Zamrożenie urazu mięśnia żwacza myszy w celu ustalenia modelu zwłóknienia mięśni ustno-twarzowych

Mięśnie ustno-twarzowe są kluczowe w codziennych czynnościach fizjologicznych, takich jak żucie, mowa, oddychanie i wyraz twarzy¹. Jednak w wrodzonych deformacjach ustno-twarzowych mięśnie te wykazują zmiany zanikowe i zwłóknieniowe, co prowadzi do upośledzenia zdrowia ciała i poznania społecznego². Chirurgia rekonstrukcyjna twarzy pozostaje leczeniem pierwszego rzutu, ale do 30-70% pacjentów pooperacyjnych nadal cierpi na utratę mięśni i dysfunkcję mięśni^3,4 Niepowodzenie regeneracji mięśni ustno-twarzowych przypisuje się czynnikom wewnętrznym, których nie można skorygować za pomocą samej operacji.

Pojawienie się mięśni ustno-twarzowych jest ewolucyjną nowością, towarzyszącą złożonej głowie kręgowców i komorowemu sercu^5,6. W przeciwieństwie do swoich odpowiedników kończyn wywodzących się z somitów, mięśnie ustno-twarzowe wywodzą się z łuku skrzelowego⁷. Te cechy filogenetyczne i ontogenetyczne mogą predysponować je do odrębnych zachowań regeneracyjnych⁸. Doniesiono, że mięsień żwaczy (MAS) rozwinął ciężkie zwłóknienie w czasie, gdy mięsień piszczelowy przedni (TA) w pełni zregenerował się po ekspozycji na ten sam stopień urazu^1,9. Jednak mechanizm leżący u podstaw regeneracji pozostaje słabo poznany.

W tym badaniu, model uszkodzenia mięśnia żwacza myszy został stworzony, aby ułatwić badanie regeneracji mięśni ustno-twarzowych. Wybraliśmy 14 dni po urazie jako punkt czasowy do oceny fenotypu zwłóknienia, ponieważ był to najwcześniejszy punkt, w którym można było wykryć zauważalną rozbieżność między dwoma mięśniami. Całkowita regeneracja MAS po urazie wymaga co najmniej 40 tygodni¹. Konsekwentnie, badanie to ujawniło niezwykłe odkładanie się kolagenu po zamrożeniu MAS w porównaniu z regularną regeneracją TA po 14 dniach od urazu. Za pomocą tego modelu można przeprowadzić dalsze badania mechanistyczne nad zanikiem i zwłóknieniem mięśni, co z kolei pomoże w opracowaniu potencjalnych dróg terapeutycznych wspomagających regenerację mięśni ustno-twarzowych po operacji.

Wszystkie procedury na zwierzętach w tym badaniu zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Komitet Etyczny Zachodniochińskiej Szkoły Stomatologii, Uniwersytetu Sichuan (WCHSIRB-D-2020-114). Samce myszy C57BL/6 (w wieku 5 tygodni) były hodowane w pomieszczeniu o kontrolowanej wilgotności (53 ± 2%) i temperaturze (23 ± 2 °C) i znajdowały się w 12-godzinnym cyklu światła/ciemności. Szczegółowe informacje dotyczące wszystkich materiałów, odczynników i przyrządów używanych w tym protokole można znaleźć w Tabeli materiałów.

