustawienia specyficzne dla przeprowadzenia testu FIS. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

JSG jest wymieniony jako wynalazca w zgłoszeniu patentowym 20170242033 z Uniwersytetu Północnej Karoliny, które opisuje podobny model. Kiedy licencjonowana technologia od UNC generuje tantiemy, wynalazcy otrzymują część dochodów. W przeciwnym razie autorzy deklarują brak konfliktu interesów. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, w gromadzeniu, analizach lub interpretacji danych, w pisaniu manuskryptu ani w podejmowaniu decyzji o publikacji wyników.