Współhodowla organoidów nabłonkowych mysiego jelita cienkiego z wrodzonymi komórkami limfoidalnymi

Komunikacja między nabłonkiem jelitowym a układem odpornościowym rezydującym w jelitach jest kluczowa dla utrzymania homeostazy jelitowej¹. Zakłócenia tych interakcji są związane zarówno z chorobami miejscowymi, jak i ogólnoustrojowymi, w tym nieswoistymi zapaleniami jelit (IBD) i nowotworami przewodu pokarmowego². Godny uwagi przykład jednego z niedawno opisanych krytycznych regulatorów homeostazy pochodzi z badania wrodzonych komórek limfoidalnych (ILC), które stały się kluczowymi graczami w krajobrazie immunologii jelitowej³. ILC to grupa heterogennych wrodzonych komórek odpornościowych, które regulują homeostazę jelit i koordynują stan zapalny głównie poprzez sygnalizację za pośrednictwem cytokin⁴.

Mysie ILC są szeroko podzielone na podtypy w oparciu o profile ekspresji czynników transkrypcyjnych, receptorów i cytokin⁵. ILC typu 1, które obejmują cytotoksyczne komórki NK (Natural Killer) i pomocnicze ILC typu 1 (ILC1), są definiowane przez ekspresję czynnika transkrypcyjnego (eomesoderminy) Eomes i białka T-box ulegającego ekspresji w limfocytach T (T-bet) ^{6, odpowiednio}, i wydzielają cytokiny związane z odpornością T helper typu 1 (T_H1): interferon-γ (IFNγ) i czynnik martwicy nowotworu (TNF), w odpowiedzi na interleukinę (IL)-12, IL-15 i IL-18⁷. Podczas homeostazy rezydujące w tkankach ILC1 wydzielają transformujący czynnik wzrostu β (TGF-β), aby stymulować proliferację nabłonka i przebudowę macierzy⁸. ILC typu 2 (ILC2) reagują głównie na zakażenie robakami pasożytniczymi poprzez wydzielanie cytokin związanych z T-pomocnikiem typu 2 (T_H2): IL-4, IL-5 i IL-13 i charakteryzują się ekspresją receptora sierocego związanego z kwasem retinowym (ROR) α (ROR-α)⁹ i GATA Binding Protein 3 (GATA-3)^10,11,12. U myszy jelitowe "zapalne" ILC2 są dodatkowo charakteryzowane ekspresją receptora podobnego do lektyny komórki zabójczej (podrodzina G członek 1, KLRG)¹³, gdzie reagują na nabłonkowe komórki kępek pochodzące z IL-25^14,15. Wreszcie, ILC typu 3, które obejmują komórki indukujące tkankę limfoidalną i pomocnicze ILC typu 3 (ILC3), są zależne od czynnika transkrypcyjnego ROR-γt¹⁶ i grupują się w grupy, które wydzielają czynnik stymulujący tworzenie kolonii makrofagów granulocytów (GM-CSF), IL-17 lub IL-22 w odpowiedzi na lokalne sygnały IL-1β i IL-23¹⁷. Komórki indukujące tkankę limfoidalną skupiają się w łatach Peyera i mają kluczowe znaczenie dla rozwoju tych wtórnych narządów limfatycznych podczas rozwoju¹⁸, podczas gdy ILC3 są najliczniejszym podtypem ILC w dorosłej mysiej blaszce jelita cienkiego właściwej. Jeden z najwcześniejszych mysich systemów kohodowli organoidów jelitowych z ILC3 został wykorzystany do zbadania wpływu cytokiny IL-22 na reprodukcję transduktora sygnału i aktywatora transkrypcji 3 (STAT-3) za pośrednictwem bogatego w leucynę powtórzenia zawierającego receptor sprzężony z białkiem G 5 (Lgr5) ⁺ proliferację jelitowych komórek macierzystych¹⁹, potężny przykład regeneracyjnej interakcji ILC-nabłonek. ILC wykazują niejednorodność odcisku między narządami^20,21 i wykazują plastyczność między podzbiorami w odpowiedzi na polaryzację cytokin²². To, co napędza te specyficzne tkankowo odciski i różnice w plastyczności oraz jaką rolę odgrywają w chorobach przewlekłych, takich jak IBD²³, pozostaje ekscytującymi tematami, które można rozwiązać za pomocą współkultur organoidowych.

Organoidy jelitowe okazały się udanym i wiarygodnym modelem do badania nabłonka jelitowego^24,25. Są one generowane przez hodowlę komórek macierzystych Lgr5 ⁺ nabłonka jelitowego lub całych izolowanych krypt, które zawierają komórki Panetha jako endogenne źródło członka rodziny Wnt 3A (Wnt3a). Te struktury 3D są utrzymywane albo w syntetycznych hydrożelach²⁶, albo w biomateriałach, które naśladują blaszkę pierwotną właściwą, na przykład Thermal-crosslinking Basal Zewnątrzcellular Matrix (TBEM), i są dalej uzupełniane czynnikami wzrostu, które naśladują otaczającą niszę, w szczególności nabłonkowym czynnikiem wzrostu (EGF), inhibitorem białka morfogenetycznego kości (BMP) Noggin oraz ligandem Lgr5 i agonistą Wnt R-Spondin1²⁷. W tych warunkach organoidy utrzymują nabłonkowo-podstawową polaryzację nabłonka i przypominają strukturę kosmków krypty nabłonka jelitowego z pączkującymi kryptami komórek macierzystych, które ostatecznie różnicują się w komórki absorpcyjne i wydzielnicze w środku organoidu, które następnie rozprzestrzeniają się do wewnętrznego pseudoświatła przez anoikis²⁸. Chociaż same organoidy jelitowe okazały się niezwykle korzystne jako redukcjonistyczne modele rozwoju i dynamiki nabłonka w izolacji^29,30, mają one ogromny potencjał w przyszłości do zrozumienia, w jaki sposób te zachowania są regulowane, wpływane, a nawet zakłócane przez przedział immunologiczny.

W poniższym protokole opisana jest metoda kohodowli pomiędzy mysimi organoidami jelita cienkiego a ILC1 pochodzącymi z blaszki właściwej, która została niedawno wykorzystana do określenia, jak ta populacja nieoczekiwanie zmniejsza jelitowe sygnatury stanu zapalnego, a zamiast tego przyczynia się do zwiększonej proliferacji nabłonka poprzez TGF-β w tym systemie⁸.