1. Uraz spowodowany zamrożeniem

1. Znieczulenie: Uspokoić myszy wacikami nasączonymi izofluranem i wstrzyknąć tiletaminę-zolazepam dootrzewnowo w dawce 50 mg/kg. Znieczulenie przed- i pooperacyjne zapewniono poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie meloksykamu w dawce 1 mg/kg. Chroń ich oczy maścią weterynaryjną. Poduszka grzewcza utrzymywana w temperaturze 38 °C była umieszczana pod serwetą chirurgiczną podczas całego zabiegu, aby zapewnić zwierzęciu wsparcie termiczne. Przymocuj myszy taśmą klejącą po ułożeniu ich na boku na stole operacyjnym (Rysunek 1). Oceń wystarczalność znieczulenia na podstawie utraty odruchu powiekowego, odruchu prostowania i odruchu wycofania pedału.
   UWAGA: Podczas stosowania znieczulenia izofluoranowego trzymaj mysz w jednej ręce, a wacik nasączony izofluoranem w drugiej. Upewnij się, że wacik jest trzymany w pewnej odległości od zwierzęcia, aby uniknąć dyskomfortu i podrażnienia skóry.
2. Depilacja przedoperacyjna: Użyj elektrycznej maszynki do golenia, aby ogolić włosy na łydce i twarzy myszy i nałóż pastę do depilacji za pomocą bawełnianego wacika na skórę, zakrywając mięsień żwacz i mięsień piszczelowy przedni. Po 1-2 minutach zmyj pastę chusteczką chirurgiczną na bazie etanolu (Ryc. 2A i Ryc. 2G). Miejsca operacyjne zostały zdezynfekowane trzema rundami peelingu na bazie jodu i 75% etanolu.
   UWAGA: Sama elektryczna maszynka do golenia nie wystarczała do depilacji, szczególnie w obszarze żwaczy. Podczas nakładania pasty do depilacji ważne jest, aby nie używać nadmiernej ilości pasty. Podczas zmywania pasty delikatnie przetrzyj skórę, aby uniknąć oparzeń skóry.
3. Ekspozycja pola operacyjnego: Przykryj się obłożeniami chirurgicznymi przed zabiegiem chirurgicznym. W przypadku mięśnia MAS najpierw obmacuj wzdłuż dolnej krawędzi żuchwy. W odległości 5 mm od krawędzi wykonaj 7 mm nacięcie wzdłuż linii łączącej spoidło ustne z tragusem (linia przerywana wskazuje miejsce nacięcia w Rysunek 2B).
4. W przypadku mięśnia TA najpierw wykonaj badanie palpacyjne wzdłuż łydki, aby zlokalizować przednią krawędź kości piszczelowej. Przeciąć skalpelem 2 mm za krawędzią przez skórę, zaczynając od kolana i kończąc na kostce (przerywana linia wskazuje miejsce nacięcia w Rysunek 2H). Dla każdej myszy, jeśli MAS i mięsień TA po lewej stronie są uszkodzone, użyj drugiego mięśnia po stronie przeciwnej jako kontrolnego.
   UWAGA: To cięcie jest bardzo powierzchowne, aby zapewnić, że mięśnie nie zostaną uszkodzone podczas nacięcia. Nacięcie na twarzy nie powinno znajdować się zbyt blisko tragusa. W przeciwnym razie ślinianka przyuszna zostanie odsłonięta, co doprowadzi do nadmiernego krwawienia podczas następnego procesu zamrażania.
5. Zamrażanie suchym lodem: Przytrzymaj jeden kawałek suchego lodu za pomocą wstępnie schłodzonych kleszczyków wzdłuż długich osi mięśni MAS i TA (Rysunek 2C i Rysunek 2I, odpowiednio). Umieść suchy lód bezpośrednio na powierzchni mięśnia na 5 sekund. Upewnij się, że mięsień wydaje się sztywny i bladobiały natychmiast po usunięciu suchego lodu (Rysunek 2D i Rysunek 2J), ale wraca do normalnego koloru i tekstury w ciągu 22-25 s, podobnie jak sąsiedni nieuszkodzony mięsień (Rysunek 2E i Rysunek 2K).
   UWAGA: Kleszcze przytrzymujące suchy lód powinny być wstępnie schłodzone, aby uniknąć szybkiej sublimacji suchego lodu. Timer jest obowiązkowy przy przeprowadzaniu 5-sekundowej kontuzji zamrażania i liczeniu 22-25 s czasu regeneracji mięśnia. Każdy mięsień, którego czas regeneracji jest krótszy niż 22 s lub dłuższy niż 25 s, powinien zostać porzucony. Ten krok wymaga praktyki.
6. Zamknięcie rany: Po całkowitym wyzdrowieniu mięśnia, zamknij ranę skóry co najmniej trzema szwami 7-0 (Rysunek 2F i Rysunek 2L).
7. Resuscytacja: Po zakończeniu zakładania szwu umieść myszy w klatce ze wsparciem termicznym i monitoruj je w sposób ciągły, aż wszystkie odruchy prostowania zostaną odzyskane.

