Długotrwała hodowla i monitorowanie izolowanych Caenorhabditis elegans na pożywkach stałych w urządzeniach wielodołkowych

Caenorhabditis elegans są powszechnie używane w badaniach nad starzeniem się ze względu na ich krótki czas generacji (około 3 dni), krótką żywotność (około 3 tygodnie), łatwość uprawy w laboratorium, wysoki stopień ewolucyjnego zachowania procesów molekularnych i szlaków u ssaków oraz szeroką dostępność technik manipulacji genetycznej. W kontekście badań nad starzeniem się, C. elegans pozwala na szybkie generowanie danych dotyczących długowieczności i starzejących się populacji w celu analizy fenotypów późnego wieku u żywych zwierząt. Typowe podejście do prowadzenia badań nad starzeniem się robaków polega na ręcznym pomiarze długości życia populacji robaków utrzymywanych w grupach od 20 do 70 zwierząt na stałych pożywkach hodowlanych nicieni agarowych (NGM) na 6 cm płytkach Petriego¹. Wykorzystanie populacji zsynchronizowanych z wiekiem pozwala na pomiar długości życia lub fenotypów przekrojowych u poszczególnych zwierząt w całej populacji, ale metoda ta wyklucza monitorowanie cech poszczególnych zwierząt w czasie. Takie podejście jest również pracochłonne, co ogranicza wielkość populacji, którą można przebadać.

Istnieje ograniczona liczba metod hodowli, które pozwalają na długotrwałe monitorowanie poszczególnych C. elegans przez cały okres ich życia, a każda z nich ma odrębny zestaw zalet i wad. Urządzenia mikroprzepływowe, w tym między innymi WormFarm², NemaLife³ oraz chip "behavior" chip⁴, między innymi5^,6,7, umożliwiają monitorowanie poszczególnych zwierząt w czasie. Hodowla robaków w płynnej kulturze przy użyciu płytek wielodołkowych podobnie umożliwia monitorowanie pojedynczych zwierząt lub małych populacji C. elegans w czasie^8,9. Środowisko ciekłe reprezentuje odrębny kontekst środowiskowy od powszechnego środowiska hodowlanego na pożywkach stałych na płytkach Petriego, które może zmieniać aspekty fizjologii zwierząt istotne dla starzenia się, w tym zawartość tłuszczu i ekspresję genów reakcji na stres^10,11. Możliwość bezpośredniego porównania tych badań z większością danych zebranych na temat starzenia się C. elegans jest ograniczona przez różnice w potencjalnie ważnych zmiennych środowiskowych. Worm Corral¹² to jedno z podejść opracowanych do trzymania pojedynczych zwierząt w środowisku, które bardziej odwzorowuje typową kulturę na podłożach stałych. Worm Corral zawiera szczelną komorę dla każdego zwierzęcia na szkiełku mikroskopowym za pomocą hydrożelu, co pozwala na wzdłużne monitorowanie izolowanych zwierząt. Metoda ta wykorzystuje standardowe obrazowanie w jasnym polu do rejestrowania danych morfologicznych, takich jak wielkość ciała i aktywność. Jednak zwierzęta są umieszczane w środowisku hydrożelowym jako zarodki, gdzie pozostają nienaruszone przez całe życie. Wymaga to wykorzystania warunkowo sterylnych zmutowanych lub transgenicznych teł genetycznych, co ogranicza zarówno zdolność do genetycznych badań przesiewowych, ponieważ każda nowa mutacja lub transgen musi zostać skrzyżowana z tłem o warunkowej bezpłodności, jak i zdolność do badań przesiewowych leków, ponieważ leczenie może być zastosowane tylko raz na zwierzętach jako zarodkach.

Alternatywna metoda opracowana przez laboratorium Fang-Yen pozwala na hodowlę robaków na stałym podłożu w indywidualnych studzienkach mikrofabrykowanego urządzenia z polidimetylosiloksanu (PDMS) o nazwie WorMotel^13,14. Każde urządzenie jest umieszczone w tacce jednodołkowej (tj. o takich samych wymiarach jak płytka 96-dołkowa) i ma 240 studzienek oddzielonych fosą wypełnioną roztworem awersyjnym, aby zapobiec przemieszczaniu się robaków między studzienkami. Każda studnia może pomieścić pojedynczego robaka przez cały okres jego życia. Urządzenie jest otoczone pochłaniającymi wodę granulkami żelu poliakrylamidowego (określanymi jako "kryształki wody"), a taca jest uszczelniona folią laboratoryjną Parafilm, aby utrzymać wilgotność i zminimalizować wysychanie mediów. System ten pozwala na gromadzenie danych dotyczących zdrowia i długości życia poszczególnych zwierząt, podczas gdy użycie pożywek stałych lepiej podsumowuje środowisko doświadczane przez zwierzęta w zdecydowanej większości opublikowanych badań nad długością życia C. elegans, umożliwiając w ten sposób bardziej bezpośrednie porównania. Ostatnio podobna technika została opracowana przy użyciu mikrotac polistyrenowych, które pierwotnie były używane do testów mikrocytotoksyczności¹⁵ zamiast urządzenia PDMS¹⁶. Metoda mikrotacki pozwala na zbieranie zindywidualizowanych danych dla robaków hodowanych na pożywkach stałych i ma zwiększoną zdolność do zatrzymywania robaków w warunkach, które zwykle powodują ucieczkę (np. stresory lub ograniczenia dietetyczne), przy czym kompromisem jest to, że każda mikrotaca może zawierać tylko 96 zwierząt¹⁶, podczas gdy zastosowane tutaj urządzenie wielodołkowe może zawierać do 240 zwierząt.

Prezentowany tutaj jest szczegółowy protokół przygotowania urządzeń wielodołkowych, który jest zoptymalizowany pod kątem spójności między płytkami i przygotowania wielu urządzeń równolegle. Ten protokół został zaadaptowany z oryginalnego protokołu z laboratorium Fang-Yen¹³. W szczególności znajdują się tam opisy technik minimalizacji zanieczyszczenia, optymalizacji spójnego suszenia zarówno pożywki stałej, jak i bakteryjnego źródła pożywienia oraz dostarczania RNAi i leków. System ten może być używany do śledzenia indywidualnej długości zdrowia, długości życia i innych fenotypów, takich jak rozmiar i kształt ciała. Te wielodołkowe urządzenia są kompatybilne z istniejącymi wysokowydajnymi systemami pomiaru żywotności, które mogą wyeliminować znaczną część pracy ręcznej związanej z tradycyjnymi eksperymentami dotyczącymi długości życia i zapewnić możliwość zautomatyzowanego, bezpośredniego pomiaru długowieczności i śledzenia stanu zdrowia u poszczególnych C. elegans na dużą skalę.

1. Przygotowanie roztworów podstawowych i pożywek

UWAGA: Zanim zaczniesz przygotowywać urządzenia wielodołkowe, przygotuj następujące roztwory podstawowe i podłoża.