Wszystkie eksperymenty muszą być przeprowadzone zgodnie ze wszystkimi odpowiednimi wytycznymi regulacyjnymi i instytucjonalnymi dotyczącymi wykorzystania zwierząt. Etyczna aprobata dla badania opisanego w poniższym artykule i filmie została uzyskana zgodnie ze wszystkimi odpowiednimi wytycznymi regulacyjnymi i instytucjonalnymi dotyczącymi wykorzystywania zwierząt.

Wszystkie myszy zostały odstrzelone przez zwichnięcie szyjki macicy zgodnie ze standardową procedurą etyczną, przeprowadzoną przez przeszkolone osoby. Przed pobraniem narządów i tkanek przeprowadzono przecięcie tętnicy udowej lub dekapitację (zgodnie z obowiązującym protokołem) jako potwierdzającą ocenę zgonu. Zwierzęta były trzymane w warunkach wolnych od określonych patogenów (chyba że zaznaczono inaczej) w akredytowanej jednostce komercyjnej i jednostce ds. zwierząt w King's College London zgodnie z brytyjską ustawą o zwierzętach (procedury naukowe) z 1986 r. (licencja na projekt brytyjskiego Ministerstwa Spraw Wewnętrznych (PPL: 70/7869 do września 2018 r.; P9720273E z września 2018 r.).

1. Tworzenie mysich organoidów jelita cienkiego

UWAGA: Ta sekcja protokołu opisuje wytwarzanie organoidów jelitowych z mysiego jelita cienkiego. Krypty są najpierw izolowane z tkanki, ponownie zawieszane w TBEM, a następnie inkubowane z pożywkami zawierającymi EGF, Noggin i R-Spondynę (ENR). Tworzenie mysich organoidów w jelicie cienkim zostało również dobrze opisane w innym miejscu^24,25,27.

