Eksplantat siatkówki dorosłej myszy jako model ex vivo do badania chorób nerwowo-naczyniowych siatkówki

Przedstawiono różne modele do badania chorób siatkówki, w tym zarówno modele in vivo, jak i in vitro. Wykorzystanie zwierząt w badaniach jest nadal przedmiotem ciągłych debat etycznych i translacyjnych¹. Modele zwierzęce z udziałem gryzoni, takich jak myszy lub szczury, są powszechnie używane w badaniach siatkówki^2,3,4. Pojawiły się jednak obawy kliniczne z powodu różnych funkcji fizjologicznych siatkówki u gryzoni w porównaniu z ludźmi, takich jak brak plamki żółtej lub różnice w widzeniu kolorów⁵. Wykorzystanie ludzkich oczu pośmiertnych do badań siatkówki również wiąże się z wieloma problemami, w tym między innymi z różnicami w pochodzeniu genetycznym oryginalnych próbek, historią medyczną dawców oraz poprzednim środowiskiem lub stylem życia dawców⁶. Co więcej, wykorzystanie modeli in vitro w badaniach siatkówki ma również pewne wady. Modele hodowli komórkowych wykorzystywane do badania chorób siatkówki obejmują wykorzystanie linii komórkowych pochodzenia ludzkiego, komórek pierwotnych lub komórek macierzystych⁷. Wykazano, że używane modele hodowli komórkowych mają problemy związane z zanieczyszczeniem, błędną identyfikacją lub odróżnicowaniem^8,9,10,11. W ostatnim czasie nastąpił znaczny postęp w technologii organoidów siatkówki. Budowa wysoce złożonych siatkówek in vitro ma jednak kilka ograniczeń. Na przykład organoidy siatkówki nie mają takich samych cech fizjologicznych i biochemicznych jak dojrzałe siatkówki in vivo. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, technologia organoidów siatkówki musi integrować więcej cech biologicznych i komórkowych, w tym komórki mięśni gładkich, układu naczyniowego i komórki odpornościowe, takie jak mikroglej^12,13,14,15.

Organotypowe eksplantaty siatkówki stały się niezawodnym narzędziem do badania chorób siatkówki, takich jak retinopatia cukrzycowa i choroby zwyrodnieniowe siatkówki^16,17,18,19. W porównaniu z innymi istniejącymi technikami, zastosowanie eksplantatów siatkówki wspiera zarówno hodowle komórek siatkówki in vitro, jak i obecne modele zwierzęce in vivo, dodając unikalną funkcję badania wzajemnych oddziaływań między różnymi komórkami siatkówki przy tych samych parametrach biochemicznych i niezależnie od zmiennych ogólnoustrojowych. Hodowle eksplantatów pozwalają na trzymanie różnych komórek siatkówki razem w tym samym środowisku, co pozwala na zachowanie interakcji międzykomórkowych siatkówki^20,21,22. Co więcej, poprzednie badanie wykazało, że eksplantaty siatkówki były w stanie zachować strukturę morfologiczną i funkcjonalność hodowanych komórek siatkówki²³. W związku z tym eksplantaty siatkówki mogą stanowić przyzwoitą platformę do badania możliwych celów terapeutycznych dla szerokiej gamy chorób siatkówki^24,25,26. Hodowle eksplantatów siatkówki zapewniają kontrolowaną technikę i są bardzo elastycznym substytutem istniejących mothodów, które pozwalają na liczne manipulacje farmakologiczne i mogą odkryć kilka mechanizmów molekularnych²⁷.

Ogólnym celem tego artykułu jest przedstawienie techniki eksplantacji siatkówki jako rozsądnego pośredniego systemu modelowego pomiędzy hodowlami komórkowymi in vitro a modelami zwierzęcymi in vivo. Ta technika może naśladować funkcje siatkówki w lepszy sposób niż komórki zdysocjowane. Ponieważ różne warstwy siatkówki pozostają nienaruszone, interakcje międzykomórkowe siatkówki mogą być oceniane w laboratorium w dobrze kontrolowanych warunkach biochemicznych i niezależnie od funkcjonowania układu naczyniowego²⁸.

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) na Uniwersytecie Oakland, Rochester, MI, USA i przestrzegały wytycznych ustalonych przez Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research.