1. Roztwory podstawowe dla pożywek hodowlanych nicieni (NGM) i niskotopliwego NGM (lmNGM):
   1. Przygotować 1 M K₂HPO₄: Dodać 174,18 g K₂HPO4 do butelki o pojemności 1 l i napełnić ją do 1 l sterylną wodą dejonizowaną. Autoklaw (121 °C, 15 psig) przez 30 minut i przechowywać w temperaturze pokojowej (RT).
   2. Przygotować 1 M KP_i, pH 6,0: Do butelki o pojemności 1 l dodać 136,09 g KH₂HPO₄ i napełnić do 1 l sterylną wodą dejonizowaną. Miareczkować za pomocą 1 M K₂HPO₄ do pH 6,0. Autoklaw (121 °C, 15 psig) przez 30 minut i przechowywać w temperaturze pokojowej.
   3. Przygotuj 1 M CaCl₂: Dodaj 73,5 g CaCl₂ do butelki o pojemności 500 ml i napełnij ją do 500 ml sterylną wodą dejonizowaną. Autoklaw (121 °C, 15 psig) przez 30 minut i przechowywać w temperaturze pokojowej.
   4. Przygotuj 1 M MgSO₄: Dodaj 123,25 g_MgSO4 do butelki o pojemności 500 ml i napełnij ją do 500 ml sterylną wodą dejonizowaną. Autoklaw (121 °C, 15 psig) przez 30 minut i przechowywać w temperaturze pokojowej.
   5. Przygotuj 5 mg/ml cholesterolu: Połącz 2,5 g cholesterolu, 275 ml 100% etanolu i 25 ml sterylnej wody dejonizowanej w bursztynowej butelce o pojemności 500 ml. Sklep w RT.
   6. Przygotuj 50 ml floksurydyny: Połącz 0,1231 g floksurydyny i 10 ml sterylnej wody dejonizowanej w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Wysterylizuj go filtrem 0,22 μm za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml. Podamy po 1 ml do 10 probówek do mikrowirówek i przechowujemy w temperaturze -20 °C.
   7. Przygotuj 50 mg/ml karbenicyliny: W stożkowej probówce o pojemności 15 ml połącz 500 mg karbenicyliny z 10 ml sterylnej wody dejonizowanej. Wysterylizuj go filtrem 0,22 μm za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml. Podamy po 1 ml do 10 probówek do mikrowirówek i przechowujemy w temperaturze -20 °C.
   8. Przygotuj 1 mM ß-D-1-tiogalaktopiranozydu izopropylu (IPTG): W stożkowej probówce o pojemności 15 ml połącz 2,38 g IPTG z 10 ml sterylnej wody dejonizowanej. Wysterylizuj go filtrem 0,22 μm za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml. Podamy po 1 ml do 10 probówek do mikrowirówek i przechowujemy w temperaturze -20 °C.
   9. Przygotuj 100 mg/ml ampicyliny: W stożkowej probówce o pojemności 15 ml połącz 1 g ampicyliny z 10 ml sterylnej wody dejonizowanej. Wysterylizuj go filtrem 0,22 μm za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml. Podamy po 1 ml do 10 probówek do mikrowirówek i przechowujemy w temperaturze -20 °C.
2. Przygotowanie pożywki hodowlanej nicieni (NGM) do ogólnego utrzymania C. elegans
   1. Aby przygotować 50 płytek, w kolbie o pojemności 1 litra wymieszaj 10 g agaru Bacto, 1,5 g NaCl, 1,25 g peptonu Bacto i 486 ml ultraczystej wody. Autoklaw w cyklu ciekłym (121 °C, 15 psig) przez co najmniej 30 minut w celu sterylizacji.
   2. Po autoklawie, po schłodzeniu pożywki do 55 °C, dodać 12,5 ml 1 M KP_i, 500 μl 1 M_MgSO4, 500 μL 1 M CaCl₂ i 500 μL 5 mg/ml cholesterolu.
   3. Stosując sterylną technikę, wlej 10 ml pożywki do każdej płytki o średnicy 60 mm (łącznie 50). Po zestaleniu się podłoża (co najmniej 30 minut po nalaniu należy odpipetować 300 μl kultury bakteryjnej (przygotowanej zgodnie z krokiem 4 i krokiem 10), która została wyhodowana przez noc na środku płytki. Pozostaw płytkę na ławce, pozwalając kulturze bakteryjnej wyschnąć i zgrubić (1-2 dni). Przechowywać płytki w temperaturze 4 °C.
3. Przygotować premiks niskotopliwych pożywek wzrostowych nicieni (lmNGM):
   1. W kolbie o pojemności 500 ml wymieszaj 4 g niskotopliwej agarozy, 0,5 g peptonu Bacto i 195 ml ultraczystej wody. Autoklaw w cyklu ciekłym (121 °C, 15 psig) przez co najmniej 30 minut w celu sterylizacji.
   2. Gdy pożywka jest jeszcze stopiona, rozprowadzić 10 ml porcji do sterylnych szklanych probówek. Zamknij każdą probówkę parafilmem, a następnie nasadką probówki, aby zachować wstępną mieszaninę lmNGM i zapobiec wysuszeniu. Pożywka zestala się i może być przechowywana przez ~ 2 tygodnie w temperaturze pokojowej przed użyciem.
4. Przygotuj 142,8 mM NaCl: W butelce o pojemności 250 ml wymieszaj 0,8345 g NaCl i 100 ml sterylnej wody dejonizowanej. Autoklaw (121 °C, 15 psig) przez 30 minut i przechowywać w temperaturze pokojowej.
5. Przygotuj roztwór detergentu: W stożkowej probówce o pojemności 15 ml wymieszaj 3 ml Tween 20 i 7 ml sterylnej wody dejonizowanej. Dokładnie wymieszać, wysterylizować filtrem 0,22 μm za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml i przechowywać w temperaturze pokojowej.
6. Przygotuj roztwór siarczanu miedzi: W sterylnej butelce o pojemności 50 ml wymieszaj 20 ml sterylnej wody dejonizowanej, 0,5 g_CuSO4 i 100 μl roztworu detergentu (przygotowanego w kroku 1.5). Mieszaj, aż CuSO₄ się rozpuści. Sklep w RT.
7. Przygotuj absorbujące wodę kryształy poliakrylamidu: W butelce do wyciskania nadającej się do autoklawu wymieszaj 150 ml wody dejonizowanej i 1 g superchłonnego polimeru typu S. Delikatnie wymieszaj, kilkakrotnie odwracając butelkę. Autoklaw w cyklu ciekłym (121 °C, 15 psig) przez co najmniej 20 minut i przechowywać w temperaturze pokojowej.
8. Przygotuj bulion lizogeniczny (LB): W zlewce o pojemności 1 l lub większej wymieszaj 20 g proszku LB z 1 litrem wody dejonizowanej. Porcjować do dwóch zlewek o pojemności 500 ml. Autoklaw (121 °C, 15 psig) przez 30 minut i przechowywać w temperaturze pokojowej
9. Przygotuj płytki agarowe z bulionu lizogenicznego (LB):
   1. W kolbie o pojemności 1 l wymieszaj 10 g proszku LB, 7,5 g agaru Bacto i 500 ml wody dejonizowanej. Autoklaw w cyklu cieczowym (121 °C, 15 psig) przez 30 min.
   2. W razie potrzeby dodać opcjonalne antybiotyki (po autoklawie, po schłodzeniu podłoża do 55 °C): 500 μl ampicyliny 100 mg/mL. Stosując sterylną technikę, wlać 20 ml pożywki do każdej płytki o średnicy 100 mm (łącznie 25) i przechowywać w temperaturze 4 °C.