1. Umieścić TBEM na lodzie do rozmrożenia (40 μl/basenik) i umieścić standardową 24-dołkową płytkę poddaną działaniu kultur tkankowych (odnosi się do płytek o hydrofilowej i ujemnie naładowanej powierzchni) w inkubatorze o temperaturze 37 °C do wstępnego ogrzania.
   UWAGA: 500 μL TBEM rozmrozi się w ciągu około 2-4 godzin; Nie pozostawiaj go w temperaturze pokojowej.
2. Przygotować ~4 ml lub 550 ml na studzienkę pożywki ENR, dodając EGF, Noggin i R-Spondynę do podłoża podstawowego (Tabela 1) i umieścić w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
3. Ubój zwierzęcia w wieku 6-12 tygodni i wypreparowanie jelita cienkiego za pomocą kleszczy i nożyczek do mikrodysekcji. Umieść go w 15 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) na lodzie.
4. Używając żołądka i kątnicy jako punktów orientacyjnych, wyizoluj pożądany obszar jelita cienkiego (dwunastnica, jelito czcze lub jelito kręte). W tym protokole jelito kręte jest izolowane.
5. Zanurz jelito w PBS na 10 cm² szalce Petriego na lodzie. Za pomocą kleszczy delikatnie, ale całkowicie usuń tłuszcz z jelita.
6. Przeciąć tkankę wzdłużnie za pomocą nożyczek do mikrodysekcji (najlepiej z zaokrąglonymi końcówkami, aby uniknąć perforacji). Utrzymując jelito zanurzone w PBS, potrząśnij, aby usunąć kał i utrzymuj śluzówkę do góry, aby śledzić orientację tkanki.
7. Przenieś tkankę do suchej pokrywki szalki Petriego na lodzie, kładąc śluzówkę/kosmki jelita do góry. Trzymając jeden koniec jelita kleszczami, delikatnie zeskrob śluz za pomocą ukośnej krawędzi czystego szkiełka podstawowego.
8. Napełnij płytkę lodowatym PBS i opłucz chusteczkę.
9. Wstępnie pokryj probówkę o pojemności 50 ml PBS2 (PBS + 2% FCS; patrz Tabela 1), aby zapobiec przyleganiu tkanki do tworzywa sztucznego i dodaj 10 ml lodowatego PBS do tej probówki. Pokrój jelito na małe (~2 mm) segmenty i przenieś je do probówki o pojemności 50 ml wstępnie pokrytej PBS2.
10. Używając pipety o pojemności 25 ml pokrytej PBS2, odpipetuj segmenty w górę i w dół 5-10 razy, aby oczyścić fragmenty tkanki.
11. Pozostawić segmenty do osiadania przez 15-30 sekund, usunąć i wyrzucić supernatant PBS i powtarzać kroki 1.10 i 1.11, aż roztwór będzie klarowny (około 3-4 razy).
12. Pozwolić, aby segmenty opadły i odrzucić supernatant PBS. Dodać 30 ml lodowatego buforu izolacyjnego krypty (Tabela 1).
13. Umieść rurki na poziomym wałku lub wahaczu z prędkością 30-60 obr./min (lub delikatnie) na 30 minut w temperaturze 4 °C. Nie inkubuj z większą prędkością, wyższymi temperaturami lub przez dłuższy czas, ponieważ krypty przedwcześnie się wymieszczą i staną się pojedynczymi komórkami o niższej żywotności i wydajności.
    UWAGA: Od tego etapu wszystkie procedury powinny być przeprowadzane w aseptycznym środowisku przy użyciu sterylnych materiałów i odczynników.
14. Pozwolić, aby segmenty jelita osiadły u podstawy probówki o pojemności 50 ml. Usuń bufor izolacyjny krypty bez przerywania osiadłych segmentów i przenieś go do probówki o pojemności 50 ml na lodzie.
    UWAGA: Jeśli proces izolacji krypt był zbyt rygorystyczny, krypty mogą być widoczne w tej frakcji. W związku z tym może on być przechowywany jako rezerwa, ale optymalnie zostanie odrzucony po zakończeniu protokołu.
15. Dodaj 20 ml lodowatego PBS do segmentów jelitowych. Używając pipety o pojemności 25 ml pokrytej PBS2, pipetuj segmenty jelita w górę i w dół 5-8 razy.
16. Pozwól segmentom osiąść przez 30 sekund. Wstępnie pokryj probówkę o pojemności 50 ml i pipetę 25 ml PBS2. Za pomocą tej pipety zebrać supernatant (frakcja 1) do wstępnie powlekanej probówki o pojemności 50 ml i umieścić probówkę na lodzie.
    UWAGA: Frakcja ta służy do wypłukania pozostałego bufora izolacyjnego krypty. Służy jednak również jako dodatkowy etap kontroli jakości; Jeśli pipetowanie było zbyt energiczne, krypty będą obfite w tę frakcję płukania, a jeśli była zbyt delikatna, w tej frakcji będzie bardzo mało zanieczyszczeń. Optymalnie frakcja 1 jest odrzucana na końcu protokołu, ale można ją wykorzystać do tworzenia organoidów, jeśli pojawią się problemy z frakcjami 2-4 uzyskanymi poniżej.
17. Powtórzyć kroki 1.15 i 1.16, ale dodać 10 ml lodowatego PBS zamiast 20 ml i umieścić supernatant w świeżej probówce o pojemności 50 ml wstępnie pokrytej PBS2 (frakcja 2).
18. Powtórzyć krok 1.17 jeszcze dwa razy, ale połączyć otrzymany supernatant z frakcją 2 (do tej samej probówki o pojemności 50 ml z kroku 1.17), aby uzyskać frakcje 2-4. Ta pojedyncza probówka o pojemności 50 ml powinna zawierać usunięte krypty w 30 ml lodowatego PBS.
19. Z zebranych 2-4 frakcji usunąć 50 μl porcji i umieścić ją na szkiełku nakrywkowym. Oceń obecność krypt nabłonkowych za pomocą mikroskopu światła odwróconego.
    UWAGA: Jeśli krypty nie są obecne, powtórz kroki 1.17 i 1.18, używając większej siły podczas pipetowania, aż crypty zostaną zwolnione. Upewnij się, że krypty nie zostały przedwcześnie usunięte z bufora izolacji krypt z kroku 1.14 lub w ułamku 1 z kroku 1.16.
20. Wstępnie pokryj sitko o pojemności 100 μm i probówkę o pojemności 50 ml PBS2. Przepuść zebrane frakcje krypty przez to sitko i do wstępnie powlekanej probówki o pojemności 50 ml.
21. Odcedzać odcedzone frakcje krypty w temperaturze 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
22. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić krypty w 10 ml lodowatego Advanced DMEM/F12. Przenieś krypty do probówki o pojemności 15 ml.
23. Obracać krypty przy 210 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, aby usunąć pojedyncze komórki i limfocyty.
24. Zawieś krypty w 1 ml lodowatego Advanced DMEM/F12.
25. Usunąć podwielokrotność 10 μl i umieścić ją na szkiełku nakrywkowym. Za pomocą mikroskopu ze światłem odwróconym policz liczbę krypt, aby określić ich koncentrację.
26. Oblicz objętość wymaganą dla ~400 i ~1,500 krypt. Wstępnie pokryj końcówkę p1000 PBS2 i użyj tej końcówki do pipetowania wymaganych objętości (zawierających ~400 i ~1,500 krypt) do oddzielnych probówek o pojemności 1,5 ml.
27. Wiruj krypty przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
28. Usunąć jak najwięcej supernatantu, a następnie ponownie zawiesić krypty w 80 μl TBEM umieszczonym na lodzie (wstępnie schłodzić końcówki pipet w temperaturze 4 °C, aby zapobiec żelowaniu matrycy, które następuje w temperaturze 12 °C).
29. Wyjąć z inkubatora płytkę 24-dołkową umieszczoną w kroku 1.1. Delikatnie odpipetuj 40 μl krypt do środka studni powolnymi, okrężnymi ruchami, aby utworzyć płaską, ale 3D strukturę kopuły lub do trzech oddzielnych małych kopułek.
    UWAGA: Żywotność organoidów jest najniższa w środku kopuły, gdzie składniki odżywcze i gazy przenikają mniej efektywnie³¹; w związku z tym maksymalizacja powierzchni wystawionej na działanie mediów przy jednoczesnym zachowaniu wyraźnych struktur 3D ma kluczowe znaczenie.
30. Powtórz krok 1.29, aby utworzyć w sumie dwie studnie o gęstości ~200 krypt na studnię i dwie kolejne studnie o gęstości ~750 krypt na studnię. Bezpośrednio umieścić płytkę w inkubatorze (37 °C i 5% CO_{2 )} na 15-20 minut, uważając, aby nie naruszyć lepkich, ale wciąż płynnych kopuł matrycy.
31. Dodać 550 μl wstępnie podgrzanej pożywki ENR do dołka (od kroku 1.2) i inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO_{2 .} Na tym etapie sugeruje się uzupełnienie pożywki ENR o 5 μM agonisty Wnt (CHIR 99021) i inhibitora 5 μM kinazy Rho (Y-27632) przez pierwsze 24 godziny hodowli po izolacji, aby poprawić wydajność i efektywność generowania organoidów krypt świeżo wyizolowanych z tkanki.
    UWAGA: Krypty powinny zamknąć się, tworząc zaokrąglone struktury w ciągu 24 godzin, a pąki krypty powinny pojawić się w ciągu 2-4 dni (Rysunek 1A).
32. Zastąp świeżą pożywką ENR pod koniec inkubacji w kroku 1.31, a następnie co ~2 dni lub gdy wskaźnik pH fenolu w pożywce hodowlanej zmieni kolor na bladopomarańczowy, ale zanim zmieni kolor na żółty.

2. Utrzymanie mysich organoidów w jelicie cienkim

UWAGA: Ta sekcja protokołu opisuje utrzymanie i przekazywanie mysich organoidów jelita cienkiego. Organoidy są najpierw zbierane, a następnie mechanicznie rozbijane za pomocą wygiętej końcówki p1000. Proces ten rozbija duże organoidy składające się z licznych krypt na wiele mniejszych fragmentów w celu ekspansji i uwalnia martwe komórki, które nagromadziły się w pseudoświetle. Utrzymanie organoidów w jelicie cienkim u myszy zostało również dobrze opisane w innym miejscu^24,25,27. Wszystkie procedury powinny być przeprowadzane w aseptycznym środowisku przy użyciu sterylnych materiałów i odczynników. Przejście lub ekspansja organoidów raz na 4-5 dni, zanim dojdzie do pęknięcia organoidów w wyniku znacznego nagromadzenia szczątków w świetle organoidu. Organoidy mogą być pasażowane w stosunku 1:2-1:3 w zależności od gęstości organoidów, która optymalnie wyniesie od 100 do 200 organoidów na studzienkę.

