Ten protokół opisuje model przejściowego ogniskowego niedokrwienia mózgu u myszy poprzez śródświetlne zamknięcie środkowej tętnicy mózgowej. Dodatkowo przedstawiono przykłady oceny wyników z wykorzystaniem rezonansu magnetycznego i testów behawioralnych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Przejściowy model niedrożności tętnicy środkowej mózgu
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Udar mózgu jest główną przyczyną zgonów lub przewlekłej niepełnosprawności na całym świecie. Niemniej jednak istniejące optymalne metody leczenia ograniczają się do terapii reperfuzyjnych w ostrej fazie udaru niedokrwiennego. Aby uzyskać wgląd w fizjopatologię udaru mózgu i opracować innowacyjne podejścia terapeutyczne, fundamentalną rolę odgrywają modele udaru u gryzoni in vivo. Dostępność genetycznie modyfikowanych zwierząt w szczególności przyczyniła się do wykorzystania myszy jako eksperymentalnych modeli udaru.
U pacjentów po udarze częstym zjawiskiem jest niedrożność środkowej tętnicy mózgowej (MCA). W związku z tym najbardziej rozpowszechnionym modelem eksperymentalnym jest okluzja śródświateł MCA, minimalnie inwazyjna technika, która nie wymaga kraniektomii. Procedura ta polega na wprowadzeniu monofilamentu przez tętnicę szyjną zewnętrzną (ECA) i przeprowadzeniu go przez tętnicę szyjną wewnętrzną (ICA), aż dotrze do punktu rozgałęzienia MCA. Po 45-minutowej niedrożności tętnicy monofilament jest usuwany, aby umożliwić reperfuzję. W trakcie całego procesu monitorowany jest przepływ krwi w mózgu, aby potwierdzić redukcję podczas okluzji i późniejszą regenerację po reperfuzji. Wyniki neurologiczne i tkankowe są oceniane za pomocą testów behawioralnych i badań rezonansu magnetycznego (MRI).
Wprowadzenie
Udar mózgu jest wyniszczającą chorobą, która według WHO dotyka około 15 milionów ludzi na całym świecie rocznie. Około jedna trzecia pacjentów ulega tej chorobie, a kolejna jedna trzecia doświadcza trwałej niepełnosprawności. Udar mózgu to złożona patologia obejmująca różne typy komórek, takie jak nerwowe i obwodowe komórki odpornościowe, naczynia krwionośne i reakcje ogólnoustrojowe1. Skomplikowanej sieci reakcji wywołanych udarem na poziomie systemów nie można obecnie odtworzyć przy użyciu modeli in vitro. W związku z tym eksperymentalne modele zwierzęce są niezbędne do zagłębienia się w mechanizmy choroby oraz do opracowania i przetestowania nowych terapii. Obecnie wczesna reperfuzja tkanek jest jedyną zatwierdzoną interwencją, albo poprzez trombolizę z tkankowym aktywatorem plazminogenu (tPA), albo trombektomię wewnątrznaczyniową1.
Niedrożność tętnicy środkowej mózgu (MCA) jest częsta u pacjentów po udarze. W związku z tym modele przejściowej okluzji MCA (tMCAo) u gryzoni zostały początkowo opracowane u szczurów2,3,4. Obecnie myszy modyfikowane genetycznie są najczęściej wykorzystywanymi zwierzętami w eksperymentalnych modelach udaru. W tym badaniu opisujemy minimalnie inwazyjny model śródświetlnego tMCAo u myszy. Dostęp wykonuje się przez tętnicę szyjną na poziomie szyi, bez kraniektomii.