2. Drukowanie formy 3D urządzenia wielodołkowego

UWAGA: Każde urządzenie jest formowane z PDMS przy użyciu niestandardowej formy wydrukowanej w 3D. Pojedyncza forma może wyprodukować tyle urządzeń, ile potrzeba; jednak w przypadku próby przygotowania wielu urządzeń w tym samym czasie, wymagana jest jedna forma wydrukowana w 3D, aby każde urządzenie zostało wykonane równolegle.

1. Pobierz plik STL (patrz Plik uzupełniający 1).
2. Wydrukuj formę za pomocą drukarki 3D o wysokiej rozdzielczości.
   UWAGA: Rozdzielczość drukarki musi być wystarczająco wysoka, aby umożliwić stałą objętość studni i fosy. Sugerowana rozdzielczość drukarki to minimalna rozdzielczość XY ~40 μm i rozdzielczość warstwy 28 μm. Materiał używany przez drukarkę 3D jest równie ważny, ponieważ wiele rodzajów materiałów uniemożliwi utwardzenie PDMS. Z doświadczenia wynika, że formy produkowane przez drukarki PolyJet o wysokiej rozdzielczości (rozdzielczość: oś X = 600 dpi, oś Y = 600 dpi, oś Z = 1 600 dpi) przy użyciu materiału drukarskiego Vero Black działają konsekwentnie. Druk 3D form użytych w tym badaniu został zlecony na zewnątrz (szczegóły dotyczące druku można znaleźć w Tabeli Materiałów).

3. Przygotowanie urządzenia wielostudziennego

UWAGA: Ta sekcja opisuje, w jaki sposób wydrukowana w 3D forma jest używana do stworzenia urządzenia wielodołkowego PDMS.

1. Ustaw piec do utwardzania na 55 °C, aby umożliwić wstępne podgrzanie.
2. Określ liczbę urządzeń, które mają być przygotowane w jednej partii. Dla każdego urządzenia wymieszaj 60 g bazy PDMS i 6 g utwardzacza w dużej, jednorazowej łódce wagowej (lub podobnym jednorazowym pojemniku) za pomocą jednorazowej szpatułki.
3. Umieść mieszaninę PDMS w komorze próżniowej na 30 minut przy -0,08 MPa w celu usunięcia pęcherzyków.
4. Wlej mieszaninę PDMS do każdej formy wydrukowanej w 3D. Całkowicie napełnij formę, a mieszanina PDMS wystaje nieco ponad górną część formy. Zachowaj nadmiar mieszanki PDMS, aby ponownie napełnić formę w przypadku rozlania.
5. Umieść napełnioną formę i dodatkową mieszaninę PDMS w komorze próżniowej na 25 minut przy -0,08 MPa, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powstałe podczas procesu nalewania.
6. Wyjmij wypełnioną formę z komory próżniowej i przebij pozostałe bąbelki jednorazową szpatułką. Użyj szpatułki, aby zetrzeć wszelkie widoczne zanieczyszczenia lub pozostałe pęcherzyki do krawędzi formy z dala od studzienek. Wszelkie pozostałe zanieczyszczenia lub pęcherzyki mogą potencjalnie zakłócać obrazowanie w późniejszych krokach.
7. Upewnij się, że forma jest całkowicie wypełniona mieszaniną PDMS; często zdarza się, że niewielka porcja mieszaniny wylewa się w komorze próżniowej lub podczas przenoszenia. Uzupełnij przy użyciu dodatkowej mieszaniny PDMS, która została odgazowana w kroku 3.5. Nie powinno to tworzyć pęcherzyków, ale jeśli takie powstaną, można je delikatnie przetrzeć szpatułką na bok formy.
8. Umieść płaski arkusz akrylowy na wierzchu formy wypełnionej PDMS, najpierw umieszczając jedną krawędź i powoli opuszczając drugą, aż akryl osadzi się płasko na wierzchu formy, wypierając wszelką mieszaninę PDMS wystającą ponad krawędź. Jeśli podczas układania arkusza akrylowego utworzą się bąbelki, powoli usuń akryl, w razie potrzeby napełnij formę mieszanką PDMS i ponownie umieść akryl. Arkusz akrylowy utworzy płaskie dno dla formowanego urządzenia i zapewni, że wszystkie studzienki znajdują się na tym samym poziomie w stosunku do podstawy.
9. Umieść ciężarek o wadze 2.5 funta na wierzchu akrylu. Wiele form, z których każda ma oddzielny arkusz akrylowy, można układać w stosy. Umieść obciążone foremki w piekarniku i pozwól im utwardzić się w temperaturze 55 °C przez noc.
10. Następnego dnia wyjmij ciężarki i foremki z piekarnika.
11. Ostrożnie wsuń żyletkę między akryl a utwardzony PDMS, aby zerwać uszczelkę. Ostrożnie usuń akryl z górnej części formy. W tym momencie PDMS stwardnieje, a usunięcie akrylu może wymagać pewnej siły.
12. Za pomocą brzytwy lub metalowej szpatułki ostrożnie poluzuj boki utwardzonego PDMS z formy. Na tym etapie łatwo jest rozerwać PDMS; pracuj powoli i delikatnie wokół krawędzi, aby usunąć urządzenie PDMS w stanie nienaruszonym.
    UWAGA: Świeżo wydrukowane formy są szczególnie lepkie przy pierwszych trzech użyciach, a PDMS często rozrywa się podczas próby wyjęcia urządzenia. Przy większej liczbie zastosowań łatwiej jest usunąć utwardzony PDMS z formy.
13. Owiń urządzenie folią aluminiową i uszczelnij taśmą autoklawową. Autoklaw w suchym cyklu przez co najmniej 15 minut w temperaturze 121 °C, 15 psig w celu sterylizacji. Po sterylizacji w autoklawie przechowuj owinięte urządzenia na stole i używaj ich w razie potrzeby.

4. Smugi bakterii

UWAGA: Rozpocznij przygotowanie bakterii, które będą używane jako źródło pożywienia dla robaków, gdy są one na urządzeniu wielostudziennym. Najczęstszą bakterią jest Escherichia coli szczep OP50 (lub szczep HT115 do eksperymentów RNAi). Wykonaj ten krok co najmniej 2 dni przed dodaniem robaków do urządzenia.

1. Rozłóż bakterie na świeżym talerzu LB. Upewnij się, że wszelkie selektywne dodatki specyficzne dla szczepu (np. ampicylina w celu wybrania plazmidu nadającego bakteriom odporność na ampicylinę) są zawarte w płytkach LB.
2. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez noc (~18 godzin), aby umożliwić wzrost kolonii.