1. Podobnie jak w krokach 1.1 i 1.2, rozmrozić TBEM na lodzie (40 μl/dołek) i przygotować podłoże ENR (550 μl na dołek). Umieścić pożywkę i standardową płytkę 24-dołkową poddaną działaniu kultur tkankowych w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
2. Wyjąć z inkubatora płytkę zawierającą organoidy. Wyrzuć pożywkę ze studni, która ma być przepuszczona.
3. Dodać 500 μl lodowatego Advanced DMEM/F12 do studzienki. Używając końcówki p1000 (wstępnie pokrytej podłożem, aby uniknąć przywierania organoidów do wnętrza końcówki), zbierz organoidy do probówki o pojemności 15 ml.
4. Przepłukać dno studzienki 250-300 μl lodowatego Advanced DMEM/F12, upewniając się, że w studzience nie pozostały żadne organoidy, a następnie umieścić w probówce o pojemności 15 ml zawierającej zebrane organoidy z kroku 2.3. Powtórz kroki 2.3 i 2.4 podczas przechodzenia przez wiele studzienek i połącz organoidy z wielu studzienek w tej samej probówce o pojemności 15 ml.
5. Odwirowywać organoidy w temperaturze 300 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C.
6. Po odwirowaniu upewnić się, że widoczne są cztery frakcje: frakcja zasadowa ze zdrowymi organoidami, centralna i przezroczysta frakcja matrycowa, frakcja matrycowa zawierająca pojedyncze i martwe komórki oraz górna warstwa supernatantu zawierająca pojedyncze i martwe komórki. Usunąć supernatant, frakcję szczątków i jak najwięcej klarownego fragmentu matrycy, nie naruszając osadu organoidów.
7. Delikatnie zegnij końcówkę końcówki do pipety p1000 (zgięcie około 2-5 mm). Wstępnie pokryj tę końcówkę PBS2 lub Advanced DMEM/F12. Korzystając z tej końcówki, pipetuj organoidy w górę i w dół 10-20 razy, aby mechanicznie rozbić organoidy i pozostałą matrycę.
8. Wirować przy 210 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C.
9. Podobnie jak w kroku 2.6, usuń supernatant, frakcję szczątków i jak najwięcej przezroczystego fragmentu matrycy, nie naruszając osadu zdysocjowanych krypt. Jeżeli zdrowe krypty lub małe organoidy nie utworzyły klarownej osady, należy ponownie odwirować w temperaturze 300 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C.
10. Obliczyć wymaganą objętość TBEM (80-120 μl na studzienkę zebranych organoidów, w zależności od tego, czy stosuje się stosunek pasażów 1:2 czy 1:3).
11. Zawiesić osad w obliczonej objętości TBEM i nanieść 40 μl na studzienkę na wstępnie ogrzaną płytkę 24-dołkową, aby utworzyć kopułę. Bezpośrednio umieścić płytkę w inkubatorze (37 °C; 5% CO₂) na 15-20 minut.
12. Dodać 550 μl pożywki ENR do studzienki i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ . Sprawdź kultury pod kątem tworzenia się organoidów po 24 _godzinach. Wymieniać na świeże podłoże ENR co 2-3 dni po przejściu.

3. Izolacja wrodzonych komórek limfoidalnych blaszki właściwej jelita cienkiego

UWAGA: Ta sekcja protokołu opisuje izolację ILC1 z mysiej blaszki właściwej jelita cienkiego myszy reporterowych RORγt^GFP. Obejmuje to usuwanie komórek nabłonkowych, trawienie tkanek, separację limfocytów w gradinie gęstości i izolację ILC1 poprzez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS). Izolacja FACS zgodnie ze strategią bramkowania w Rysunek 2 wymaga mastermixu barwienia zewnątrzkomórkowego (Tabela 4), z dodatkowymi kontrolami barwienia opisanymi w Tabeli 2 i Tabeli 3 dla maszyny (Tabela 2) i konfiguracji bramkowania (Tabela 3). Myszy reporterowe RORγt^GFP służą do izolowania żywego, czystego ILC1 i wyprowadzania RORγt^GFP+ ILC3. Przetwarzanie tkanek w celu izolacji limfocytów blaszki właściwej zostało również dobrze opisane w innym miejscu³².