Czas trwania okresu okluzji jest krytycznym czynnikiem, który określa zakres zmiany niedokrwiennej. Nawet krótkie okluzje trwające 10 minut mogą powodować selektywną śmierć neuronów bez widocznego zawału, podczas gdy dłuższe okluzje, zwykle trwające od 30 do 60 minut, powodują pewien stopień zawału mózgu. W przeciwieństwie do bliższych i dystalnych gałęzi MCA, które zaopatrują korę i mają uboczne, tętnice soczewkowato-prążkowiowe dostarczające krew do prążkowia nie mają zabezpieczeń pobocznych5. W konsekwencji dochodzi do większego zmniejszenia przepływu krwi w prążkowiu niż w korze po tMCAo. Tak więc okluzje trwające 30 minut lub krócej na ogół wpływają na prążkowie, ale nie na korę, podczas gdy dłuższe okluzje, od 45 minut, często generują zmianę niedokrwienną na całym terytorium MCA, w tym na prążkowiu i korze grzbietowo-bocznej.
Aby zapewnić dobre samopoczucie myszy, podajemy leki przeciwbólowe przed zabiegiem i używamy znieczulenia podczas operacji. Niemniej jednak znieczulenie może potencjalnie wprowadzić sztuczne zmiany w fizjologii myszy i wpłynąć na niektóre miary wyników6. Interwencja chirurgiczna, gdy jest wykonywana przez doświadczony personel, trwa zwykle około 15 minut w celu wywołania MCAo. Następnie całkowity czas pod narkozą zależy od okresu okluzji. W przypadku eksperymentów, w których minimalizacja znieczulenia ma kluczowe znaczenie, alternatywnym krokiem w procedurze jest przerwanie znieczulenia w okresie okluzji i ograniczenie go tylko do etapów chirurgicznych polegających na wprowadzaniu i wyjmowaniu włókna zamykającego MCA. Takie podejście skraca czas trwania znieczulenia i minimalizuje jego potencjalny wpływ na model eksperymentalny7,8. Dlatego metoda indukowania przejściowego ogniskowego niedokrwienia jest prezentowana przez wewnątrzświetlną okluzję MCA w dwóch wariantach: ze znieczuleniem myszy przez cały okres okluzji lub z myszą obudzoną w tym okresie. W obu przypadkach pozorowana operacja powinna być wykonywana równolegle z interwencją przeprowadzaną na niedokrwionych myszach. Dodatkowo dostarczane są dane dotyczące oceny wyników mierzone za pomocą testów behawioralnych i MRI w różnych punktach czasowych po reperfuzji. Na koniec omówiono główne czynniki, które należy wziąć pod uwagę podczas wdrażania procedury eksperymentalnej.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Praca na zwierzętach została przeprowadzona zgodnie z prawem katalońskim i hiszpańskim (Real Decreto 53/2013) oraz dyrektywami europejskimi, za zgodą komisji etycznej (Comité Ètic d'Experimentació Animal, CEEA) Uniwersytetu w Barcelonie oraz lokalnych organów regulacyjnych Generalitat de Catalunya. Badania są raportowane zgodnie z wytycznymi ARRIVE. Ta procedura jest przeznaczona do wykonywania u dorosłych myszy, począwszy od 8 tygodnia życia, bez ograniczeń wiekowych. Przykłady zabiegu chirurgicznego opracowanego na myszach C57BL/6 w wieku 10-12 tygodni znajdują się tutaj. Należy wziąć pod uwagę różnice anatomiczne w zależności od szczepu myszy.
1. Przygotowanie zwierząt
- Przed rozpoczęciem zabiegu chirurgicznego zbierz i wysterylizuj wszystkie wymagane materiały i narzędzia. Przygotuj stół operacyjny ze wszystkimi niezbędnymi materiałami chirurgicznymi (wymienionymi w Tabeli materiałów).
- Znieczulić zwierzę za pomocą inhalacji izofluranu w mieszaninie tlenu i podtlenku azotu (30%/70%).
- Buprenorfinę (patrz Tabela Materiałów) podawać podskórnie w dawce 0,05 mg/kg masy ciała w celu złagodzenia bólu i dyskomfortu.