5. Przygotowanie urządzenia wielostudzienkowego do ładowania mediów

UWAGA: Powierzchnia silikonowego materiału PDMS, z którego zbudowane jest urządzenie, jest hydrofobowa, co zapobiega napełnianiu studni o małej objętości i fos awersyjnych odpowiednio NGM i siarczanem miedzi. Aby obejść ten problem, stosuje się plazmę tlenową do tymczasowej modyfikacji właściwości powierzchni urządzenia na hydrofilowe, co pozwala na napełnienie studni i fosy w ograniczonym oknie czasowym (do ~2 godzin). W tej sekcji przedstawiono kroki, które należy wykonać, aby zakończyć proces czyszczenia plazmowego. Wykonaj ten krok co najmniej 1 dzień przed wykryciem w urządzeniu studzienek z bakteriami, ponieważ utrzymujące się efekty czyszczenia plazmowego mogą zakłócać plamienie. Biorąc pod uwagę czas realizacji sekcji 5-7, praktyczny limit dla tych kroków na technika wynosi trzy urządzenia równolegle.

1. Rozgrzej inkubator do suchej kąpieli perełkowej do temperatury 90 °C, przygotowując się do sekcji 6.
2. Ponieważ całkowita objętość pożywki potrzebna do napełnienia studzienek urządzenia wielodołkowego jest mała w porównaniu z płytkami Petriego, należy przygotować dużą partię NGM i podzielić ją na probówki (patrz krok 1.3).
   UWAGA: Można to zrobić z wyprzedzeniem, ponieważ probówki z mediami można przechowywać na stole przez ~2 tygodnie. Jeżeli pożywka została przygotowana i podzielona na porcje do probówek, przejść do kroku 5.3.
3. Mając na sobie rękawice, rozpakuj autoklawowane urządzenie wielodołkowe; unikaj dotykania któregokolwiek z dołków. Wytnij małe wcięcie w prawym górnym rogu urządzenia, aby wskazać, ile razy było używane/ponownie używane (patrz rozdział 15 poniżej, aby uzyskać instrukcje i zalecenia dotyczące czyszczenia i ponownego użycia każdego urządzenia).
4. Umieść do trzech nieopakowanych urządzeń w czyszczalni plazmowej studzienkami skierowanymi do góry. Uruchom odkurzacz plazmowy.
   UWAGA: Poniższe szczegółowe instrukcje dotyczą odkurzacza plazmowego Plasma Etch PE-50. Konkretne kroki i ustawienia muszą zostać dostosowane i ewentualnie ponownie zoptymalizowane dla innych myjek plazmowych.
   1. Sprawdź, czy poziom mocy myjki plazmowej jest ustawiony na 75%.
   2. Upewnij się, że zawory odpowietrzające i odcinające są w pozycji OFF.
   3. Otwórz główny zawór na zbiorniku tlenu. Poczekaj, aż ciśnienie regulatora spadnie do poziomu od 15 psig do 20 psig, a następnie przekręć zawór odcinający do pozycji ON.
   4. Włącz pompę próżniową i myjkę plazmową.
   5. Wprowadź następujące ustawienia w myjce plazmowej (pierwsze użycie) lub sprawdź, czy poprzednio zaprogramowane ustawienia są prawidłowe:
      Czas plazmowy: 3:00 min
      Nastawa próżni: 149.5 mTorr
      Wentyl atmosferyczny: 45 s
      Odpowietrznik przedmuchowy: 5 s
      Stabilizacja gazu: 15 s
      Alarm podciśnienia: 3:00 min
      Automatyczne wyłączanie: WŁ.
   6. Naciśnij Enter, aby przejść do menu poleceń. Użyj strzałki w prawo, aby wybrać opcję Setup Menu, a następnie naciśnij Enter. Przewiń wszystkie ustawienia, naciskając Enter, aby potwierdzić każde bieżące ustawienie, a następnie strzałkę w prawo, aby przejść do następnego ustawienia.
   7. Wróć do menu poleceń, naciskając strzałkę w górę, a następnie strzałkę w lewo.
   8. Na ekranie Menu poleceń naciśnij Enter. Wybierz opcję Commands PLASMA (Polecenia PLASMA), naciskając Enter. System przejdzie przez następujące fazy:
      Pompowanie plazmowe
      Stabilizacja gazu: Podczas tej fazy wyreguluj pokrętło Gaz 1 na myjce plazmowej, aż przepływomierz osiągnie 10 cm³/min.
      Czas plazmy
      Pompa przedmuchu
      Cykl plazmowy zakończony
      Odpowietrznik komory
      UWAGA: Ten proces powinien zająć około 5-10 minut. Po zakończeniu wszystkich faz menu poleceń zostanie ponownie wyświetlone na ekranie. Jeśli podczas fazy pompowania plazmowego ciśnienie nie spadnie wystarczająco nisko, myjka plazmowa nie przejdzie do następnej fazy, a na ekranie pojawi się komunikat o błędzie. Jeśli tak się stanie, sprawdź olej w pompie próżniowej. Jeśli poziom oleju jest niski lub olej jest mętny/brudny, wymiana oleju może pozwolić na osiągnięcie wymaganego poziomu podciśnienia.
   9. Wyłącz główny zawór na zbiorniku tlenu.
   10. Bardzo powoli przekręć zawór odpowietrzający do pozycji ON i pozwól, aby ciśnienie regulatora w butli tlenu powróciło do zera.
   11. Przekręć zawór odcinający do pozycji OFF.
   12. Wyłącz pompę próżniową i odkurzacz plazmowy.
       UWAGA: Hydrofilowa modyfikacja powierzchni urządzenia wielostudzienkowego przez myjkę plazmową jest tymczasowa i z czasem staje się coraz mniej skuteczna (do około 2 godzin). Postępuj zgodnie z sekcją 6 i sekcją 7 tak szybko, jak to możliwe.

6. Napełnianie studni lmNGM

UWAGA: Inkubator do kąpieli z suchymi kulkami powinien być włączony i wstępnie nagrzany od kroku 5.1. Upewnij się, że kąpiel osiągnęła temperaturę 90 °C.

