Pobieranie krwi sercowej przez nakłucie podobojczykowe u myszy

Pobieranie krwi od myszy jest niezbędne w badaniach naukowych i innych dziedzinach¹. Metody pobierania krwi nieterminalne, w tym pobieranie próbek z żyły ogonowej, udowej i podżuchwowej, zapewniają zalety w powtarzalności, ale niosą ze sobą potencjalne ryzyko uszkodzenia tkanek, stresu zwierzęcego oraz obniżonej jakości próbki². W procedurach terminalnych często stosuje się punkcję serca oraz pobieranie krwi z dużych naczyń do pobrania dużych próbek krwi, które zazwyczaj dają około 50% całkowitej objętości krwi ^3,4.

Pobieranie krwi z dużych naczyń wymaga nacięcia chirurgicznego i wiąże się z wysokim ryzykiem krwawienia. Natomiast punkcja serca jest małoinwazyjna, zmniejsza stres zwierzęcia i jest stosunkowo prosta do wykonania⁵. Dzięki bezpośredniemu pobieraniu krwi z serca ta metoda zapewnia szybki przepływ krwi, minimalizując ryzyko krzepnięcia i poprawiając jakość próbki⁶. W związku z tym preferowaną techniką w eksperymentach terminalnych jest nakłucie serca⁷.

W tym badaniu zastosowaliśmy podobojczykowe podłączenie do punkcji serca. W porównaniu z tradycyjnymi metodami nakłuwania, to podejście oferuje bardziej precyzyjną trajektorię igły. Igła przechodzi kolejno przez skórę, tkankę podskórną i mięśnie piersiowe, wchodzi do jamy piersiowej i dociera do komory sercowej w celu pobierania krwi. Na przykład nakłucie brzucha może powodować uszkodzenie wątroby, co może zmienić składniki krwi, takie jak białka surowiczne, czynniki krzepnięcia i enzymy metaboliczne⁸.

Dodatkowo uszkodzenie wątroby może prowadzić do podwyższonych poziomów aminotransferazy alaninowej (ALT) i aminotransferazy asparaginowej (AST), co dodatkowo zakłóca wyniki eksperymentalne⁹. W praktyce podobojczykowe podłączenie jest szczególnie odpowiednie do eksperymentów wymagających nienaruszonej tkanki wątroby, precyzyjnej oceny funkcji wątroby lub czułego pomiaru białek i metabolitów. Jednak jest mniej odpowiedni dla bardzo młodych lub małych myszy, gdzie struktury anatomiczne trudno zobrazować, oraz do badań wymagających nienaruszonej tkanki sercowej, ponieważ nakłucie może utrudniać późniejsze analizy.

Wszystkie procedury na zwierzętach w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Instytucjonalnych (IACUC) i przeprowadzone zgodnie z Wytycznymi dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych w Chinach. Badanie ściśle przestrzegało przepisów etycznych dotyczących eksperymentów na zwierzętach i zostało zatwierdzone przez Komitet Etyki Zwierząt (Numer Zatwierdzenia: YD20250310007). W badaniu wzięto łącznie 14 zdrowych myszy C57BL/6 (siedem samców i siedem samic), o masie ciała od 21 g do 29 g. Zwierzęta były przechowywane w Centrum Zwierząt Laboratoryjnych Uniwersytetu Yanbian w standardowych warunkach laboratoryjnych.

1. Zwierzęta

1. Po końcowym pobieraniu krwi sercowej natychmiast uśpić myszy przez przedawkowanie izofluranu w komoře indukcyjnej (5%), aż do zaobserwowania zatrzymania oddechu i utraty odruchów nocyceptywnych. Potwierdz śmierć przez brak spontanicznego oddychania i aktywności serca.
   UWAGA: Należy obchodzić się z igłami ostrożnie, aby zapobiec uszkodzeniom igłą, a wszystkie użyte ostre przedmioty natychmiast wyrzucać do wyznaczonych pojemników na ostre przedmioty. Utylizować odpady biologiczne i zwłoki zwierząt w wyznaczonych pojemnikach na zagrożenia biologiczne.