2. Pobieranie mięśni

1. Poddaj myszy eutanazji za pomocą przedawkowania izofluranu, a następnie zwichnięcia szyjki macicy. Zbierz mięśnie MAS i TA po obu stronach do analizy histologicznej.
2. Rozwarstwienie mięśnia MAS: Rozetnij skórę na twarzy myszy i usuń śliniankę przyuszną, aby odsłonić tylną część mięśnia MAS. Wypreparuj MAS od jego przedniego przyczepu aż do tylnego przyczepu na żuchwie. Biały przerywany obszar wskazuje odsłoniętą część MAS (Rysunek 3A).
   UWAGA: Mięsień MAS składa się z głębokich i powierzchownych przedziałów, oba ściśle przylegające do powierzchni żuchwy. Pamiętaj, aby przycisnąć nożyczki do żuchwy podczas sekcji, aby zapewnić całkowitą izolację MAS. Należy uważać, aby odróżnić jarzmowo-żuchwowy od MAS na podstawie granic między jarzmową a żuchwą.
3. Rozwarstwienie mięśnia TA: Rozetnij skórę od kostki do kolana i usuń powięź, aby odsłonić mięsień TA. Użyj końcówki kleszczy do mikropreparacji, aby odizolować ścięgno TA i przesuń je aż do kolana, aby oderwać włókna przyczepiające się do kości piszczelowej. Następnie przetnij ścięgno na kostce (Rysunek 3B).
   UWAGA: W przypadku mięśnia TA wokół kostki myszy znajduje się kilka ścięgien mięśniowych; wymagałoby to praktyki, aby dostrzec ścięgno TA, które jest największe i najbliżej kości piszczelowej.
4. Izopentan schładzający wstępnie: Przygotuj dwie beczki izolacyjne; napełnij małą beczkę izopentanem, a dużą beczkę ciekłym azotem. Umieść małą beczkę w dużej beczce na 10 minut przed rozwarstwieniem mięśni (Rysunek 3D).
5. Przygotowanie formy do zatapiania: Wykonaj cylindryczną formę z folii aluminiowej dla każdej próbki i wypełnij je związkiem o optymalnej temperaturze cięcia (OCT).
6. Świeżo zamrożone: Zanurz mięsień w OCT, trzymając go prostopadle do związku OCT (Rysunek 3C). Użyj uchwytu na igłę, aby przenieść formę do wstępnie schłodzonego izopentanu. Poczekaj 40 sekund, aż OCT stanie się biały i stały (Rysunek 3D).
   UWAGA: Upewnij się, że pozycja formy nie jest zbyt niska. W przeciwnym razie izopentan zmiesza się z OCT i zaburzy proces zamrażania mięśni. Poziom OCT w formie powinien być porównywalny z wysokością próbki mięśniowej. Unikaj nadmiernej ilości OCT, aby zapewnić szybkie i wydajne zamrażanie.
7. Przechowywanie próbek: Świeże mrożone próbki mięśni należy przechowywać na wyraźnie oznakowanych płytkach 24-dołkowych. Próbki należy natychmiast podzielić na części lub przechowywać w temperaturze -80 °C do długotrwałego użytkowania.