1. Wysterylizuj jedną jednodołkową tackę polistyrenową na urządzenie, spryskując wnętrze tacki 70% etanolem i wycierając ją do sucha chusteczką zadaniową.
2. Wyjmij każde urządzenie z myjki plazmowej ręką w rękawiczce i umieść je na wyczyszczonej tacy.
3. Umieścić jednorazową miskę na pipety o pojemności 25 ml w inkubatorze do kąpieli perełkowej po podgrzaniu go do 90 °C.
4. Zebrać jedną probówkę zestalonej mieszaniny wstępnej lmNGM na urządzenie, które ma być napełnione (patrz krok 1.3).
5. Umieść probówki z mieszaniną wstępną lmNGM w szklanej zlewce o pojemności 200 ml i usuń nakrętki i Parafilm. Kuchenka mikrofalowa przez ~20 s, aż podłoże stopi się na tyle, aby można było je nalać (obecność niektórych stałych mediów jest na tym etapie w porządku).
6. Połącz stopioną mieszaninę wstępną lmNGM z wielu probówek do innej sterylnej zlewki o pojemności 200 ml. Kontynuuj podgrzewanie w kuchence mikrofalowej przez dodatkowe 20 sekund, aby osiągnąć łącznie 40 sekund. Jeśli mieszanina wstępna lmNGM zacznie kipieć, zatrzymaj kuchenkę mikrofalową i pozwól, aby wstępna mieszanina lmNGM opadła przed kontynuowaniem.
7. Wyjmij stopioną mieszaninę wstępną lmNGM z kuchenki mikrofalowej i pozwól jej ostygnąć do ~60 °C.
   UWAGA: Na tym etapie podłoże ostygnie i ponownie zestali się po ~5 minutach. Przejdź od razu do kroku 6.8 i 6.9.
8. Na każde 10 ml premiksu lmNGM dodać (w kolejności): 250 μl 1 M KP_i, 10 μl 1 M_MgSO4, 10 μL 1 M CaCl₂ i 10 μL 5 mg/ml cholesterolu.
   1. Aby zapobiec wykluwaniu się jaj podczas monitorowania dorosłych osobników na urządzeniu, dodaj 10 μl 50 mM floksurydyny.
   2. Aby wybrać plazmid RNAi i indukować ekspresję RNA, dodaj 5 μl 50 mg/ml karbenicyliny i 12 μl 1 mM IPTG.
      UWAGA: Antybiotyki lub inne dodatki mogą być zmieniane w zależności od projektu eksperymentu. Na tym etapie do pożywek można również dodawać badane związki/leki.
9. Wlej stopiony lmNGM do miski o pojemności 25 ml w kąpieli perełkowej.
10. Napełnij studzienki urządzenia lmNGM za pomocą wielokanałowej pipety repeater o pojemności 200 μl.
    1. Ustaw repeater tak, aby dozował podwielokrotności 14 μl (14 μl można dozować do 14 razy w przypadku użycia końcówki do pipety o pojemności 200 μl).
    2. Zamontuj pięć końcówek do pipet. Studzienki urządzenia mają taki sam rozstaw jak w przypadku płytki 384-dołkowej. Standardowe pipety wielokanałowe są rozmieszczone w taki sposób, że użytkownik może pipetować do co drugiego dołka w rzędzie/kolumnie.
    3. Załaduj końcówki stopionym lmNGM. Dozuj pierwsze 14 μl z powrotem do miski zawierającej lmNGM.
    4. Poruszając się szybko, ale ostrożnie, dozuj 14 μl do studzienek wewnętrznych (białych w Rysunek 1B), zaczynając od tych oznaczonych "x" w Rysunek 1B i przesuwając się po płytce w prawo, a następnie w dół, dozując w sumie 12 razy (60 dołków).
    5. Pozostałą porcję lmNGM należy dozować z powrotem do miski, ponieważ końcowa porcja jest zwykle mniejsza niż 14 μl.
    6. Powtarzaj kroki 6.10.3-6.10.5, aż wszystkie wewnętrzne studzienki zostaną wypełnione.
    7. Następnie ustaw repeater tak, aby dozował podwielokrotności 15 μL. Powtórz kroki 6.10.3-6.10.5, ale zamiast wewnętrznych studzienek, wypełnij najbardziej zewnętrzny pierścień studzienek (szary w Rysunek 1B), zaczynając od studzienek oznaczonych "+" w Rysunek 1B i przesuwając się wokół zewnętrznej krawędzi płytki.
       UWAGA: Pracuj szybko, aby media nie zastygły w końcówkach pipet. Unikaj rozlewania lmNGM do fosy. Zewnętrzne studzienki mają tendencję do szybszego wysychania. Dodatkowy 1 μl lmNGM pozwala końcowej wysuszonej studzience mieć równą powierzchnię w tym samym czasie schnięcia, co studzienki wewnętrzne.
11. W ramach kontroli jakości należy zbadać każdą studzienkę, aby zidentyfikować te z wadami, które mogą zakłócać obrazowanie, w tym studzienki, które są niedopełnione (powierzchnia lmNGM jest zapadnięta poniżej krawędzi studni), przepełnione (powierzchnia lmNGM ma kopulastą górę) i zawierają pęcherzyki lub zanieczyszczenia.
12. Usunąć zestalony lmNGM z niezadowalających studzienek za pomocą krótkiego kilofa z drutu platynowego lub aspiratora próżniowego. Uzupełnij puste studzienki świeżym stopionym lmNGM. Usuń również wszelkie media, które przelały się do fosy, za pomocą krótkiego plastikowego drucianego kilofa lub aspiratora próżniowego.

7. Dodawanie siarczanu miedzi do fosy

UWAGA: Studnie tego urządzenia są otoczone ciągłą fosą. Tutaj fosa jest wypełniona siarczanem miedzi, który działa odstraszająco i odstrasza robaki przed ucieczką ze studni.

1. Za pomocą pipety o pojemności 200 μl dozować 200 μl roztworu siarczanu miedzi (patrz krok 1.6) do fosy urządzenia w każdym rogu, po 2 razy na róg. Powinna to być wystarczająco duża objętość, aby siarczan miedzi mógł przepłynąć przez całą fosę. Uważaj, aby w żadnym momencie nie przepełnić fosy; Siarczan miedzi nie powinien dotykać górnej powierzchni studni.
2. Jeśli siarczan miedzi nie przepływa łatwo przez całą fosę, użyj krótkiego szpikulca z drutu platynowego, aby przerwać napięcie i przeciągnąć siarczan miedzi przez fosę.
3. Po przepłynięciu siarczanu miedzi przez całą fosę należy usunąć jak najwięcej siarczanu miedzi z fosy za pomocą pipety o pojemności 200 μl lub aspiracji z próżnią. Pozostawione pozostałości wystarczą, aby zniechęcić robaki do opuszczenia swoich studni. Pozostawienie fosy pełnej roztworu siarczanu miedzi grozi rozlaniem się siarczanu miedzi do studni, co spowodowałoby ucieczkę robaków.

8. Dodawanie autoklawowanych kryształów wody

UWAGA: Aby utrzymać wilgotność wewnątrz płyty i zapobiec wysuszeniu lmNGM, każde urządzenie jest otoczone nasyconymi, absorbującymi wodę kryształami poliakrylamidu.

1. Przygotuj kryształki wody (patrz krok 1.7).
2. Za pomocą wyciskanej butelki dodaj kryształki wody w przestrzeniach między urządzeniem a ściankami tacy. Zamknij pokrywę tacki i owiń wszystkie cztery boki kawałkiem Parafilmu. Dodaj dwa dodatkowe kawałki Parafilmu, aby całkowicie uszczelnić płytkę.
   UWAGA: Kryształki wody można przygotować w zlewce i nabrać do tacki za pomocą wysterylizowanej szpatułki. Wydłuża to jednak czas procedury i wydłuża czas, w którym każda taca jest otwarta i narażona na potencjalne zanieczyszczenia.
3. Pozostaw szczelnie zamknięte urządzenie na stole do następnego dnia, kiedy bakterie będą gotowe do zauważenia. Upewnij się, że urządzenia są przechowywane ze studzienkami skierowanymi do góry po dodaniu lmNGM.

9. Przygotowanie populacji robaków zsynchronizowanej z wiekiem

UWAGA: Następujące kroki dają zsynchronizowaną populację robaków, które są gotowe do dodania do urządzenia wielostudzienkowego w czwartym stadium larwalnym (L4). Można jednak również dodać robaki na różnych etapach rozwoju. Ten krok należy wykonać 2 dni przed dodaniem robaków do urządzenia, jeśli pożądane są L4s. Dostosuj czas synchronizacji do żądanego etapu życia.