2. Przygotowanie eksperymentalne

1. Przygotuj do eksperymentu następujące materiały: strzykawkę 2 mL z igłą 25 G, etanol 75%, rurki mikrowirówki 1,5 mL z regałem na rurki, heparynę, chłodniczkę niskotemperaturową, wagę elektronową, wirówkę 4 °C, pipetę i końcówki pipet.
2. Do pobierania krwi sercowej u myszy należy używać strzykawki o pojemności 2 mL ze względu na optymalną objętość, stabilną kontrolę, większą elastyczność operacyjną oraz zmniejszone ryzyko krzepnięcia krwi.
3. Przepłucz strzykawkę roztworem heparyny (0,3 mL, 1 250 U/mL), aby zapobiec krzepnięciu krwi.

3. Przygotowanie i pozycjonowanie myszy

1. Wybierz zdrowe myszy i zważ je.
2. Podawaj znieczulenie wziewne z użyciem izofluranu. Umieść mysz w komorze indukcyjnej i wystaw ją na działanie 5% gazu izofluranowego aż do pełnego znieczulenia. Potwierdź znieczulenie, gdy spełnione są następujące kryteria: utrata odruchu prostowania, utrata odruchu bólowego.
3. Monitoruj oddychanie, kolor skóry i odruchy przez cały zabieg, aby zapewnić odpowiednią znieczulenie.

4. Procedura nakłucia

1. Ustaw mysz w pozycji leżącej i mocno przymocuj ją do platformy operacyjnej, stabilizując przednie kończyny (Rysunek 1). Dezynfekuj okolicę klatki piersiowej 75% etanolem, zapewniając prawidłową identyfikację wyrostka keksfoidalnego i lewej obojczyka (Rysunek 2).
   UWAGA: Podczas stosowania etanolu unikaj kontaktu z ustami i nosem myszy, aby zapobiec wdychaniu oparów alkoholu, które mogą powodować niedotyki oddechowe.
2. Trzymaj strzykawkę tak, że igła jest skierowana w dół.
   UWAGA: Głównym powodem takiej orientacji jest poprawa stabilności operacyjnej, gdy mysz jest unieruchomiona w pozycji leżącej, co zmniejsza ruch igły i błąd pobierania podczas pobierania krwi.
3. Włóż strzykawkę 2 mL z linii środkowej poniżej lewego obojczyka, kierując igłę w kierunku wyrostka ksifoidalnego (Rysunek 2 i Rysunek 3).
4. Przesuwaj igłę na głębokość 1-1,5 cm, trzymając strzykawkę równolegle do stołu operacyjnego.
5. Potwierdź prawidłowe położenie igły w komorze serca, obserwując pulsujący powrót krwi do strzykawki.
   UWAGA: Operator powinien utrzymywać stabilną rękę, aby zapobiec przesunięciu igły lub zbyt głębokiemu wbiciu się w środek.

5. Pobieranie krwi

1. Gdy igła jest prawidłowo ustawiona, powoli cofnij tłok strzykawki, aby pobrać krew. Utrzymuj stabilną rękę przez cały proces pobierania krwi, aby zapobiec ruchowi igły, co może zakłócić przepływ krwi.
   UWAGA: Jeśli przepływ krwi jest niewystarczający, drobne korekty kąta strzykawki mogą pomóc poprawić pobieranie strzykawki. Jednak unikaj częstego przestawiania igły, aby zminimalizować błędy eksperymentalne i zmniejszyć ryzyko uszkodzenia tkanek.

6. Przetwarzanie próbek

1. Natychmiast przełóż próbkę krwi do preheparyzowanej probówki, aby zapobiec krzepnięciu i zachować integralność próbki.
2. Wiruj próbkę krwi w temperaturze 4 °C przez 15 minut przy dawce 2 000 × g , aby skutecznie oddzielić osocze od krwinek.
3. Po wirowaniu zbadaj próbkę pod kątem wyraźnego rozdzielenia osocza i krwinek (Rysunek 4A). Zapisz stan próbki, aby upewnić się, że spełnia wymagania eksperymentalne (rysunek 4B).
4. Za pomocą pipety ostrożnie wyekstrahuj supernatant (plazmę) i przelej go do nowej rurki. Odpowiednio oznacz tubę do dalszej analizy lub przechowywania.

