Przejściowy model niedrożności tętnicy środkowej mózgu

Udar mózgu jest wyniszczającą chorobą, która według WHO dotyka około 15 milionów ludzi na całym świecie rocznie. Około jedna trzecia pacjentów ulega tej chorobie, a kolejna jedna trzecia doświadcza trwałej niepełnosprawności. Udar mózgu to złożona patologia obejmująca różne typy komórek, takie jak nerwowe i obwodowe komórki odpornościowe, naczynia krwionośne i reakcje ogólnoustrojowe¹. Skomplikowanej sieci reakcji wywołanych udarem na poziomie systemów nie można obecnie odtworzyć przy użyciu modeli in vitro. W związku z tym eksperymentalne modele zwierzęce są niezbędne do zagłębienia się w mechanizmy choroby oraz do opracowania i przetestowania nowych terapii. Obecnie wczesna reperfuzja tkanek jest jedyną zatwierdzoną interwencją, albo poprzez trombolizę z tkankowym aktywatorem plazminogenu (tPA), albo trombektomię wewnątrznaczyniową¹.

Niedrożność tętnicy środkowej mózgu (MCA) jest częsta u pacjentów po udarze. W związku z tym modele przejściowej okluzji MCA (tMCAo) u gryzoni zostały początkowo opracowane u szczurów^2,3,4. Obecnie myszy modyfikowane genetycznie są najczęściej wykorzystywanymi zwierzętami w eksperymentalnych modelach udaru. W tym badaniu opisujemy minimalnie inwazyjny model śródświetlnego tMCAo u myszy. Dostęp wykonuje się przez tętnicę szyjną na poziomie szyi, bez kraniektomii.

Czas trwania okresu okluzji jest krytycznym czynnikiem, który określa zakres zmiany niedokrwiennej. Nawet krótkie okluzje trwające 10 minut mogą powodować selektywną śmierć neuronów bez widocznego zawału, podczas gdy dłuższe okluzje, zwykle trwające od 30 do 60 minut, powodują pewien stopień zawału mózgu. W przeciwieństwie do bliższych i dystalnych gałęzi MCA, które zaopatrują korę i mają uboczne, tętnice soczewkowato-prążkowiowe dostarczające krew do prążkowia nie mają zabezpieczeń pobocznych⁵. W konsekwencji dochodzi do większego zmniejszenia przepływu krwi w prążkowiu niż w korze po tMCAo. Tak więc okluzje trwające 30 minut lub krócej na ogół wpływają na prążkowie, ale nie na korę, podczas gdy dłuższe okluzje, od 45 minut, często generują zmianę niedokrwienną na całym terytorium MCA, w tym na prążkowiu i korze grzbietowo-bocznej.

Aby zapewnić dobre samopoczucie myszy, podajemy leki przeciwbólowe przed zabiegiem i używamy znieczulenia podczas operacji. Niemniej jednak znieczulenie może potencjalnie wprowadzić sztuczne zmiany w fizjologii myszy i wpłynąć na niektóre miary wyników⁶. Interwencja chirurgiczna, gdy jest wykonywana przez doświadczony personel, trwa zwykle około 15 minut w celu wywołania MCAo. Następnie całkowity czas pod narkozą zależy od okresu okluzji. W przypadku eksperymentów, w których minimalizacja znieczulenia ma kluczowe znaczenie, alternatywnym krokiem w procedurze jest przerwanie znieczulenia w okresie okluzji i ograniczenie go tylko do etapów chirurgicznych polegających na wprowadzaniu i wyjmowaniu włókna zamykającego MCA. Takie podejście skraca czas trwania znieczulenia i minimalizuje jego potencjalny wpływ na model eksperymentalny^7,8. Dlatego metoda indukowania przejściowego ogniskowego niedokrwienia jest prezentowana przez wewnątrzświetlną okluzję MCA w dwóch wariantach: ze znieczuleniem myszy przez cały okres okluzji lub z myszą obudzoną w tym okresie. W obu przypadkach pozorowana operacja powinna być wykonywana równolegle z interwencją przeprowadzaną na niedokrwionych myszach. Dodatkowo dostarczane są dane dotyczące oceny wyników mierzone za pomocą testów behawioralnych i MRI w różnych punktach czasowych po reperfuzji. Na koniec omówiono główne czynniki, które należy wziąć pod uwagę podczas wdrażania procedury eksperymentalnej.