1. W celu spójnych badań starzenia, utrzymuj C. elegans na standardowych płytkach NGM (patrz krok 1.2 w temperaturze 20 °C w dobrze odżywionych warunkach).
2. Uzyskaj zsynchronizowaną populację zwierząt z talerza za pomocą standardowych metod, na przykład bleaching¹⁷ lub timed egg laying¹.
3. Dodaj izolowane jaja do płytki NGM nakrapianej bakteriami. Jaja wyklują się na tej szali, a robaki osiągną stadium larwalne L4 w ciągu 2 dni dla zwierząt typu dzikiego.

10. Zaszczepianie kultury bakteryjnej

UWAGA: Bakterie są używane jako główne źródło pożywienia dla C. elegans, najczęściej szczepów E. coli OP50 lub HT115. Bakterie są skoncentrowane 10-krotnie, co należy uwzględnić w objętości przygotowanej kultury. Przygotuj kulturę bakteryjną dzień przed zauważeniem urządzenia.

1. Z płytki LB przygotowanej w kroku 4 wybierz pojedynczą kolonię i zaszczepij 12 ml sterylnego LB na urządzenie, które ma zostać wykryte. W razie potrzeby należy uwzględnić środki selektywne dla używanego szczepu bakterii.
2. Hodować kulturę bakteryjną przez noc (~18 h) w inkubatorze o temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy ~250 obr./min.

11. Wykrywanie studni za pomocą skoncentrowanych bakterii

UWAGA: Do każdej studzienki dodawana jest niewielka ilość skoncentrowanych bakterii, która wystarcza do karmienia robaków przez cały okres ich życia na urządzeniu. Kultura bakteryjna musi zostać wysuszona, zanim robaki będą mogły zostać dodane do studzienek. Ponieważ objętość pożywki w każdej studzience jest niewielka (14-15 μl) w stosunku do objętości dodanych bakterii (5 μl), zawartość chemiczna pożywki bakteryjnej może wpływać na środowisko chemiczne studni. Aby to uwzględnić, bakterie są koncentrowane i ponownie zawieszane w słonej wodzie w celu usunięcia zubożonego LB, unikając jednocześnie stresu hiposmotycznego. Do receptury lmNGM nie dodaje się soli (patrz kroki 1.3-1.4), ponieważ jest ona dodawana na tym etapie.

1. Po wyhodowaniu bakterii przez noc, jak opisano w sekcji 10, należy zagęścić kulturę bakteryjną 10x. Osadzać bakterie przez odwirowanie przy ~3,400 x g przez 20 minut, usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 1/10 pierwotnej objętości kultury 142,8 mM NaCl (patrz krok 1.4). Na przykład, aby wykryć jedno urządzenie z 240 dołkami, odwiruj 12 ml kultury i ponownie zawieś w 1,2 ml 142,8 mM NaCl.
   UWAGA: Badane związki/leki można dodać do zawieszonej kultury bakteryjnej przed plamieniem.
2. Za pomocą powtórnej pipety napełnij każdą studzienkę 5 μl skoncentrowanych bakterii. Unikaj bezpośredniego kontaktu z powierzchnią lmNGM, ponieważ końcówka pipety może przebić lmNGM i umożliwić robakowi zakopanie się pod powierzchnią studni. Uważaj, aby bakterie nie przedostały się do fosy, ponieważ robaki zostaną do niej przyciągnięte i uciekną do fosy.
3. Osusz zauważone bakterie ze zdjętymi pokrywkami tacy. Ten krok jest ważny dla długoterminowej integralności środowiska studni i istnieje wiele sposobów suszenia wykrytych urządzeń. Niezależnie od zastosowanej metody upewnij się, że urządzenie pozostaje w sterylnym środowisku, ponieważ musi pozostać odkryte, podczas gdy bakterie wysychają. Zwiększony przepływ powietrza znacznie skraca czas schnięcia. Suszenie można przeprowadzić zgodnie z opisem w poniższych krokach:
   1. Pozostaw urządzenie odkryte w czystym, szczelnie zamkniętym pojemniku, takim jak plastikowy pojemnik, który został oczyszczony 10% wybielaczem, a następnie 70% etanolem. Ta metoda suszenia może potrwać kilka godzin.
   2. Umieść urządzenia odkryte w sterylnym okapie z przepływem laminarnym (podobnie jak w preferowanej metodzie poniżej).
   3. Osusz urządzenia za pomocą specjalnie zbudowanego "pudełka do suszenia" (zoptymalizowana metoda zastosowana w tym badaniu), które można zbudować przy minimalnych kosztach przy użyciu wentylatorów obudowy komputera i filtrów HEPA (patrz plik uzupełniający 1).
      UWAGA: Niezależnie od zastosowanej metody, etap suszenia musi być zoptymalizowany pod kątem lokalnego środowiska. Często monitoruj, jak szybko studnie wysychają, aż do momentu określenia typowego czasu suszenia. W środowisku o niskiej wilgotności użycie suszarki powoduje czas schnięcia ~30-40 min. Nie pozwól, aby talerze zbytnio wyschły, ponieważ media w studzienkach skurczą się i zatoną. Lepiej jest zdjąć urządzenie z suszenia, gdy kilka studzienek jest jeszcze mokrych, niż pozwolić mu wyschnąć dłużej i potencjalnie przesuszyć dużą liczbę studzienek.
4. Sprawdź kryształki wody. Jeśli większość kryształków wody na tacy wyschła i straciła objętość podczas procesu suszenia, dodaj więcej do tacy.
5. Po wyschnięciu bakterii natychmiast dodaj robaki (sekcja 12) lub zamknij tackę do późniejszego użycia. Aby uszczelnić, zamknij pokrywę tacki i owiń wszystkie cztery boki jednym kawałkiem Parafilmu. Powtórz dwukrotnie, w sumie dla trzech warstw Parafilmu. Po całkowitym owinięciu tacki urządzenie można pozostawić na stole w temperaturze pokojowej do 4 dni przed dodaniem robaków (punkt 12).

12. Dodawanie robaków do urządzenia wielostudziennego

1. Ręcznie dodaj jednego robaka na studzienkę do każdej studzienki za pomocą platynowego kilofa, aby przenieść zwierzęta z płytek z robakami przygotowanych w sekcji 9. Zbieraj tylko robaki, które są na pożądanym etapie życia i wieku.
   UWAGA: Dodanie robaków do urządzenia zajmuje więcej niż 1 godzinę, może spowodować wysuszenie lmNGM, dlatego robaki należy dodać tak szybko, jak to możliwe. Wybieranie wielu robaków (20+) na raz przed dodaniem ich do studzienek urządzenia może pomóc w zwiększeniu prędkości.

13. Zakończenie przygotowania urządzenia do długotrwałego użytkowania

UWAGA: Te kroki gwarantują, że studnie urządzenia pozostaną nawodnione przez cały czas trwania eksperymentu.