1. Przetwarzanie tkanek
   UWAGA: Tkanki pochodzące z poszczególnych biologicznych prób zwierzęcych są przechowywane oddzielnie w tym protokole. Próbki te powinny być odpowiednio oznakowane i w miarę możliwości przechowywane na lodzie. Wszystkie odczynniki, z wyjątkiem enzymów trawiących, powinny osiągnąć temperaturę pokojową, aby zapewnić szybkie trawienie tkanek.
   1. Umieść TBEM na lodzie do rozmrożenia (40 μl/dołek). Przechowywać standardową 24-dołkową płytkę poddaną działaniu kultur tkankowych w inkubatorze o temperaturze 37 °C do wstępnego ogrzania.
   2. Przygotować świeży bufor do usuwania nabłonka i bufor do trawienia (patrz Tabela 1). Przygotować izotoniczne podłoże o niskim gradiencie gęstości lepkości (LVDGM) (90% LVDGM i 10% 10x PBS), 40% izotoniczne LVDGM i 80% izotoniczne LVDGM w buforze neutralizującym (Tabela 1).
   3. Ubój zwierzęcia w wieku 6-12 tygodni, wypreparowanie jelita cienkiego za pomocą kleszczy i nożyczek do mikrodysekcji i umieszczenie jelita w 15 ml PBS na lodzie.
   4. Zanurz jelito w PBS na 10 cm² szalce Petriego na lodzie i użyj kleszczy, aby delikatnie, ale całkowicie usunąć tłuszcz z jelita.
   5. Usuń plastry Peyera (~5-10; biegnące w linii przeciwnej do linii tkanki tłuszczowej) za pomocą nożyczek do mikrodysekcji, aby zubożyć komórki indukujące tkankę limfoidalną i komórki B.
      UWAGA: Łaty Peyera są nieobecne u Rag^-/- i innych zwierząt zubożonych w linię. W przeciwieństwie do pęcherzyków powietrza, łaty Peyera pozostaną na swoim miejscu, jeśli zostaną popchnięte.
   6. Przeciąć tkankę wzdłużnie za pomocą nożyczek do mikrodysekcji (najlepiej z zaokrąglonymi końcówkami, aby uniknąć perforacji). Trzymając jelito zanurzone w PBS, wstrząśnij, aby usunąć kał.
   7. Pokrój tkankę na kawałki o długości 2-4 cm i przenieś je do probówki o pojemności 50 ml.
   8. Dodaj około 20-40 ml lodowatego PBS i energicznie wstrząsaj przez 5-15 sekund, aby usunąć śluz i zanieczyszczenia.
   9. Wylać zawartość probówki na świeżą szalkę Petriego i umieścić fragmenty jelita w tej samej probówce o pojemności 50 ml za pomocą kleszczyków.
   10. Powtórz kroki 3.1.8 i 3.1.9 3-4 razy lub do momentu, gdy PBS będzie czysty.
2. Usuwanie nabłonka
   1. Umieść fragmenty jelit na świeżej szalce Petriego na lodzie. Za pomocą kleszczy podnieś segmenty jelita i usuń nadmiar płynu, stukając w suchą powierzchnię.
   2. Pokrój chusteczkę na kawałki o długości ~0,75-1 cm i przenieś je do świeżej probówki o pojemności 50 ml. Dodać 5-7 ml buforu do usuwania nabłonka (Tabela 1). Odwiruj rurkę i upewnij się, że wszystkie segmenty jelita są zanurzone w buforze.
   3. Inkubować próbki w temperaturze 37 °C z kołysaniem (100-150 obr./min) przez 12-15 min. Wirować probówkę przez 20-30 s.
   4. Powtórzyć kroki 3.2.1-3.2.3 jeszcze raz, odrzucając mętny supernatant (frakcja zawiera komórki nabłonkowe i śródnabłonkowe) i zastępując go świeżym buforem do usuwania nabłonka.
3. Trawienie tkanki
   1. Wysyp zawartość na świeżą szalkę Petriego. Za pomocą kleszczy podnieś segmenty jelita i postukaj w suchą powierzchnię, aby usunąć nadmiar płynu. Umieść cząstki na świeżej szalce Petriego na lodzie.
   2. Zgrupuj segmenty w środku szalki Petriego w gęstą masę. Używając dwóch skalpeli lub ostrych nożyczek, drobno rozdrobnij tkankę, aż osiągnie lepką konsystencję, która może przejść przez końcówkę pipety p1000.
   3. Za pomocą pęsety umieść zmieloną tkankę w czystej probówce o pojemności 50 ml. Przepłukać szalkę Petriego 1-2 ml buforu do wytrawiania (Tabela 1) w celu zebrania pozostałej tkanki i zebrania jej w probówce o pojemności 50 ml z rozdrobnioną tkanką.
   4. Dodać 5-7 ml buforu wytrawiającego do rozdrobnionej tkanki i upewnić się, że cała tkanka została zebrana na dnie probówki.
   5. Próbki należy inkubować w temperaturze 37 °C, przy średnim kołysaniu (~100-150 obr./min) przez 15 minut. Wirować probówkę przez 20-30 s co 5 minut, aby wspomóc trawienie.
   6. Podczas inkubacji próbek umieść sitko o pojemności 40 μm na świeżej probówce o pojemności 50 ml dla każdej próbki. Pokryj filtry 1-2 ml buforu neutralizującego (Tabela 1).
   7. Wirować próbki przez 20-30 s po zakończeniu inkubacji.
   8. Przefiltrować częściowo strawioną tkankę przez powlekany filtr 40 μm do probówki o pojemności 50 ml zawierającej bufor neutralizujący.
   9. Za pomocą pęsety należy pobrać niestrawioną tkankę z filtra 40 μm i umieścić ją z powrotem w probówce o pojemności 50 ml, w której przeprowadzono trawienie, na drugą rundę trawienia. Wyjmij filtry i przepłucz je buforem do wytrawiania, aby usunąć wszelkie niestrawione tkanki przylegające do filtra.
   10. Po usunięciu jak największej ilości niestrawionej tkanki z filtra i umieszczeniu jej z powrotem w probówce o pojemności 50 ml, w której przeprowadzono trawienie, przepłukać filtr 1-2 ml buforem neutralizującym nad probówką o pojemności 50 ml zawierającą przefiltrowany supernatant.
   11. Dodać 20-25 ml buforu neutralizującego do przefiltrowanego supernatantu i umieścić go na lodzie, aby utrzymać żywotność wyizolowanych komórek podczas drugiej rundy trawienia tkanek.
   12. Dodać kolejne 5-10 ml buforu wytrawiającego do niestrawionej tkanki i powtórzyć kroki 3.3.5-3.3.10, upewniając się, że strawioną tkankę przefiltrowano do tej samej probówki, która została użyta w kroku 3.3.8 (ten sam filtr może być również ponownie użyty). Przepłukać filtr buforem neutralizującym, aż do osiągnięcia linii 50 ml, a następnie wyrzucić pozostałą niestrawioną tkankę.
4. Izolacja limfocytów za pomocą gradientu gęstości
   1. Wirować zebrane supernatanty dla każdej kontrpróby biologicznej w temperaturze 500 x g przez 10 minut.
   2. W kroku 3.4.1 dodać 5 ml 80% izotonicznego LVDGM do probówki o pojemności 15 ml dla każdej kontrpróby biologicznej.
   3. Po odwirowaniu odrzucić sklarowany sklarat z przefiltrowanej, strawionej tkanki. Ponownie zawiesić osad w 10 ml 40% izotonicznego LVDGM, upewniając się, że pastylka jest dobrze zhomogenizowana i nie pozostały żadne duże kawałki.
   4. Ustawiając przyrząd do pipetowania na najwolniejsze ustawienie, przechylić probówkę o pojemności 15 ml zawierającą 80% izotonicznego LVDGM i bardzo delikatnie nałożyć 10 ml zawiesiny komórek na 40% izotoniczny LVDGM, upewniając się, że zawiesina komórek nie zmiesza się z frakcją 80%.
      UWAGA: Jeśli frakcje kiedykolwiek przypadkowo się zmieszają, szybko rozprowadź limfocyty, które osiągnęły frakcję 80%, między dwiema probówkami o pojemności 50 ml wypełnionymi PBS i wiruj przez 10 minut przy 500 x g. Następnie odrzucić supernatant i powtórzyć kroki 3.4.3-3.4.4.
   5. Zakręć rurki w temperaturze 900 x g i 20 °C, z przyspieszeniem i odspieszeniem ustawionym na najniższe ustawienie, aby upewnić się, że frakcje nie zostaną zakłócone. Wirować przez 20 minut (nie licząc czasu przerwy).