Praca na zwierzętach została przeprowadzona zgodnie z prawem katalońskim i hiszpańskim (Real Decreto 53/2013) oraz dyrektywami europejskimi, za zgodą komisji etycznej (Comité Ètic d'Experimentació Animal, CEEA) Uniwersytetu w Barcelonie oraz lokalnych organów regulacyjnych Generalitat de Catalunya. Badania są raportowane zgodnie z wytycznymi ARRIVE. Ta procedura jest przeznaczona do wykonywania u dorosłych myszy, począwszy od 8 tygodnia życia, bez ograniczeń wiekowych. Przykłady zabiegu chirurgicznego opracowanego na myszach C57BL/6 w wieku 10-12 tygodni znajdują się tutaj. Należy wziąć pod uwagę różnice anatomiczne w zależności od szczepu myszy.

1. Przygotowanie zwierząt

1. Przed rozpoczęciem zabiegu chirurgicznego zbierz i wysterylizuj wszystkie wymagane materiały i narzędzia. Przygotuj stół operacyjny ze wszystkimi niezbędnymi materiałami chirurgicznymi (wymienionymi w Tabeli materiałów).
2. Znieczulić zwierzę za pomocą inhalacji izofluranu w mieszaninie tlenu i podtlenku azotu (30%/70%).
3. Buprenorfinę (patrz Tabela Materiałów) podawać podskórnie w dawce 0,05 mg/kg masy ciała w celu złagodzenia bólu i dyskomfortu.
   UWAGA: Analgezja jest obowiązkowa, ale akceptowane są różne protokoły. Objawy bólu i dyskomfortu muszą być również kontrolowane w pierwszych dniach po MCAo (patrz krok 4). W razie potrzeby zastosuj rozwiązania korygujące.
4. Umieścić zwierzę w komorze indukcyjnej znieczulenia (patrz Tabela Materiałów) z 5% izofluranem, aż osiągnie stan głębokiego znieczulenia (utrata odruchu przy nakłuciu łapy i odruchu ocznego).
5. Umieść mysz na stole operacyjnym i zmniejsz poziom izofluranu do 1,5%, dostarczanego przez maskę na twarz. Zastosuj maść weterynaryjną, aby uniknąć suchości oczu podczas zabiegu.
6. Utrzymuj temperaturę ciała na poziomie 37 ± 0,5 °C kontrolowaną przez sondę doodbytniczą podłączoną do poduszki grzewczej (patrz tabela materiałów).
7. Ogol brzuszną część szyi i głowę (kalwarię) za pomocą elektrycznej maszynki do golenia. Ostrożnie usuń resztki sierści i trzykrotnie zdezynfekuj obszary skóry okrężnymi ruchami środkiem dezynfekującym na bazie jodu i 70% alkoholem.
   .

2. Ocena przepływu krwi w mózgu (CBF) za pomocą laserowej przepływomierza dopplerowskiego (LDF)

1. Nożyczkami wykonaj nacięcie na skórze głowy, w kierunku szwu strzałkowego, od uszu do obszaru między oczami.
2. Cofnij skórę i usuń okostną po prawej stronie czaszki.
3. Znajdź współrzędne (2,5 mm w bok od Bregmy) i przymocuj uchwyt Dopplera (patrz Tabela materiałów) za pomocą cyjanoakrylanu. Po wyschnięciu kleju podłącz sondę dopplerowską i sprawdź, czy odczyt sygnału jest prawidłowy.