1. Przygotowanie zwierząt

1. Trzymaj zwierzęta w pomieszczeniach o stałej temperaturze w środowisku o kontrolowanym oświetleniu. Ustawienia temperatury w pomieszczeniu dla zwierząt powinny być zgodne z wytycznymi zawartymi w "Przewodniku dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych". Zakres temperatur dla myszy wynosi od 18 °C do 26 °C. Utrzymuj poziom wilgotności pod kontrolą i ustaw go na około 42%.
2. Do tego eksperymentu użyto samców myszy C57BL/6J (szczegółowe informacje można znaleźć w Tabeli Materiałów), które są w wieku powyżej 12 tygodni (do tego protokołu użyto dorosłej myszy).
   UWAGA: W tym protokole do demonstracji użyto szczepu typu dzikiego, ponieważ nie miał on żadnych nieprawidłowości genetycznych wpływających na siatkówkę. Można jednak użyć innych szczepów, w tym szczepów zmodyfikowanych genetycznie, do hodowli eksplantatów siatkówki.
3. Zapewnij 12-godzinne cykle światła/ciemności poprzez sterowanie oświetleniem w pomieszczeniach dla zwierząt.
4. Sprawdzaj każde zwierzę pod kątem zdrowia oraz odpowiedniego spożycia pokarmu i wody dwa razy dziennie w tygodniu i raz dziennie w weekendy. Upewnij się, że zapewnisz im świeże jedzenie i czystą wodę.
5. Jeśli poziom jedzenia i wody jest niski w ciągu tygodnia, wypłucz butelkę z wodą i napełnij ją. W razie potrzeby dodawaj świeże jedzenie. Zmieniaj zabrudzone klatki codziennie lub w razie potrzeby ze względu na zdrowie zwierząt.
   UWAGA: Aby zbadać fotoreceptory i zmiany w siatkówce wywołane światłem, myszy przystosować do ciemności przez noc w specjalnym ciemnym pudełku znajdującym się w ciemnym pomieszczeniu w pomieszczeniu dla zwierząt.
6. Poddać eutanazji zwierzęta w ich klatce domowej przez przedawkowanie wziewne CO₂ przy użyciu sprężonego gazu CO₂ w butlach podłączonych do komory CO₂ . Przeprowadź potwierdzenie zgonu przy użyciu wtórnej metody eutanazji, takiej jak zwichnięcie szyjki macicy.
7. Po zakończeniu zabiegu należy potwierdzić śmierć zwierzęcia odpowiednią metodą, taką jak potwierdzenie zatrzymania akcji serca i oddechu lub obserwacja stałych i rozszerzonych źrenic zwierzęcia.

2. Przygotowanie tkanek

1. Po ueutanazji zwierzęcia oczyść obszar 70% etanolem. Następnie jedną ręką otwórz powieki, aby oko było widoczne. Drugą ręką wywieraj nacisk na górną i dolną część orbity za pomocą zakrzywionych kleszczy, aż kula ziemska wysunie się.
2. Aby wyłuszczyć oko, delikatnie zamknij kleszcze w tylnej części oka i podnieś w ciągłym ruchu. Za pomocą kleszczy przytrzymaj gałkę oczną od nerwu wzrokowego. Upewnij się, że używasz wysterylizowanych narzędzi do preparowania na wszystkich etapach i pracujesz w całkowicie aseptycznych warunkach.
3. Zanurz każdą gałkę oczną w probówce o pojemności 1,5 ml zawierającej 1 ml lodowatego HBSS z penicyliną-streptomycyną (10 000 U/ml). Przemyj gałkę oczną w HBSS dwa razy po 5 minut.
4. Przenieś gałkę oczną do probówki o pojemności 1,5-2 ml zawierającej kompletne pożywki (10% FBS, 2% B27, 1% N2, 1% L-glutaminy oraz 1% penicyliny i streptomycyny).