      UWAGA: Wszystkie procedury, począwszy od tego etapu, powinny być przeprowadzane w aseptycznym kapturze do hodowli tkanek przy użyciu sterylnych materiałów i odczynników.
   6. Wstępnie pokryj probówkę o pojemności 50 ml dla każdej próbki PBS2 i dodaj 45 ml lodowatego PBS.
   7. Po odwirowaniu delikatnie usuń górną warstwę zanieczyszczeń z probówki o pojemności 15 ml. Pokryj końcówkę p1000 PBS2 i użyj jej do zebrania interfazy obciążonej limfocytami między gradientami 40%-80% do probówki o pojemności 50 ml zawierającej 45 ml lodowatego PBS.
   8. Wirować probówki o masie 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
   9. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 500 μl buforu FACS (PBS, 2% FCS, 0,5 mM EDTA i 10 mM HEPES; patrz Tabela 1). Wstępnie pokryj filtr 40 μm buforem FACS i użyj go do przefiltrowania zawiesiny komórek do rurki przepływowej. Przepłukać probówkę o pojemności 50 ml dodatkowymi 500 μl buforu FACS i przefiltrować do tej samej probówki przepływowej.
   10. Usunąć podwielokrotność 10 μl z otrzymanego 1 ml zawiesiny komórek. Policz wydajność limfocytów za pomocą licznika komórek lub hemocytometru i oblicz stężenie komórek dla każdej próbki.
5. Przygotowanie próbki do sortowania - barwienie zewnątrzkomórkowe
   UWAGA: Przeciwciała stosowane w mieszance głównej barwienia zewnątrzkomórkowego, jak również odczynniki do przygotowania barwnika do utrwalania żywotności i roztworu bloku Fc, stosuje się w stężeniach wystarczających dla maksymalnie 5 x 10⁶ komórek na 100 μl. Objętości należy odpowiednio dostosować. Aby kompensacja maszyny FACS mogła sortować ILC1, wymagane są jednokolorowe kontrole dla każdego z fluoroforów w mastermixie barwienia zewnątrzkomórkowego. W przypadku przeciwciał można zastosować kulki kompensacyjne, które zawierają dodatnią populację kulek wiążących przeciwciała i ujemną populację kulek niewiążących przeciwciał. Do kontroli pojedynczego koloru barwnika żywotności w ultrafiolecie (UV) można zastosować kulki kompensacyjne, które zawierają populacje reaktywne aminoworeaktywne (dla sygnału dodatniego) i niereaktywne (dla sygnału negatywnego). Nie zaleca się używania komórek myszy reporterowych RORγt^GFP do kontroli pojedynczego koloru barwnika żywotności utrwalanego promieniowaniem UV, ponieważ komórki te będą zawierać sygnał GFP⁺.
   1. Usunąć małą porcję ~10 μl z każdej próbki i umieścić ją w oddzielnej probówce przepływowej zawierającej 250 μl buforu FACS. Umieść rurkę na lodzie. Zostanie to wykorzystane do niezabarwionej kontroli.
   2. Dodać 1 ml PBS do pozostałej objętości w probówkach z próbkami. Wirować przy 300-400 x g przez 3-5 min.
   3. Przygotować 200 μl roztworu barwnika do utrwalania promieniami UV na próbkę. Rozcieńczyć barwnik o żywotności utrwalany promieniami UV (zawieszony w DMSO zgodnie z instrukcjami producenta) 1:500 w PBS (lub zgodnie z instrukcjami producenta).
   4. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić próbki w 200 μl roztworu barwnika utrwalanego promieniami UV. Wirować probówki i inkubować w ciemności w temperaturze 4 °C przez 10-15 minut.
   5. Dodać 2 ml buforu FACS do probówek w celu ugaszenia barwnika żywotności utrwalanego promieniowaniem UV, wirować przez 10 s i odwirowywać probówki przy 300-400 x g przez 3-5 minut w temperaturze 4 °C. Wyrzucić supernatant z probówek wirowych.
   6. Przygotować 200 μl roztworu blokowego Fc na próbkę (0,25 mg/ml bloku Fc w buforze FACS).
   7. Dodać 200 μl roztworu blokowego Fc do każdej z próbek z kroku 3.5.5, wirować przez 10 s i inkubować w ciemności w temperaturze 4 °C przez 10 minut.
   8. Dodać 500 μl buforu FACS do świeżej probówki przepływowej. Usunąć 2-5 μl podwielokrotności z każdej próbki i umieścić ją w probówce w celu kontroli fluorescencji minus jeden (FMO).
   9. Wirować probówkę FMO przez 10 s i równomiernie rozprowadzić (100 μl na probówkę) do probówek o świeżym przepływie oznaczonych dla każdej z kontrolek FMO (koktajl Lineage FMO, CD127 FMO, KLRG1 FMO, NKp46 FMO i NK1.1 FMO; patrz Tabela 3). Dodać wszystkie przeciwciała z wyjątkiem przeciwciała będącego przedmiotem zainteresowania do każdej probówki (jak opisano w Tabeli 3) i wirować przez 10 sekund. Odłożyć urządzenia sterujące FMO na bok w ciemności w temperaturze 4 °C.
   10. Odwirować próbki (nie kontrole FMO) przy 300–400 x g przez 3–5 minut w temperaturze 4 °C.
   11. Przygotować mastermix do barwienia zewnątrzkomórkowego (200 μl na próbkę) z końcowymi rozcieńczeniami przeciwciał, jak opisano w Tabeli 4. Dostosuj objętość barwienia do odpowiedniego stężenia komórek (do 5 x 10⁶ komórek na 100 μl) w zależności od liczby komórek z kroku 3.4.10.
   12. Dodać do próbek mastermix barwienia zewnątrzkomórkowego, wirować przez 10 s i odłożyć na bok w ciemności w temperaturze 4 °C.
   13. Przygotuj świeżą jednokolorową kontrolę dla każdego przeciwciała, które ma być użyte w strategii bramkowania (Rysunek 2). Wiruj kulki kompensujące przeciwciała przez 20 s, dodaj 1 kroplę kulek do rurki przepływowej, wybarwić 0,5 μl przeciwciała (jak pokazano w tabeli 2 lub zgodnie z instrukcjami producenta) i wirować przez 10 s.
   14. Przygotuj utrwalany promieniami UV barwnik do kontroli pojedynczego koloru za pomocą zestawu kulek kompensacyjnych reagujących z aminami. Wiruj kulki kompensacyjne aminy przez 20 s, dodaj 1 μl żywego/martwego barwnika UV (jak pokazano w tabeli 2 lub zgodnie z instrukcjami producenta) i wiruj przez 10 s.
   15. Inkubować próbki, FMO i jednobarwne próbki kontrolne w ciemności przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
   16. W tym czasie przygotuj probówki do zebrania posortowanych komórek. Dodaj 400-500 μl 10% FBS w Advanced DMEM/F12 do probówek o pojemności 1,5 ml dla każdej próbki.
   17. Po inkubacji dodaj 2 ml PBS2 do każdej z próbek, kontroli FMO i kontroli pojedynczego koloru.
   18. Odwirować próbki, kontrole FMO i kontrole jednobarwne przy 300-400 x g przez 3-5 minut w temperaturze 4 °C.
   19. Odrzucić sklarowany osad ze wszystkich odwirowanych probówek. Zawiesić próbki i kontrole FMO w 250 μl buforu FACS i wirować przez 10 s.
   20. Ponownie zawiesić pojedyncze elementy sterujące kolorem w 250 μl PBS2. Dodaj 1 kroplę niereaktywnych kulek aminowych tylko do utrwalanego promieniowaniem UV barwnika żywotności tylko do kontroli jednego koloru. Wiruj wszystkie elementy sterujące przez 10 s.
   21. Komórki są teraz gotowe do sortowania. Przechowuj próbki, kontrole FMO i kontrole pojedynczego koloru na lodzie w ciemności, gdy tylko jest to możliwe, aby poprawić żywotność komórek i zapobiec utracie sygnału w wyniku fotowybielania.