3. Przejściowe zamknięcie tętnicy środkowej mózgu (tMCAo)

1. Obróć mysz do pozycji leżącej na plecach i przymocuj ją do stołu operacyjnego za pomocą taśmy medycznej.
2. Wykonaj nacięcie w linii środkowej na szyi. Odciągnij bocznie skórę i gruczoły ślinowe za pomocą retraktorów (patrz Tabela materiałów), aby odsłonić obszar tętnicy szyjnej.
3. Zidentyfikuj anatomię naczyniową wspólnej tętnicy szyjnej (CCA), ICA i ECA, a także różnych tętnic z nich wywodzących się (szczękowa i językowa, tarczyca górna, potyliczna i skrzydłowo-podniebienna) (Rysunek 1A).
4. Odłącz główne tętnice od sąsiedniej tkanki łącznej, aby można było się z nimi obchodzić.
   UWAGA: Zachowaj szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić nerwów, zwłaszcza nerwu błędnego, który biegnie równolegle do CCA.
5. Owinąć jedwabny szew 6-0 (patrz Tabela materiałów) wokół ECA w rozwidleniu szczęki/języka. Mocno zamocuj węzeł, aby trwale przerwać krążenie.
6. Przełóż drugi szew wokół tej samej tętnicy, między pierwszym węzłem a rozwidleniem CCA i utrzymuj ten węzeł luźno.
7. Umieść trzecią nić wokół CCA i zawiąż węzeł poślizgowy, który można łatwo rozwiązać.
   UWAGA: Można to również wykonać za pomocą klipsa naczyniowego, ale gwint zapewnia większy ruch i elastyczność. Na tym etapie można zaobserwować pierwszy spadek CBF w sygnale LDF.
8. Umieść klips naczyniowy (patrz Tabela materiałów) przerywając krążenie krwi z ICA.
9. Wykonaj małe nacięcie w ECA, w pobliżu obszaru, w którym znajduje się ciasny węzeł.
10. Wkładaj żyłkę, aż gruba powłoka całkowicie dostanie się do światła tętnicy.
11. Zaciśnij drugi węzeł, aby utrzymać żyłkę wewnątrz tętnicy i zapobiec wypchnięciu jej na zewnątrz przez ciśnienie wywierane przez krew (Rysunek 1B).
12. Usuń klips naczyniowy z ICA.
13. Przetnij ECA poniżej pierwszego węzła i obróć kikut, aby ustawić go w kierunku ICA (Rysunek 1C).
14. Przesuwaj żyłkę przez ICA aż do punktu, w którym MCA się rozgałęzia.
    UWAGA: Okluzja znajduje odzwierciedlenie w nagłym spadku przepływu krwi w odczycie LDF. Za udaną okluzję uważamy, gdy spadek CBF jest większy niż 70% od wartości podstawowej. Jeśli systemy pomiarowe CBF nie są dostępne, punkt okluzji można odnotować na podstawie oporu na wyprzedzenie, który u dorosłych myszy wynosi zwykle około 11 mm od rozwidlenia CCA.
    1. Jeśli znieczulenie jest kontynuowane w okresie okluzji, monitoruj mysz i utrzymuj ją pod stałą obserwacją przez 45 minut.
    2. W przypadku, gdy mysz zostanie obudzona w okresie okluzji, zszyj skórę szyi kilkoma szwami. Nie odłączając sondy LDF, umieść mysz w pudełku z kontrolowaną temperaturą, co pozwoli na powrót do zdrowia po znieczuleniu.
       UWAGA: Często zdarza się, że mysz wykazuje spontaniczne zachowanie krążące w tym okresie, co wskazuje na udaną okluzję.
    3. Po 40 minutach ponownie znieczulić mysz, postępując zgodnie z tymi samymi procedurami znieczulania i dezynfekcji, jak wskazano w punktach 1.4, 1.5 i 1.7. Umieść ją z powrotem na stole operacyjnym i zdejmij szwy z szyi.
15. Po 45 minutach okluzji poluzuj węzeł przytrzymujący żyłkę na miejscu. Pociągnij powoli i delikatnie za filament i sprawdź, czy następuje rekanalizacja tkanek.
16. Wyciągnij filament i zaciśnij węzeł, aby zapobiec utracie krwi.
17. Rozwiąż węzeł CCA. Upewnij się, że nie ma uszkodzeń ściany tętnicy.
18. Usuń zwijacze i zmień położenie mięśni, gruczołów i skóry. Zszyj skórę (6-0) i nałóż środek dezynfekujący.
19. Odłącz sondę Dopplera i odłącz uchwyt. Zszyj i zdezynfekuj skórę głowy.
20. W okresie rekonwalescencji po znieczuleniu pozostaw mysz w klatce wyposażonej w grzałkę, aby utrzymać temperaturę. Utrzymuj go pod stałą obserwacją, aż w pełni wyzdrowieje ze znieczulenia. Po odzyskaniu mysz może zostać ponownie umieszczona w klatce.
    UWAGA: Zdecydowanie zaleca się mieszkanie z wzbogaceniem społecznym. Jednak nigdy nie mieszaj myszy operowanych z myszami nieoperowanymi w tej samej klatce bez fizycznej separacji, aby zapobiec agresji.