3. Analiza histologiczna

1. Za pomocą kriostatu wyciąć skrawki o grubości 10 μm z próbki mięśni na szkiełka poddane obróbce powierzchniowej.
2. Umieść szkiełka w lodowatym acetonie na 20 minut i wysusz je na powietrzu w dygestorium przez 20 minut.
3. Myć szkiełka przez 3 x 5 minut solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).
   UWAGA: Od tego momentu szkiełka były przechowywane w komorze wilgotnościowej, aby uniknąć wysuszenia.
4. Czerwone barwienie Syriusza
   1. Przygotuj roztwór roboczy Sirius Red, rozpuszczając 0,5 g proszku Sirius Red w 500 ml nasyconego kwasu pikrynowego.
   2. Szkiełka barwić roztworem roboczym Sirius Red przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
   3. Myć szkiełka przez 2 x 5 minut 0,5% kwasem octowym.
   4. Po procesie barwienia próbki należy najpierw odwodnić w 95% etanolu przez 15 s, a następnie odwodnić w bezwodnym etanolu przez 1 minutę. Ostatnim krokiem jest zamontowanie zjeżdżalni z neutralnym balsamem.
5. Barwienie immunohistologiczne
   1. Przepuszczać skrawki 0,3% Trytonu w PBS przez 20 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przemyć PBS.
   2. W przypadku barwienia Pax7 należy zablokować skrawki odczynnikiem dostarczonym z zestawem referencyjnym; w przypadku barwienia lamininą i Pdgfrα należy zablokować 5% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) i 5% surowicą osła w PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
   3. Inkubować skrawki z pierwszorzędowymi przeciwciałami przeciwko Pax7, lamininie i Pdgfrα przez noc w temperaturze 4 °C, a następnie przemywać PBS przez 3 x 5 min.
   4. Inkubować skrawki z przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z barwnikiem fluorescencyjnym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie przemywać PBS przez 3 x 5 min.
   5. Inkubować z 4',6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI) przez 3 minuty w temperaturze pokojowej, a następnie przemywać PBS przez 3 x 5 min.
   6. Umieść podłoże montażowe na sekcji, umieść szkiełko nakrywkowe na wierzchu i użyj lakieru do paznokci, aby uszczelnić szkiełko nakrywkowe.

HE i Sirius Red staining (Rysunek 4 i Rysunek Uzupełniający S1) ujawniły całkowitą regenerację mięśni TA w tym modelu zamarznięcia. Natomiast MAS wykazywał upośledzoną regenerację włókien mięśniowych i nadmierne odkładanie się macierzy zewnątrzkomórkowej. Histologia nienaruszonego mięśnia MAS i TA jest pokazana w Rysunek 4A, B, gdzie włókna mięśniowe są wyrównane, a obszar zwłóknienia pojawił się tylko w przestrzeni śródmiąższowej i wśród różnych wiązek. Podczas gdy mięsień TA pozostał w dużej mierze tą samą strukturą mięśniową, co jego nienaruszona kontrola po 14 dniach od urazu (Rysunek 4G-J), struktura mięśnia MAS była poważnie zaburzona ( Figura 4C-F). Obszary zwłóknieniowe pojawiły się w miejscu prawie wszystkich włókien mięśniowych w przednim, środkowym i tylnym przekroju mięśnia MAS (Ryc. 4C-F).

Barwienie immunohistologiczne Pax7 (Rysunek Uzupełniający S2) i Pdgfrα ułatwiło dalsze badania nad komórkami satelitarnymi mięśni (MuSCs) i fibro-adipogennymi komórkami progenitorowymi (FAPs). W mięśniu MAS, przy 14 dpi, pojawiły się gęsto zaludnione jądra, ale bez proporcjonalnie zwiększonych MuSC (Ryc. 5A,B). Duża liczba centralnie jądrkowanych włókien mięśniowych (pokazanych przez niebieski grot strzałki) wykryto w TA przy 14 dpi (Rysunek 5H), podczas gdy kontur włókien mięśniowych był ledwo zauważalny w MAS w uszkodzonym obszarze ( Rysunek 5E,F). Zamiast tego zaobserwowano infiltrację Pdgfrα-dodatnich FAP i nowo powstałych włókien mięśniowych o małej średnicy (oznaczonych białymi strzałkami) (Rysunek 5F).