UWAGA: Analgezja jest obowiązkowa, ale akceptowane są różne protokoły. Objawy bólu i dyskomfortu muszą być również kontrolowane w pierwszych dniach po MCAo (patrz krok 4). W razie potrzeby zastosuj rozwiązania korygujące. - Umieścić zwierzę w komorze indukcyjnej znieczulenia (patrz Tabela Materiałów) z 5% izofluranem, aż osiągnie stan głębokiego znieczulenia (utrata odruchu przy nakłuciu łapy i odruchu ocznego).
- Umieść mysz na stole operacyjnym i zmniejsz poziom izofluranu do 1,5%, dostarczanego przez maskę na twarz. Zastosuj maść weterynaryjną, aby uniknąć suchości oczu podczas zabiegu.
- Utrzymuj temperaturę ciała na poziomie 37 ± 0,5 °C kontrolowaną przez sondę doodbytniczą podłączoną do poduszki grzewczej (patrz tabela materiałów).
- Ogol brzuszną część szyi i głowę (kalwarię) za pomocą elektrycznej maszynki do golenia. Ostrożnie usuń resztki sierści i trzykrotnie zdezynfekuj obszary skóry okrężnymi ruchami środkiem dezynfekującym na bazie jodu i 70% alkoholem.
.
2. Ocena przepływu krwi w mózgu (CBF) za pomocą laserowej przepływomierza dopplerowskiego (LDF)
- Nożyczkami wykonaj nacięcie na skórze głowy, w kierunku szwu strzałkowego, od uszu do obszaru między oczami.
- Cofnij skórę i usuń okostną po prawej stronie czaszki.
- Znajdź współrzędne (2,5 mm w bok od Bregmy) i przymocuj uchwyt Dopplera (patrz Tabela materiałów) za pomocą cyjanoakrylanu. Po wyschnięciu kleju podłącz sondę dopplerowską i sprawdź, czy odczyt sygnału jest prawidłowy.
3. Przejściowe zamknięcie tętnicy środkowej mózgu (tMCAo)
- Obróć mysz do pozycji leżącej na plecach i przymocuj ją do stołu operacyjnego za pomocą taśmy medycznej.
- Wykonaj nacięcie w linii środkowej na szyi. Odciągnij bocznie skórę i gruczoły ślinowe za pomocą retraktorów (patrz Tabela materiałów), aby odsłonić obszar tętnicy szyjnej.
- Zidentyfikuj anatomię naczyniową wspólnej tętnicy szyjnej (CCA), ICA i ECA, a także różnych tętnic z nich wywodzących się (szczękowa i językowa, tarczyca górna, potyliczna i skrzydłowo-podniebienna) (Rysunek 1A).
- Odłącz główne tętnice od sąsiedniej tkanki łącznej, aby można było się z nimi obchodzić.
UWAGA: Zachowaj szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić nerwów, zwłaszcza nerwu błędnego, który biegnie równolegle do CCA. - Owinąć jedwabny szew 6-0 (patrz Tabela materiałów) wokół ECA w rozwidleniu szczęki/języka. Mocno zamocuj węzeł, aby trwale przerwać krążenie.
- Przełóż drugi szew wokół tej samej tętnicy, między pierwszym węzłem a rozwidleniem CCA i utrzymuj ten węzeł luźno.
- Umieść trzecią nić wokół CCA i zawiąż węzeł poślizgowy, który można łatwo rozwiązać.
UWAGA: Można to również wykonać za pomocą klipsa naczyniowego, ale gwint zapewnia większy ruch i elastyczność. Na tym etapie można zaobserwować pierwszy spadek CBF w sygnale LDF. - Umieść klips naczyniowy (patrz Tabela materiałów) przerywając krążenie krwi z ICA.
- Wykonaj małe nacięcie w ECA, w pobliżu obszaru, w którym znajduje się ciasny węzeł.
- Wkładaj żyłkę, aż gruba powłoka całkowicie dostanie się do światła tętnicy.