4. Opieka pooperacyjna

1. Okresowo nadzoruj zwierzęta, postępując zgodnie z procedurami i przepisami ustalonymi zgodnie z lokalnymi przepisami. Zapewnij leczenie przeciwbólowe zgodnie z odpowiednim harmonogramem, aby zminimalizować ból po operacji.
   UWAGA: W niniejszym badaniu zastosowano ten sam środek przeciwbólowy co na początku interwencji (buprenorfina 0,05 mg/kg masy ciała) po 6 godzinach i 24 godzinach po zabiegu.
2. Dokonać eutanazji, gdy wskazują na to parametry nadzoru, zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami.
3. Codziennie monitoruj wagę zwierząt. Podawaj zwierzętom miękki pokarm w ciągu pierwszych kilku dni po zabiegu. Ponadto należy je nawodnić poprzez podskórne wstrzyknięcie soli fizjologicznej (200 μl) bezpośrednio po zabiegu, a następnie okresowo, jeśli zaobserwuje się, że mysz nie nawadnia się sama. Ułóż jedzenie i wodę w sposób łatwo dostępny dla zwierzęcia.
4. Po zakończeniu badania in vivo należy znieczulić myszy, poddać je eutanazji i usunąć tkankę mózgową w celu dalszej analizy histopatologicznej (w razie potrzeby).

Istnieją różne podejścia do oceny wyniku procedury tMCAo. Wykorzystuje się tu metody neuroobrazowania in vivo (MRI) i testy behawioralne.

Myszy rozwijają zmiany niedokrwienne w mózgu, głównie wpływające na obszar zaopatrywany przez MCA ipsilateralnie do okluzji, takie jak prążkowie i kora grzbietowo-boczna. Istnieje kilka metod określania zakresu zmiany, w tym barwienie tkanek chlorkiem 2,3,5-trifenylotetrazolu (TTC), barwienie histologiczne (hematoksylina / eozyna, octan tioniny) oraz metody neuroobrazowania in vivo, takie jak MRI. Rezonans magnetyczny został tutaj wybrany ze względu na jego nieinwazyjny charakter i możliwość wykorzystania tej samej tkanki do innych badań, zapewniając kompleksową ocenę zmiany u każdej myszy. Dodatkowo rezonans magnetyczny pozwala na wielokrotne pomiary u tych samych zwierząt, zwiększając odtwarzalność wyników i często zmniejszając liczbę zwierząt wymaganych do badania.

Ten sam protokół znieczulenia z izofluranem (indukcja 5%, utrzymanie 1,5%) był stosowany w sesjach MRI. Do oceny objętości zmiany zastosowano szybką sekwencję ważoną T2 (T2w turbo RARE fast spin-echo)9 w celu zminimalizowania czasu znieczulenia zwierzęcia, co jest ważne, gdy badania podłużne z akwizycją MRI w różnym czasie mają być przeprowadzone u tych samych myszy. Procedura ta pozwala na ocenę zmian w zmianie chorobowej w czasie u tych samych zwierząt i jest bardzo przydatna, gdy jest stosowana m.in. do badań neuroprotekcyjnych lub do testowania skuteczności leków. Eksperymenty obrazowe przeprowadzono na poziomym skanerze zwierząt o temperaturze 7T. Specyfikacja techniczna sekwencji anatomicznej (może się różnić w zależności od natężenia pola magnetycznego): T2_TurboRARE; 22 odcinki koronalne; Grubość 0,5 mm; czas echa (TE) = 33 ms; czas powtórzenia (TR) = 2336,39 ms. 2 średnie. Kąt obrotu, 90°; pole widzenia (FOV) = 20 mm x 20 mm, przy rozmiarze matrycy 256 x 256. Rysunek 2A pokazuje reprezentatywny przykład obrazów MR ewolucji zmian u tej samej myszy, ocenianych po 40 min, 6 godzinach, 24 godzinach i 48 godzinach po reperfuzji. Progresja objętości zmiany trwa od kilku godzin do około dwóch dni. Kwantyfikacja objętości zmiany pokazuje tę ewolucję w czasie (Ryc. 2B).

Opisano różne skale neurologiczne do oceny upośledzenia neurologicznego spowodowanego uszkodzeniem niedokrwiennym. Sugerujemy stosowanie testów neuroscore, które zostały obszernie opisane w poprzednich manuskryptach. Na przykład zalecany jest test szczegółowo opisany przez Orsini et al. (2012)10.