Rysunek 1: Przegląd konfiguracji chirurgicznej. (A) Mysz została znieczulona i unieruchomiona na stole operacyjnym. Usunięto włosy z twarzy i nogi po lewej stronie. Zegar był używany do monitorowania zamrożenia mięśni i czasu regeneracji. (B) Suchy lód o średnicy 3,5 mm i wysokości 6-12 mm przygotowywano w szklanej zlewce do zamrożenia. Kleszcze zostały wstępnie schłodzone w suchym lodzie do późniejszego wykorzystania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Śródoperacyjny zapis uszkodzeń spowodowanych zamrożeniem MAS i TA. (A) Depilacja do zamrażania MAS. (B) Otwórz skórę, aby odsłonić mięsień MAS. (C) Zamrażanie suchym lodem wzdłuż długiej osi MAS. (D) Pojawienie się MAS natychmiast po 5 s zamarznięcia. (E) Pojawienie się MAS po 22-25 s rekonwalescencji. (F) Zamykanie ran na twarzy. (G) Depilacja w celu zamrożenia TA. (H) Otwórz skórę, aby odsłonić mięsień TA. (I) Zamrażanie przy użyciu suchego lodu wzdłuż długiej osi TA. (J) Pojawienie się TA zaraz po 5 s zamarznięcia. (K) Pojawienie się TA po 22-25 s rekonwalescencji. (L) Zamknięcie rany nogi. Skróty: MAS = żwacz; TA = piszczel przedni. Linie przerywane na rysunkach 2B i 2H wskazują położenie nacięć. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Pobieranie mięśni MAS i TA. (A) Pojawienie się mięśnia MAS po 14 dniach od zamrożenia. Czerwony przerywany owal oznacza MAS; biały przerywany trójkąt pokazuje ekspozycję mięśnia MAS. (B) Pojawienie się mięśnia TA po 14 dniach od zamrożenia. Czerwony przerywany owal oznacza TA. (C) Zanurz próbkę mięśni w związku OCT w sposób prostopadły. (D) Przenieść próbkę mięśni do izopentanu chłodzonego azotem. Skróty: MAS = żwacz; TA = piszczel przednia; OCT = optymalna temperatura cięcia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Analiza histologiczna mięśni MAS i TA. Czerwone zabarwienie Syriusza nienaruszonego (A-E) Nienaruszony przekrój mięśniowy MAS oraz przedniego, środkowego i tylnego odcinka MAS przy 14 dpi. (F-J) Nienaruszony przekrój mięśniowy TA oraz przedni, środkowy i tylny odcinek TA przy 14 dpi. Podziałka = 100 μm. Skróty: MAS = żwacz; TA = piszczel przednia; DPI = dni po urazie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Analiza immunofluorescencyjna mięśni MAS i TA. Barwienie immunologiczne Pax7 i DAPI (niebieskie) w (A) nienaruszonym MAS, (B) 14 dpi MAS, (C) nienaruszonym TA i (D) 14 dpi TA. Barwienie immunologiczne lamininy, Pax7 i DAPI (niebieskie) w (E) nienaruszonym MAS, (F) 14 dpi MAS, (G) nienaruszonym TA i (H) 14 dpi TA. Podziałka = 20 μm. Skróty: MAS = żwacz; TA = piszczel przednia; DPI = dni po urazie; DAPI = 4',6-diamidyn-2-fenyloindol. Białe strzałki wskazują reprezentatywne włókno MAS o małej średnicy. Niebieski obszar przerywany i strzałki wskazują reprezentatywne regenerujące się włókna mięśniowe i centralne jądra TA. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający S1: Uporczywe zwłóknienie podczas regeneracji mięśni. (A) Schematyczna ilustracja regeneracji mięśni TA i MAS wywołanej przez zamrożenie. (B-G) Reprezentatywne obrazy barwienia hematoksyliną i eozyną w przekrojach poprzecznych mięśni TA i MAS w różnych punktach czasowych po urazie. Podziałka = 100 μm. Ten rysunek jest reprodukowany z Cheng et al.8. Skróty: MAS = żwacz; TA = piszczel przednia; DPI = dni po urazie. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający S2: Upośledzenie procesu miogenezy. (A) Obrazy immunofluorescencyjne Pax7 (zielony) i DAPI (niebieski) w mięśniach TA i MAS. (B) Kwantyfikacja procentowej zawartości jąder Pax7 dodatnich/DAPI. Pasek skali = 100 μm * Wskazuje znacznie różniący się od nienaruszonej kontroli mięśniowej. # Wskazuje znacznie różniący się od drugiego mięśnia w tym samym punkcie czasowym. **p < 0,01, ##p < 0,01. Ten rysunek jest reprodukowany z Cheng et al.8. Skróty: MAS = żwacz; TA = piszczel przednia; DPI = dni po urazie; DAPI = 4',6-diamidyn-2-fenyloindol. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.