1. Zbadaj kryształki wody. Upewnij się, że kryształki wody znajdują się na poziomie górnej części urządzenia, ale nie przelewają się na nią. W razie potrzeby dodaj dodatkowe kryształki wody do tacy.
2. Dodaj kroplę przygotowanego roztworu detergentu (patrz krok 1.5) do wewnętrznej strony pokrywy tacki i wcieraj chusteczką zadaniową, aż roztwór detergentu wyschnie. Zapobiega to zaparowaniu pokrywy po zamknięciu urządzenia w tacy, dzięki czemu robaki są dobrze widoczne.
3. Owiń tacę trzema kawałkami Parafilmu przy użyciu specjalnej techniki, która promuje długoterminową integralność uszczelki Parafilm.
   1. Lekko rozciągnij kawałek Parafilmu tak, aby zakrywał tylko dwie strony tacy. Powtórz to z drugim kawałkiem Parafilmu, aby pokryć pozostałe dwie strony.
   2. Ułóż warstwy na pierwszej warstwie Parafilmu, weź ostatni kawałek Parafilmu, rozciągnij go całkowicie i zawiń wszystkie cztery strony. Jeśli są odpowiednio uszczelnione, studzienki urządzenia powinny pozostać nawodnione przez ~2 miesiące.
      UWAGA: Integralność Parafilmu powinna być monitorowana co 1-2 tygodnie, a Parafilm należy wymienić, jeśli jest uszkodzony.
4. Usuń wszelkie odciski palców z górnej części tacki za pomocą chusteczki zwilżonej 70% etanolem.

14. Gromadzenie danych

UWAGA: Celem tego badania jest opisanie metodologii hodowli. Po zapełnieniu urządzenia wielodołkowe są kompatybilne z monitorowaniem podłużnym różnych fenotypów. W tym miejscu znajdują się podstawowe wskazówki dotyczące pomiaru kilku najczęstszych parametrów.

1. Długość życia: Monitoruj żywotność, stukając w płytkę lub wystawiając robaki na działanie jasnoniebieskiego światła co 1-3 dni. Oceń jako martwego, jeśli nie zauważysz żadnego ruchu. Te urządzenia wielodołkowe są również kompatybilne ze zautomatyzowanymi potokami obrazowania i analizy w celu oszacowania żywotności^13,18.
2. Aktywność: Monitoruj aktywność poszczególnych zwierząt przez całe życie, wykonując statyczne zdjęcia lub filmy przedstawiające zwierzęta w studzienkach urządzenia i oceniając przebytą odległość, prędkość lub inne wskaźniki ruchu. Urządzenia są również kompatybilne z automatycznymi potokami obrazowania i analizy do szacowania aktywności^13,18.
3. Rozmiar i kształt ciała: Monitoruj zmiany wielkości i kształtu ciała, wykonując statyczne obrazy zwierząt w studzienkach urządzenia i określając ilościowo parametry wizualne przy użyciu standardowych technik obrazowania. Zasadniczo ta metoda hodowli powinna być kompatybilna z istniejącym oprogramowaniem w celu bardziej wyrafinowanej oceny kształtu ciała robaka^19,20,21.

15. Ponowne użycie urządzeń

UWAGA: Po zakończeniu eksperymentu, urządzenia wielodołkowe mogą być czyszczone i ponownie używane do trzech razy. Dodatkowe ponowne użycie zaczyna wpływać na fenotypy robaków, prawdopodobnie spowodowane przez substancje chemiczne z pożywki lub bakterie gromadzące się w ściankach materiału PDMS.

1. Wyrzuć Parafilm i wyjmij urządzenie z tacy. Sprawdź wycięcia w prawym górnym rogu urządzenia, które wskazują, ile razy było używane. Jeśli zostało użyte trzy razy, wyrzuć urządzenie. Jeśli był używany mniej niż trzy razy, wyczyść go i użyj ponownie.
   UWAGA: Tace są wykonane z polistyrenu i nie mają bezpośredniego kontaktu z lmNGM, bakteriami ani żadnymi dodatkami do mediów. Można je wielokrotnie używać, o ile pozostają przejrzyste wizualnie.
2. Wypłucz wszelkie pozostałe kryształki wody z tacy. Spryskaj wnętrze tacki 10% roztworem wybielacza i pozostaw na 10 minut. Spłucz wodą dejonizowaną i natychmiast wysusz, aby uniknąć plam wodnych.
3. Trzymaj urządzenie pod bieżącą wodą, aby rozpocząć czyszczenie mediów ze studzienek. Delikatnie zegnij i przekręć urządzenie pod wodą, aby pomóc poluzować media ze studzienek, ale nie zginaj tak daleko, aby urządzenie się rozerwało. Za pomocą końcówki do pipety o pojemności 200 μl należy wybrać pozostałe media, które utknęły w studzienkach.
4. Napełnij 2-litrową zlewkę mieszadłem ~3/4 objętości wodą dejonizowaną i zagotuj na gorącym talerzu.
5. Dodaj jedno lub dwa urządzenia wielostudzienkowe i mieszadło do wrzącej wody. Włącz mieszanie magnetyczne na niską prędkość (~200 obr./min), aby delikatnie poruszyć urządzenia w wodzie. Pozwól urządzeniom wrzeć przez 10 minut.
6. Wyjmij urządzenia z wody za pomocą metalowej pęsety i połóż je grubą stroną do dołu na ręcznikach papierowych, aby odsączyć. Pozostaw urządzenia do wyschnięcia co najmniej przez noc.
7. Gdy urządzenia całkowicie wyschną, zawiń je w folię i zaklej taśmą autoklawową. Napisz na taśmie autoklawu, ile razy urządzenie było używane. Autoklaw w suchym cyklu przez 15 minut w temperaturze 121 °C w celu sterylizacji. Urządzenia są teraz gotowe do ponownego użycia.

System hodowli WorMotel może być używany do zbierania różnych danych, w tym dotyczących długości życia, zdrowia i aktywności. W opublikowanych badaniach wykorzystano urządzenia wielostudzienne do badania długości życia i zdrowia13,14, spoczynek i sen22,23,24, oraz behavior25. Długość życia można ocenić ręcznie lub za pomocą zbioru obrazów i dalszej analizy obrazowania. W pierwszym podejściu robaki mogą być ręcznie obserwowane po bodźcu (np. stuknięciu w płytkę lub wystawieniu na działanie niebieskiego światła) co 1-3 dni i ocenione jako martwe, jeśli nie zaobserwuje się żadnego ruchu, podobnie jak w przypadku standardowych metod na płytkach Petriego1. To ostatnie podejście jest podobne, z tą różnicą, że ruch robaka można określić, porównując różnice między klatkami między obrazami wykonanymi po zastosowaniu bodźca. Stanowi to dodatkową korzyść, ponieważ przemieszczanie się dostarcza informacji zarówno na temat poziomu aktywności poszczególnych zwierząt w danym momencie, jak i dostarcza wskaźnika, za pomocą którego można określić długość życia (np. zaprzestanie przemieszczania się) i długość zdrowia (zaproponowano wiele definicji). Obrazy można dalej wykorzystać do wyodrębnienia dodatkowych parametrów fizjologicznych, takich jak rozmiar ciała, kształt ciała i postawa ciała.