3. Sekcja tkanek

1. Dokładnie wypreparuj siatkówkę pod mikroskopem operacyjnym, jak pokazano kolejno w Rysunek 1.
   1. Wykonaj nacięcie obwodowe wokół rąbka, aby otworzyć gałkę oczną. Usuń rogówkę, wykonując okrężne wycięcie wzdłuż granicy rogówki i nacięcia (rąbka), a następnie usuń przedni segment, soczewkę i ciało szkliste, pozostawiając pustą muszlę oczną.
   2. Przytrzymując obszar głowy nerwu wzrokowego cienkimi kleszczami, delikatnie złudź zewnętrzną warstwę oka. Zachowaj szczególną ostrożność podczas usuwania powłoki zewnętrznej, aby nie uszkodzić siatkówki nerwowej i zapewnić, że siatkówka pozostanie całkowicie nienaruszona.
      UWAGA: Siatkówka musi być ostrożnie oderwana od nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) i należy wykonać pojedyncze nacięcie w głowie nerwu wzrokowego, aby odłączyć siatkówkę od nerwu wzrokowego. Upewnij się o tym wizualnie, identyfikując otwór pozostawiony przez nerw wzrokowy (głowę nerwu wzrokowego).
   3. Rozetnij siatkówkę promieniście na cztery równej wielkości części.
2. Postępuj zgodnie z poniższymi krokami, aby obchodzić się z małymi fragmentami siatkówki, aby zapewnić prawidłową orientację posiewu siatkówki.
   1. Za pomocą ostrza nożyczek preparacyjnych otwórz tuż pod częścią siatkówki (tabela materiałów).
   2. Powoli podnieś kawałek siatkówki końcówką otwartego ostrza nożyczek i delikatnie przenieś go na płytkę hodowlaną.
3. Przenieś eksplantaty pochodzące z izolowanej siatkówki oddzielnie na wkładki do hodowli komórkowych na 12-dołkowej płytce, z których każda zawiera 300 μl podłoża z eksplantatu siatkówki, stroną z komórkami zwojowymi siatkówki (neurosiatkówką) skierowaną do góry.
   UWAGA: Upewnij się, że podłoże jest podłożem DMEM z dodatkami N2 i B27. Dodać penicylinę-streptomycynę (10 000 U/ml) do pożywki (tabela materiałów). Siatkówka składa się z wielu warstw komórek neuronalnych połączonych ze sobą za pomocą synaps i wspieranych od zewnątrz przez pigmentowaną warstwę nabłonka barwnikowego siatkówki, która jest czarną warstwą, która została usunięta podczas sekcji.
4. Usuń wszelkie pozostałości pigmentowanego nabłonka, jednak te resztki mogą pomóc w identyfikacji właściwej orientacji eksplantatu. Upewnij się, że pigmentowana część jest skierowana w dół, a niepigmentowana część jest skierowana do góry.
5. Inkubować kulturę eksplantatów siatkówki w nawilżanych inkubatorach w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
6. Upewnij się, że powierzchnia siatkówki jest skierowana do góry. Jeśli część siatkówki jest odwrócona lub złożona, spróbuj delikatnie ustawić ją we właściwej orientacji.
   UWAGA: Zwróć szczególną uwagę na prawidłową orientację eksplantatu siatkówki na płytce hodowlanej. Unikaj odwracania lub składania eksplantatu na płytce hodowlanej, ponieważ spowoduje to niepowodzenie prawidłowego wzrostu komórek siatkówki w hodowli.

4. Hodowla eksplantatów siatkówki

1. Utrzymywać kultury eksplantatów siatkówki (przygotowane w krokach 3.2-3.3) w nawilżanych inkubatorach w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
2. Zmieniaj połowę pożywki z każdej studzienki co drugi dzień przez 2 tygodnie. W tym celu należy ostrożnie odpipetować 150 μl z dołka. Następnie dodaj 150 μl świeżej pożywki z powrotem do studzienki. Unikaj odwracania eksplantatu podczas zmiany pożywki.
3. Sprawdź dokładnie eksplant pod mikroskopem przed ponownym włożeniem płytki hodowlanej do inkubatora. Zbadaj integralność komórek i architekturę siatkówki pod mikroskopem jasnego pola. Upewnij się, że eksplant jest nadal prawidłowo zorientowany. Użyj zarówno soczewek obiektywowych 4x, jak i 20x, aby zbadać explant.
   UWAGA: Unikaj całkowitego zanurzenia eksplantatu w pożywce.