4. Współhodowla organoidów jelita cienkiego z wrodzonymi komórkami limfoidalnymi

UWAGA: Ta sekcja opisuje kokulturę posortowanego mysiego ILC1 jelita cienkiego (wyizolowanego zgodnie z protokołem w sekcji 3) z mysimi organoidami jelita cienkiego (opisanymi w sekcjach 1 i 2). Organoidy należy optymalnie stosować 1-2 dni po pasażu. Wspólna hodowla polega na zebraniu organoidów, dodaniu odpowiedniej liczby ILC1, odwirowaniu do organoidów w postaci granulek i ILC1 razem oraz ponownym zawieszeniu w TBEM. Wypełnij tę sekcję tak szybko, jak to możliwe po odizolowaniu ILC1. Wszystkie zabiegi powinny być przeprowadzane w aseptycznym środowisku przy użyciu sterylnych materiałów i odczynników.

1. Upewnij się, że TBEM z kroku 3.1.1 został rozmrożony.
2. Zbierz 1-2-dniowe organoidy zgodnie z opisem w krokach 2.3 i 2.4.
3. Zawiesić osad organoidowy w 1 ml zimnego, lodowatego Advanced DMEM/F12. Nie zginaj końcówki p1000, tak jak to ma miejsce podczas przechodzenia organoidów, ponieważ celem jest utrzymanie struktury organoidów dla kokultury. W razie potrzeby umieścić organoidy w oddzielnych probówkach o pojemności 1,5 ml pokrytych PBS2 na lodzie na krótki okres w celu rozprowadzenia między różnymi warunkami kohodowli.
   UWAGA: Przygotowanie organoidów należy rozpocząć dopiero wtedy, gdy próbki ILC są gotowe do wspólnej hodowli; Pracuj na lodzie i szybko, gdy tylko organoidy zostaną zebrane, aby zminimalizować śmierć komórek nabłonkowych.
4. Wstępnie pokryć jedną probówkę o pojemności 1,5 ml PBS2 na próbkę repliki ILC. Rozprowadź ~ 100-200 organoidów (około 1 dołek z 24-dołkowej płytki) do każdej probówki.
5. Wstępnie pokryj końcówkę p1000 PBS2 i użyj jej do oceny objętości ILC1 po oczyszczeniu FACS (250-300 μL + objętość posortowana). Określić stężenie ILC1 na ml na podstawie liczby komórek zarejestrowanych z sortowania i określić wymaganą objętość.
6. Używając tej samej końcówki p1000 pokrytej PBS2, dodaj nie mniej niż 500 ILC1 do powlekanej PBS2 probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej organoidy. Jeśli liczba ILC1 uzyskanych z sortowania jest mniejsza niż 500, należy dodać organoid bezpośrednio do probówki zawierającej oryginalny sort, aby zminimalizować utratę komórek w wyniku transferu.
7. Odwirowywać ILC1 i organoidy w temperaturze 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Jeśli to możliwe, unikaj wirówek stołowych o małej średnicy, ponieważ będą one gromadzić komórki wzdłuż krawędzi wnętrza probówki, zamiast tworzyć osad na końcu probówki. Ponieważ liczba komórek jest bardzo niska, konieczne jest zminimalizowanie utraty komórek podczas tych etapów.
8. Powoli i delikatnie usunąć jak najwięcej supernatantu, nie naruszając osadu (który może nie być widoczny gołym okiem, szczególnie w kontrolach bez organoidów tylko z ILC). Umieścić próbkę na lodzie.
9. Zawiesić zimny granulat w 30 μl na studzienkę TBEM. Trzymając probówkę na zimnej powierzchni (np. małym pudełku z lodem umieszczonym w kapturze do hodowli tkankowych), wymieszaj organoidy i ILC co najmniej 10-15 razy, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie. Rozcieraj często, ale delikatnie, aby uniknąć uszkodzenia organoidów i tworzenia się pęcherzyków.
10. Nałożyć 30 μl na studzienkę organoidów ILC w TBEM na wstępnie ogrzaną płytkę 24- lub 48-dołkową, aby utworzyć pojedynczą kopułę. Bezpośrednio umieścić płytkę w inkubatorze (37 °C i 5% CO_{2 )} na 10-20 min.
    UWAGA: Zdecydowanie zaleca się, aby do dalszej analizy skonfigurować kontrole tylko z ILC i tylko z organoidami. ILC1 występują rzadko, ale ^GFP-ILC2 można zastąpić kontrolą immunofluorescencyjną lub cytometrią przepływową FSC/SSC, jeśli jest to naukowo uzasadnione.
11. Dodać 550 μl (na basenik) kompletnej pożywki ILC1 (ENR + IL-2 + IL-7 + IL-15 + 2-merkaptoetanol; patrz tabela 1) z dowolnymi pożądanymi cytokinami doświadczalnymi lub przeciwciałami blokującymi i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przez 24 godziny.
12. Po 24 godzinach delikatnie wyjąć płytkę z inkubatora i pozostawić ją na 1 minutę w kapturze do hodowli tkankowej, aby upewnić się, że limfocyty są osadzone.
13. Usuń 200-250 μl pożywki i umieść ją w pustym dołku na 24-dołkowej płytce. Sprawdź ten supernatant za pomocą odwróconego mikroskopu, aby upewnić się, że żadne limfocyty nie zostały usunięte.
    1. Jeżeli supernatant jest klarowny, dodać 300 μl świeżej pożywki ILC1 do kokultury w pierwotnej studzience. Jeżeli limfocyty są obecne w supernatancie, odwirować przy 300-400 x g przez 3-5 minut w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić w 300 μl świeżej pożywki ILC1 i dodać ją do pozostałych 200-250 μl pożywki w pierwotnym dołku. Upewnij się, że wkładasz pożywkę co 1-2 dni lub gdy podłoże stanie się bladopomarańczowe/żółte.
       UWAGA: Nie pozwól, aby media odparowały na tyle, aby końcówka kopuły matrycy złamała powierzchnię nośnika. Zawsze upewnij się, że matryca jest całkowicie zanurzona. Nadmiernego parowania można uniknąć, stosując centralne studzienki w płytkach do hodowli tkankowych i dodając ~600 μL PBS do otaczających studzienek. Kokultury z dorosłymi ILC są stabilne przez 1-4 dni, po czym organoidy, które zostały wysiane bez większych zakłóceń, pękną i ponownie zasieją się jako nowe krypty. W przypadku analizy nabłonka zaleca się, aby kultury były analizowane w ciągu 1-4 dni od założenia kokultur.
    2. Przeprowadzić dalszą analizę za pomocą immunofluorescencji, cytometrii przepływowej lub oczyszczania FACS populacji docelowych do buforu lizy w celu analizy ekspresji genów za pomocą pojedynczej komórki lub masowego sekwencjonowania RNA lub RT-qPCR, zgodnie z opisem w reference⁸.