Aby zademonstrować zdolność systemu, zbadaliśmy klasyczną epistatyczną relację między receptorem insuliny, kodowanym przez gen daf-2, a czynnikiem transkrypcyjnym z rodziny FOXO kodowanym przez daf-16 w kontekście długości życia, zdrowia i codziennej aktywności poszczególnych zwierząt. Utrata funkcji typu dzikiego (szczep N2) i daf-16(mu68) (szczep CF1038) C. elegans karmione E. coli (szczep HT115) wykazujące ekspresję jednej z kontroli (pusty wektor; Konstrukty żywieniowe EV) lub daf-2 RNAi hodowano w urządzeniach wielodołkowych, a każde zwierzę monitorowano pod kątem długości życia (Rysunek 2A), długości zdrowia (Figura 2B) i codziennej aktywności ( Rysunek 2C). Aktywność była monitorowana codziennie, wykonując serię nieruchomych zdjęć co 5 s przez 2 minuty, przy czym robaki były wystawione na działanie jasnego niebieskiego światła przez 5 s po 1 minucie, aby stymulować aktywność (zgodnie z Churgin et al.13). Dzienna aktywność każdego zwierzęcia została oszacowana poprzez normalizację tła w studzienkach i obrazach, zidentyfikowanie obszaru robaka na każdym obrazie i obliczenie zmiany obszaru między sąsiednimi obrazami. Długość życia zdefiniowano jako wiek, w którym po raz ostatni zaobserwowano aktywność każdego robaka, a długość zdrowia zdefiniowano jako wiek, w którym robak nie mógł już poruszać się na całej długości ciała. Zgodnie z oczekiwaniami wynikającymi z wielu wcześniejszych badań (np. Kenyon i wsp.26, Murphy et al.27), mutacja daf-16(mu86) spowodowała krótką długość życia i zapobiegła wydłużeniu życia w wyniku knockdownu RNAi daf-2 (Rysunek 2A). Podobny wzorzec zaobserwowano dla healthspan (Rysunek 2B). Zaletą stosowania wielodołkowych systemów hodowli urządzeń jest możliwość śledzenia poszczególnych zwierząt przez całe życie, co pozwala na szczegółową analizę indywidualnej zmienności każdego mierzonego fenotypu w całej populacji. Na przykład, różnice w długości życia i długości zdrowia poszczególnych zwierząt mogą być porównywane w kategoriach bezwzględnych (Rysunek 2D) lub jako ułamek całkowitej długości życia (Rysunek 2E). Fenotypy wczesnego życia można następnie porównać z fenotypami późnego życia, w tym długością życia, u poszczególnych zwierząt w całej populacji. Na przykład, skumulowana aktywność dla każdego zwierzęcia w ciągu życia (tj. obszar pod krzywą [AUC] dla indywidualnej aktywności) korelowała lepiej z długością życia (Rysunek 2F) niż skumulowana długość życia do 5 dnia życia (Rysunek 2G) we wszystkich mierzonych warunkach. Podkreślamy, że celem tej pracy jest dostarczenie szczegółowego protokołu budowy środowiska wielodołkowego do śledzenia poszczególnych zwierząt w czasie, a nie do pomiaru konkretnego fenotypu za pomocą urządzenia. Reprezentatywne wyniki przedstawione w Rysunek 2 to tylko jeden przykład fenotypów, które można zmierzyć w tym systemie. Po skonstruowaniu, środowisko wielodołkowe jest kompatybilne z szeroką gamą technik pomiaru fenotypów swobodnie pełzających robaków na podłożach stałych.

Rysunek 1: Schemat mikrofabrykowanych urządzeń wielostudziennych. (A) Poszczególne C. elegans są hodowane na stałych, niskotopliwych pożywkach hodowlanych nicieni (lmNGM) agarozowych obsianych pokarmem bakteryjnym w indywidualnych studzienkach. Przestrzeń między studzienkami jest pokryta awersyjną substancją chemiczną (siarczanem miedzi), aby wyizolować każdego robaka w jego studni. Każde urządzenie jest zabezpieczone w tacce z jedną studzienką. Obwód tacy jest wypełniony kryształkami wody, aby utrzymać wilgotność. Taca jest uszczelniona Parafilmem, aby umożliwić wymianę tlenu. Obraz utworzony za pomocą BioRender.com. (B) Przegląd urządzenia wielostudziennego, wskazujący sugerowaną kolejność załadunku studni. Studzienki wewnętrzne (białe) otrzymują 14 μl lmNGM. Do studzienek zewnętrznych (szarych) trafia 15 μl lmNGM. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Korelacja zmierzonych fenotypów w populacjach u poszczególnych zwierząt przy użyciu urządzeń wielodołkowych. Wszystkie panele dostarczają danych z tego samego eksperymentu porównującego cztery grupy zwierząt: zwierzęta typu dzikiego (N2) poddane pustemu wektorowi EV(RNAi) (N = 138), zwierzęta typu dzikiego poddane daf-2(RNAi) (N = 151), zwierzęta daf-16(mu86) poddane EV(RNAi) (N = 123) oraz zwierzęta daf-16(mu86) poddane daf-2(RNAi) (N = 135). (A) Wydłużenie żywotności z daf-2 (RNAi) jest blokowane przez mutację zerową daf-16 (mu86). Istotność parami między grupami wyznaczona za pomocą testu log-rank (funkcja survdiff w R). (B) Rozpiętość zdrowia zdefiniowana tutaj jako dzień, w którym zwierzę nie może już poruszać się na całej długości ciała z daf-2 (RNAi) jest blokowane przez mutację zerową daf-16 (mu86). Istotność parami między grupami wyznaczona za pomocą testu log-rank (funkcja survdiff w R). (C) 3-dniowa średnia krocząca aktywności w całym okresie życia jest zmniejszona zarówno przez daf-16 (mu86), jak i daf-2 (RNAi). Istotność obliczona za pomocą testu U Manna-Whitneya w celu porównania obszaru pod krzywą dla aktywności w ciągu życia poszczególnych zwierząt między grupami. (D) Długość zdrowia i długość życia dla każdej populacji jako wartości bezwzględne (średnia ± błąd standardowy średniej). (E) Długość zdrowia i długość życia dla każdej populacji znormalizowane do całkowitej długości życia w każdej grupie (średnia ± błąd standardowy średniej). (F) Skumulowana aktywność w całym okresie życia (obszar pod krzywą [AUC] w całym okresie życia) dla poszczególnych zwierząt koreluje lepiej z długością życia niż (G) aktywność dla poszczególnych zwierząt w dowolnym konkretnym dniu w ciągu życia (pokazano korelację aktywności w dniu 8, reprezentującą punkt, w którym średnia aktywność jest maksymalizowana), obliczoną za pomocą regresji liniowej (funkcja lm w R). n.s. = nieistotne, * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Wszystkie wartości p zostały skorygowane dla wielokrotnych porównań przy użyciu metody Bonferroniego dla porównań dokonanych w każdym panelu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Plik uzupełniający 1: Plik STL do drukowania formy do wielodołkowego urządzenia 3D Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Autorzy oświadczają, że nie mają żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.