Dostępna jest szeroka gama testów behawioralnych, głównie do wykrywania różnic w upośledzeniu funkcji motorycznych i sensorycznych. W tym celu wykorzystano test siły chwytu oraz test narożny. Test siły chwytu służy do oceny funkcji motorycznych. Siła kończyn przednich jest mierzona za pomocą miernika siły chwytu podłączonego do cyfrowego przetwornika siły (patrz Tabela Materiałów). Mysz trzyma się poziomego pręta obiema przednimi łapami, delikatnie ciągnąc go do tyłu przez ogon. Odnotowuje się maksymalną siłę chwytu przed zwolnieniem przednich łap. Na zwierzę przeprowadza się pięć prób, a główną wartość oblicza się po wykluczeniu wartości maksymalnej i minimalnej. Test narożny służy do wykrywania jednostronnych nieprawidłowości funkcji czuciowych i motorycznych. Aparat składa się z narożnika z dwiema deskami (30 cm × 20 cm × 1 cm) przymocowanymi pod kątem 30° i małym otworem na końcu. Mysz jest umieszczona w połowie skierowana w stronę rogu. Kiedy mysz wchodzi głęboko w róg, obie strony wibrysów są stymulowane razem. Następnie mysz odwraca się z powrotem, aby skierować się w stronę otwartego końca. W sumie na zwierzę przeprowadza się 10 prób, w których odnotowywane są wybrane strony. W warunkach fizjologicznych oczekuje się 50% skrętów w lewo i w prawo, podczas gdy u myszy z prawym MCAo oczekuje się preferencji w prawo. Próba jest uważana za ważną, gdy zostanie osiągnięty pełny obrót lub gdy mysz obróci głowę ≥ 90º. Wyniki są pokazane jako procent skrętów w prawo (ipsilateralnych).

Przedstawiono reprezentatywne wyniki pokazujące utratę siły wykazywaną przez myszy 24 godziny po tMCAo mierzoną testem siły chwytu (Rysunek 3A), a także ich preferencję do skrętu w bok ipsilateralnie do zmiany po stymulacji w teście narożnym (Rysunek 3B). Wykonanie testów behawioralnych w tym samym dniu operacji może być mniej precyzyjne, ponieważ niektóre parametry mogą ulec zmianie ze względu na bliskość znieczulenia i okres pooperacyjny.

Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie drzewa naczyniowego szyi (prawa strona). (A) Obraz pokazuje główne tętnice (tętnica szyjna wspólna-CCA, tętnica szyjna zewnętrzna-ECA, tętnica szyjna wewnętrzna-ICA) oraz różne gałęzie (tętnica skrzydłowo-podniebienna Pt; Tętnica potyliczna Occ; Tętnica tarczycowa górna St; Tętnice szczękowe i językowe Max/Lin). (B) Pierwsze etapy zabiegu chirurgicznego, w którym CCA jest podwiązane szwem, krążenie ICA jest przerywane przez zacisk naczyniowy, a monofilament jest wprowadzany przez ECA. (C) Zmiana orientacji ECA w celu wypchnięcia przędzy monofilamentowej do strefy okluzji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Reprezentatywne obrazy MR. (A) Obrazy T2-w tej samej myszy w różnych punktach czasowych po reperfuzji pokazują ewolucję zmiany w ostrej fazie. Obszar dotknięty zawałem zwiększa się gwałtownie w ciągu pierwszych godzin, a następnie ulega niewielkim zmianom. (B) Ewolucja objętości zmiany chorobowej w ostrej fazie po MCAo. Każdy słupek reprezentuje średnią ± SD procentową (%) objętości zmiany. Objętość zmiany zwiększa się istotnie w ciągu pierwszych 24 godzin po reperfuzji (*p = 0,0182; **p = 0,0088; 1-czynnikowy test ANOVA/ Kruskala-Wallisa). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Testy behawioralne przed (podstawowym) i 24 godziny po tMCAo (n = 16 myszy). (A) Test siły chwytu pokazuje maksymalną (Max.) siłę na mysz. (B) Test zakrętów pokazuje procent (%) skrętów w prawo. Wykresy pokazują pole i wąsy (wartości minimalne do maksymalnych) na grupę, a punkty odpowiadają poszczególnym myszom (****p < 0,0001; Test rangi podpisany przez Wilcoxona). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.