Po pomyślnym zakończeniu, świeżo odizolowane krypty powinny w ciągu 2-4 dni uformować pączkujące struktury krypt (Rysunek 1A). Zdrowe i wytrzymałe kultury organoidów powinny aktywnie rosnąć i mogą być pasażowane i rozwijane, jak wyszczególniono w protokole.

Ten protokół opisuje izolację ILC1 jelita cienkiego z mysiej transgenicznej linii reporterowej RORγtGFP, co pozwala na izolację żywego ILC1 przez FACS (Rysunek 2). Korzystając z opisanego tutaj protokołu, oczekiwany zakres liczby ILC1 wynosi 350-3,500 izolowanych komórek.

Po zasianiu organoidami, kokultury mogą być wizualizowane za pomocą immunocytochemii (Rysunek 3A-B). ILC i komórki nabłonkowe mogą być również analizowane za pomocą cytometrii przepływowej, jak pokazano na Rysunek 3C. ILC1 zwiększa nabłonek CD44, co charakteryzuje się cytometrią przepływową ( Figura 4A-B) i immunocytochemią ( Figura 4C). W szczególności ILC1 indukuje ekspresję wariantu splicingu CD44 v6 w organoidach, jak wykazano za pomocą RT-qPCR (Figura 4D).

Tabela 1: Kompozycje mediów i. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Kontrolki pojedynczego koloru. Kompozycja jednokolorowych kontroli w celu wyizolowania blaszki właściwej jelita cienkiego ILC1 przy użyciu strategii bramkowania zdefiniowanej w Rysunek 2. Szczegółowe informacje na temat zastosowanych przeciwciał można znaleźć w Tabeli Materiałów. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 3: Fluorescencja minus jeden (FMO) mastermixy. Skład mastermixów FMO dla koktajli Lineage FMO, CD127 FMO, KLRG1 FMO, NKp46 FMO i NK1.1 FMO. Mieszanki wzorcowe FMO zawierają wszystkie użyte przeciwciała, z wyjątkiem przeciwciała będącego przedmiotem zainteresowania i są używane do barwienia podwielokrotności próbki. Koktajl linii jest zdefiniowany jako CD19, CD3e, CD5, Ly-6G/Ly-6C. Szczegółowe informacje na temat zastosowanych przeciwciał można znaleźć w Tabeli Materiałów. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 4: Wzorcowy barwnik zewnątrzkomórkowy. Stężenia są dostosowane do barwienia do 5 x 106 komórek w 200 μl buforu FACS. Szczegółowe informacje na temat zastosowanych przeciwciał można znaleźć w Tabeli Materiałów. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Rysunek 1: Mysie organoidy jelita cienkiego. Reprezentatywny obraz (A) pomyślnie wygenerowanych organoidów jelita cienkiego 2-3 dni po pasażu i (B) nieudanej hodowli. Podziałka skali: 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Strategia bramkowania w celu wyizolowania ILC1 z blaszki właściwej jelita cienkiego transgenicznych myszy reporterowych RORγtGFP. Reprezentatywny wykres cytometrii przepływowej izolacji ILC1 z blaszki właściwej jelita cienkiego transgenicznych myszy reporterowych RORγtGFP za pomocą FACS. ILC1 są definiowane jako live, CD45+, Lin- (CD3, CD5, CD19, Ly6C), CD127+, KLRG1-, RORγt-, NKp46+ i NK1.1+. Przedstawiciel z N = >50 myszy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Współkultury organoidów i ILC1. Obrazy jasnego pola (A), obrazy mikroskopii konfokalnej (B) i wykresy FACS (C) organoidów jelita cienkiego (SIO) hodowanych samodzielnie (na górze) lub z ILC1 (na dole) (reprezentatywne dla eksperymentów z ILC1 od N = 3 myszy). (B) Barwienie CD45 ilustruje ILC1 i białko Zonula occludens 1 (ZO-1) oznaczają komórki nabłonkowe w organoidach. Podziałka skali: 50 μm. (C) Wcześniej bramkowane na pojedynczych, żywych komórkach. Cząsteczka adhezji nabłonkowej (EpCAM) oznacza komórki nabłonka jelitowego (IEC) w organoidach, a CD45 oznacza ILC1s. Rysunek zaczerpnięto z reference8. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: ILC1 w kokulturze z organoidami jelita cienkiego napędzają regulację w górę CD44 w komórkach nabłonka jelitowego. (A) Reprezentatywny wykres cytometryczny ekspresji CD44 w dodatnich komórkach nabłonka (EpCAM) (żywych, CD45-, EpCAM+) z organoidów jelita cienkiego (SIO) hodowanych samodzielnie (po lewej) lub z ILC1 przez 4 dni (po prawej). (B) Kwantyfikacja przepływu ekspresji CD44 w komórkach nabłonka jelitowego (IEC) (ILC1s od N = 5 myszy). (C) Reprezentatywny obraz mikroskopii konfokalnej lokalizacji CD44 w samym d4 SIO (po lewej) lub współhodowany z ILC1 (po prawej) (przedstawiciel N = 3 myszy). Podziałka: 50 μm. (D) RT-qPCR ze starterami specyficznymi dla eksonu dla wariantów splicingu CD44 v4 i v6 (N = 3). Ten rysunek jest zaadaptowany z reference8. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.