5. Immunohistochemia

1. Po 2 tygodniach napraw eksplant siatkówki, usuwając pożywkę. W tym celu należy najpierw przemyć raz 200 μl 1x PBS, a następnie dodać 300 μl 4% paraformaldehydu w 0,1 M PBS, pH 7,4, do studzienki zawierającej eksplant i pozostawić ją na noc.
   UWAGA: Ten krok można wykonać bez wyjmowania wkładek hodowlanych z płytki. Eksplantaty można również przenieść do stożkowej probówki o pojemności 500 μl, a mycie i utrwalanie można wykonać wewnątrz probówki.
2. Przenieś eksplant do stożkowej probówki o pojemności 500 μl zawierającej 300 μl 1x PBS-2,5% Triton X do mycia.
3. Umyj zamocowane eksplantaty w probówce trzy razy przez 5 minut każdy, używając średniej prędkości na wytrząsarce (25 obr./min).
4. Zablokuj oczekiwane reakcje niespecyficzne poprzez inkubację eksplantatu z 300 μl 1x buforu blokującego zawierającego 0,02% tiomersalu przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej przed inkubacją przeciwciał.
5. Inkubować utrwalone eksplantaty z pierwszorzędowymi przeciwciałami przez noc w temperaturze 4 °C przy użyciu średniej prędkości na wytrząsarce.
   UWAGA: Wykryj komórki śródbłonka siatkówki w utrwalonym eksplantacie poprzez barwienie przeciwciałem GSL I, BSL I (lektyna) (7:1,000). Wykryj komórki glejowe w eksplantatach siatkówki, barwiąc przeciwciałem przeciwko fibrylarnemu białku fibrylarnemu królika (GFAP) (1:250). Wykryj neurony siatkówki, barwiąc eksplant przeciwciałem NeuN królika (1:250)^29,30. Inkubuj s{Tual-Chalot, 2013 #117}{Tual-Chalot, 2013 #116}{Tual-Chalot, 2013 #116}niektóre eksplantaty z lektyną, kombinacją NeuN, a inne inkubuj z lektyną, kombinacją GFAP.
6. Następnego dnia należy usunąć przeciwciało pierwotne z probówek przez aspirację pipetą. Umyj eksplantaty 1x PBS-2,5% Triton X trzy razy przez 5 minut każdy, używając średniej prędkości na shakerze.
7. Dodaj przeciwciała drugorzędowe: kozi anty-królik IgG (1:500) (drugorzędowe dla GFAP i NeuN) i Texas Red (7:1,000) (dla lektyny). Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej przy użyciu średniej prędkości na wytrząsarce.
   UWAGA: Przeciwciała drugorzędowe są wrażliwe na światło, więc przykryj probówkę folią aluminiową.
8. Usunąć przeciwciała drugorzędowe przez aspirację, a następnie przemyć trzy razy przez 5 minut każdy 1x PBS-2,5% Triton X.
9. Przenieść eksplant z probówki do szkiełka podstawowego za pomocą pipety do przenoszenia. Usuń nadmiar płynu ze szkiełka, a następnie dodaj jedną kroplę nośnika montażowego z DAPI do szkiełka.
10. Przykryj chusteczkę szkiełkiem nakrywkowym. Nie dopuścić do przedostania się pęcherzyków powietrza między szkiełko nakrywkowe a chusteczkę.
11. Weź zabarwione szkiełka do mikroskopu fluorescencyjnego i zacznij robić zdjęcia. Ważne jest, aby przykryć zabarwione szkiełka za pomocą pudełka na szkiełka, ponieważ barwienie fluorescencyjne jest wrażliwe na światło.

Przetrwanie neuronalnych i naczyniowych komórek siatkówki eksplantatu siatkówki w pożywkach hodowlanych ex vivo przez dłuższy czas
Hodując eksplant siatkówki przy użyciu naszego protokołu, udało nam się utrzymać różne komórki siatkówki, które były zdolne do życia przez okres do 2 tygodni. Aby zweryfikować obecność różnych komórek siatkówki, przeprowadzono barwienie immunofluorescencyjne eksplantatu siatkówki za pomocą markera komórek neuronalnych (NeuN), markera komórek glejowych (GFAP) i markera naczyniowego (izollektyna-B4) (Ryc. 2). Barwienie wykazało dobrze zorganizowane i dobrze rozwinięte neurony siatkówki i komórki glejowe. Dodatkowo naczynia krwionośne siatkówki były strukturalnie nienaruszone, na co wskazuje barwienie izollektyną-B4. Integralność morfologiczna eksplantatu siatkówki, jak wykazano za pomocą barwienia immunologicznego, wskazała, że hodowla eksplantatów siatkówki była skuteczna w utrzymaniu żywotnych komórek siatkówki, które można eksperymentalnie wykorzystać jako model. Różne warunki eksperymentalne, które mają być badane przy użyciu eksplantatu, można ocenić i przeanalizować za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego dla wielu markerów komórkowych za pomocą oprogramowania ImageJ. Barwienie immunologiczne umożliwia pomiar poziomów immunoreaktywności każdego markera komórkowego oraz liczby określonych komórek, takich jak liczba komórek zwojowych siatkówki lub fotoreceptorów, wśród różnych grup eksperymentalnych.