- Zaciśnij drugi węzeł, aby utrzymać żyłkę wewnątrz tętnicy i zapobiec wypchnięciu jej na zewnątrz przez ciśnienie wywierane przez krew (Rysunek 1B).
- Usuń klips naczyniowy z ICA.
- Przetnij ECA poniżej pierwszego węzła i obróć kikut, aby ustawić go w kierunku ICA (Rysunek 1C).
- Przesuwaj żyłkę przez ICA aż do punktu, w którym MCA się rozgałęzia.
UWAGA: Okluzja znajduje odzwierciedlenie w nagłym spadku przepływu krwi w odczycie LDF. Za udaną okluzję uważamy, gdy spadek CBF jest większy niż 70% od wartości podstawowej. Jeśli systemy pomiarowe CBF nie są dostępne, punkt okluzji można odnotować na podstawie oporu na wyprzedzenie, który u dorosłych myszy wynosi zwykle około 11 mm od rozwidlenia CCA.- Jeśli znieczulenie jest kontynuowane w okresie okluzji, monitoruj mysz i utrzymuj ją pod stałą obserwacją przez 45 minut.
- W przypadku, gdy mysz zostanie obudzona w okresie okluzji, zszyj skórę szyi kilkoma szwami. Nie odłączając sondy LDF, umieść mysz w pudełku z kontrolowaną temperaturą, co pozwoli na powrót do zdrowia po znieczuleniu.
UWAGA: Często zdarza się, że mysz wykazuje spontaniczne zachowanie krążące w tym okresie, co wskazuje na udaną okluzję. - Po 40 minutach ponownie znieczulić mysz, postępując zgodnie z tymi samymi procedurami znieczulania i dezynfekcji, jak wskazano w punktach 1.4, 1.5 i 1.7. Umieść ją z powrotem na stole operacyjnym i zdejmij szwy z szyi.
- Po 45 minutach okluzji poluzuj węzeł przytrzymujący żyłkę na miejscu. Pociągnij powoli i delikatnie za filament i sprawdź, czy następuje rekanalizacja tkanek.
- Wyciągnij filament i zaciśnij węzeł, aby zapobiec utracie krwi.
- Rozwiąż węzeł CCA. Upewnij się, że nie ma uszkodzeń ściany tętnicy.
- Usuń zwijacze i zmień położenie mięśni, gruczołów i skóry. Zszyj skórę (6-0) i nałóż środek dezynfekujący.
- Odłącz sondę Dopplera i odłącz uchwyt. Zszyj i zdezynfekuj skórę głowy.
- W okresie rekonwalescencji po znieczuleniu pozostaw mysz w klatce wyposażonej w grzałkę, aby utrzymać temperaturę. Utrzymuj go pod stałą obserwacją, aż w pełni wyzdrowieje ze znieczulenia. Po odzyskaniu mysz może zostać ponownie umieszczona w klatce.
UWAGA: Zdecydowanie zaleca się mieszkanie z wzbogaceniem społecznym. Jednak nigdy nie mieszaj myszy operowanych z myszami nieoperowanymi w tej samej klatce bez fizycznej separacji, aby zapobiec agresji.
4. Opieka pooperacyjna
- Okresowo nadzoruj zwierzęta, postępując zgodnie z procedurami i przepisami ustalonymi zgodnie z lokalnymi przepisami. Zapewnij leczenie przeciwbólowe zgodnie z odpowiednim harmonogramem, aby zminimalizować ból po operacji.
UWAGA: W niniejszym badaniu zastosowano ten sam środek przeciwbólowy co na początku interwencji (buprenorfina 0,05 mg/kg masy ciała) po 6 godzinach i 24 godzinach po zabiegu. - Dokonać eutanazji, gdy wskazują na to parametry nadzoru, zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami.