Znaczenie prawidłowej orientacji eksplantatu siatkówki na płytce hodowlanej dla wyników eksperymentu
Prawidłową orientację eksplantatu siatkówki na płytce hodowlanej uzyskuje się poprzez inkubację neurosiatkówki skierowanej do góry. Z drugiej strony, niewydolność eksplantatu siatkówki może wynikać z odwrócenia lub fałdowania tkanki siatkówki, co powoduje, że neurosiatkówka jest skierowana w dół. Barwienie immunofluorescencyjne hodowanego eksplantatu siatkówki po 2 tygodniach przy użyciu różnych markerów siatkówki, jak w poprzednim eksperymencie (NeuN, GFAP i izollektyna-B4) wykazało, że niepowodzenie prawidłowej orientacji eksplantatu powoduje niepowodzenie prawidłowego rozwoju elementu nerwowo-naczyniowego (Ryc. 3).

Rysunek 1: Etapy preparowania gałki ocznej w celu stworzenia eksplantatu siatkówki. (a) Wyłuszczona gałka oczna jest zanurzana w pożywce natychmiast po usunięciu ze zwierzęcia. (b) Wzdłuż rąbka wykonuje się nacięcie obwodowe w celu otwarcia gałki ocznej. (c) Rogówkę usuwa się poprzez rozcięcie wzdłuż nacięcia rąbka. (d) Trzymając nerw wzrokowy cienkimi kleszczami, delikatnie złuszcza się zewnętrzną powłokę oka. (e) Soczewka, ciało szkliste i ciało rzęskowe są usuwane. (F) Pozostaje tylko siatkówka nerwowa. (g) W siatkówce wykonuje się cztery promieniste nacięcia, aby ułatwić jej przecięcie w następnym kroku. h) Siatkówkę można pociąć na dwie lub cztery części, a następnie przenieść na płytkę do hodowli komórkowej zawierającą wkładkę i pożywkę. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Udana hodowla eksplantatów siatkówki z zachowaną strukturą siatkówki. Barwienie immunofluorescencyjne eksplantatów siatkówki, które pozostawały w hodowli przez 2 tygodnie. Eksplantaty utrwalono i wybarwiono (a) NeuN dla neuronów siatkówki (zielony) i izollektyną-B4 dla naczyń krwionośnych (czerwony) oraz (b) GFAP dla komórek glejowych (zielony) i izollektyną-B4 dla naczyń krwionośnych (czerwony). Zabarwienie wykazało dobrze rozwinięte komórki siatkówki i naczynia siatkówki. Podziałka skali = 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Nieudana hodowla eksplantatów siatkówki z uszkodzonymi, słabo rozwiniętymi komórkami siatkówki. Barwienie immunofluorescencyjne eksplantatów siatkówki, które pozostawały w hodowli przez dwa tygodnie. Eksplantaty utrwalono i wybarwiono GFAP dla komórek glejowych (zielony) i izololektyną-B4 dla naczyń krwionośnych (czerwony). Obrazy pokazują wadliwe barwienie oraz słabo rozwinięte komórki siatkówki i naczynia siatkówki. Eksplant siatkówki był złożony i nie był prawidłowo zorientowany na płytce hodowlanej. Należy zwrócić dużą uwagę na zapewnienie prawidłowej orientacji eksplantatu z siatkówką skierowaną do góry. Nieustawienie eksplantatu siatkówki we właściwej orientacji będzie skutkowało nieprawidłowym rozwojem eksplantatu. Podziałka = 100 μm Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.