- Codziennie monitoruj wagę zwierząt. Podawaj zwierzętom miękki pokarm w ciągu pierwszych kilku dni po zabiegu. Ponadto należy je nawodnić poprzez podskórne wstrzyknięcie soli fizjologicznej (200 μl) bezpośrednio po zabiegu, a następnie okresowo, jeśli zaobserwuje się, że mysz nie nawadnia się sama. Ułóż jedzenie i wodę w sposób łatwo dostępny dla zwierzęcia.
- Po zakończeniu badania in vivo należy znieczulić myszy, poddać je eutanazji i usunąć tkankę mózgową w celu dalszej analizy histopatologicznej (w razie potrzeby).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Istnieje wiele różnych podejść do oceny wyników procedury tMCAo. W niniejszym materiale wykorzystano metody obrazowania neurologicznego in vivo (MRI) oraz testy behawioralne.
U myszy powstają zmiany niedokrwienne w mózgu, obejmujące głównie obszar unaczyniony przez MCA po stronie ipsilateralnej względem zamknięcia naczynia, taki jak prążkowie i grzbietowo-boczna kora. Istnieje kilka metod określania zakresu zmiany, w tym barwienie tkanek chlorkiem 2,3,5-trifenylotetrazoliem (TTC), bar...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Zabieg tMCAo śródświetlnego jest najczęściej stosowanym modelem ogniskowego niedokrwienia mózgu z reperfuzją w badaniach podstawowych. Obecnie myszy są preferowanym modelem zwierzęcym ze względu na dostępność genetycznie modyfikowanych szczepów. Jednak ważne jest, aby przyznać, że genetycznie zmodyfikowane myszy i ich tło genetyczne mogą wpływać na unaczynienie mózgu. Obecność krążenia pobocznego i zespoleń między różnymi obszarami tętniczymi może znacząco wpływać na wyniki procedur eksperymentalnych11<...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.
Podziękowania
Badanie wspierane przez grant PID2020-113202RB-I00 finansowany przez Ministerio de Ciencia e Innovación (MCIN)/Agencia Estatal de Investigación (AEI), Gobierno de España/10.13039/501100011033 oraz "Europejski Fundusz Rozwoju Regionalnego (EFRR). Sposób na tworzenie Europy". NCC i MAR odbyły stypendia przeddoktoranckie (odpowiednio PRE2021-099481 i PRE2018-085737) ufundowane przez MCIN/AEI/ 10.13039/501100011033 oraz przez "Europejski Fundusz Społeczny (EFS) Inwestowanie w swoją przyszłość". Dziękujemy Francisce Ruiz-Jaén i Leonardo Márquezowi-Kisinousky'emu za ich wsparcie techniczne. Dziękujemy za wsparcie ze strony ośrodka obrazowania MRI Institut d'Investigacions Biomèdiques August Pi i Sunyer (IDIBAPS). Program Centres de Recerca de Catalunya (CERCA) Generalitat de Catalunya wspiera IDIBAPS.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Szew 6/0 | Arago | Ligatury naczyniowe | |
| 6/0 szew z zakrzywioną igłą | Arago | Szwy skórne | |
| 9 mg/ml Saline | Fresenius Kabi | CN616003 EC | Do nawodnienia |
| System anestezjologiczny | SurgiVet | ||
| Blunt zwijacze o szerokości 1 mm | Fine Science Tools | 18200-09 | |
| Buprenorfina | Buprex | Do ulga w bólu | |
| Zacisk do nakładania kleszczy | Fine Science Tools | S& T CAF4 | |
| Dumont mini kleszcze | Fine Science Tools | M3S 11200-10 | |
| Kleszcze | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| Klej | Loctite | Do przyklejania sondy LDF do czaszki | |
| Miernik siły chwytu | IITC Life Science Inc. | #2200 | |
| Isoflurane | B-Braun | CN571105.8 | |
| LDF Perimed | Perimed | Periflux System 5000 | |
| LDF Uchwyty na sondy | Perimed | PH 07-4 | |
| Taśma | |||
| Magnes MRI | Bruker BioSpin, Ettlingen, Niemcy | Poziomy skaner zwierząt BioSpec 70/30 | |
| Uchwyt igły z obcinaczem do szwów | Fine Science Tools | 12002-14 | |
| Filament nylonowy | Doccol | 701912PK5Re | |
| Klatka regeneracyjna z poduszką | |||
| Nożyczki sirgical | Fine Science Tools | 91401-12 | |
| Zestaw kauteryzatora do małych naczyń | Fine Science Tools | 18000-00 | |
| Mikroskop stereoskopowy i zimne światło | Leica | M60 | |
| Kleszczyki do wiązania szwów | Fine Science Tools | 18025-10 | |
| Termostat, sonda doodbytnicza i podkładka pod mysz | Letica Science Instruments | LE 13206 | |
| Nożyczki sprężynowe Vannas (krawędź tnąca 4 mm) | Fine Science Tools | 15019-10 | |
| Zaciski naczyniowe | Fine Science Tools | 00396-01 |
Bibliografia
- Siddiqi, A. Z., Wadhwa, A. Treatment of acute stroke: current practices and future horizons. Cardiovascular Revascularization Medicine. 49, 56-65 (2023).
- Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 1, 53-60 (1981).
- Koizumi, J., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema. A new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Japanese Journal of Stroke. 8, 1-8 (1986).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, R., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
- Hossmann, K. A. Cerebral ischemia: Models, methods, and outcomes. Neuropharmacology. 55, 257-270 (2008).
- Seto, A., et al. Induction of ischemic stroke in awake freely moving mice reveals that isoflurane anesthesia can mask the benefits of a neuroprotection therapy. Frontiers in Neuroenergetics. 6, 1(2014).
- Díaz-Marugan, L., et al. Poststroke lung infection by opportunistic commensal bacteria is not mediated by their expansion in the gut microbiota. Stroke. 54 (7), 1875-1887 (2023).
- Xie, L., Kang, H., Nedergaard, M. A novel model of transient occlusion of the middle cerebral artery in awake mice. Journal of Natural Sciences. 2 (2), e176(2016).
- Arbaizar-Rovirosa, M., et al. Aged lipid-laden microglia display impaired responses to stroke. EMBO Molecular Medicine. 15 (2), e17175(2023).
- Orsini, F., et al. Targeting mannose-binding lectin confers long-lasting protection with a surprisingly wide therapeutic window in cerebral ischemia. Circulation. 126 (12), 1484-1494 (2012).
- Majid, A., et al. Differences in vulnerability to permanent focal cerebral ischemia among 3 common mouse strains. Stroke. 31, 2707-2714 (2000).
- Rogers, D. C., Campbell, C. A., Stretton, J. L., Mackay, K. B. Correlation between motor impairment and infarct volume after permanent and transient middle cerebral artery occlusion in the rat. Stroke. 28, 2060-2065 (1997).
- Hedna, V. S., et al. Validity of Laser Doppler flowmetry in predicting outcome in murine intraluminal middle cerebral artery occlusion stroke. Journal of Vascular and Interventional Neurology. 8 (3), 74-82 (2015).
- Yin, L., et al. Laser speckle contrast imaging for blood flow monitoring in predicting outcomes after cerebral ischemia-reperfusion injury in mice. BMC Neuroscience. 23, 80(2022).
- Thakkar, P. C., et al. Therapeutic relevance of elevated blood pressure after ischemic stroke in the hypertensive rats. Hypertension. 75 (3), 740-747 (2020).
- Yu, X., Feng, Y., Liu, R., Chen, Q. Hypothermia protects mice against ischemic stroke by modulating macrophage polarization through upregulation of interferon regulatory factor-4. Journal of Inflammation Research. 14, 1271-1281 (2021).
- Denorme, F., Portier, I., Kosaka, Y., Campbell, R. A. Hyperglycemia exacerbates ischemic stroke outcome independent of platelet glucose uptake. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 19, 536-546 (2021).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