7. Testowanie próbek

1. Przeanalizuj przygotowane próbki osocza pod kątem poziomu AST i ALT za pomocą zestawu do testów ELISA.

W tym badaniu przeprowadziliśmy powtarzane eksperymenty na 14 myszach C57BL/6 (21-29 g), z siedmioma samcami i siedmioma samicami. Badania wskazują, że szacowana objętość krwi u dorosłej myszy wynosi 55 do 70 mL/kg masy ciała10. Objętość pobrana na sesję wynosiła od 700 do 1 200 μL, co stanowiło około 50% całkowitej objętości krążącej krwi (Rysunek 5). Czas pracy na sesję wynosił od 60 do 80 sekund. W żadnej z pobranych próbek nie zaobserwowano hemolizy ani skażenia próbek. Zmierzono poziomy ALT i AST w osoczu (Rysunek 6), przy czym wszystkie wyniki mieściły się w normie (ALT: 30-70 U/L; AST: 50-100 U/L)11. Co warte odnotowania, jedna samica i jeden samiec z siedmiu w każdej grupie wymagały drugiej próby, podczas gdy wszystkie pozostałe myszy zostały pomyślnie pobrane za pierwszym razem. Statystyczne porównania między płciami przeprowadzono za pomocą testu t ucznia, bez istotnych różnic między płciami. Wielkość próby została wybrana przede wszystkim w celu weryfikacji wykonalności i powtarzalności metody nakłucia serca podobojczykowego. Jednak niewielka próba (n = 7 na grupę), określana przez względy etyczne i regulacyjne w ramach zasady 3R (redukcja, udoskonalenie, zastąpienie), zmniejsza statystyczną siłę porównań opartych na płci.

Rysunek 1: Znieczulona fiksacja myszy. Ilustracja pokazująca prawidłową stabilizację przednich kończyn myszy, aby zapewnić stabilność podczas kolejnych zabiegów. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 2: Pobieranie krwi sercowej za pomocą nakłucia podobojczykowego u myszy. Strzykawka jest wkładana w linii środkowej poniżej lewego obojczyka, a igła kieruje się w stronę wyrostka ksifoidalnego. Głębokość włożenia jest utrzymwana na poziomie 1-1,5 cm, co zapewnia, że strzykawka pozostaje równoległa do stołu operacyjnego. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 3: Pobieranie krwi sercowej. (A) Igła jest utrzymwana pod lekkim podciśnieniem po włożeniu. (B) Po prawidłowym umieszczeniu igły w komorze serca, krew trafia do strzykawki w sposób pulsujący. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 4: Wirowanie krwi i rozdzielanie osocza. (A) Po wirowaniu próbka krwi rozdziela się na wyraźne warstwy: czerwone krwinki na dole, środkową warstwę płytek krwi i białych krwinek oraz osocze na górze. (B) Oddzielona plazma jest ostrożnie przenoszona do oznakowanych rurek mikrowirówek. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 5: Pomiar objętości pobranej krwi, osocza, krwinek oraz resztkowej objętości krwi. Parametry pobierania krwi oceniano u 14 myszy C57BL/6 (7 samców i 7 samic). Nie zaobserwowano istotnej różnicy w objętości pobrania krwi między mężczyznami a kobietami (P = 0,7042, n = 7). Dane są przedstawiane jako średnie ± SEM. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego wykresu.

Rysunek 6: Poziomy ALT i AST w osoczu u 14 myszy C57BL/6 (7 samców i 7 samic). ALT-M: poziomy ALT u samców myszy, ALT-F: poziomy ALT u samic myszy (P = 0,5754); AST-M: poziomy AST u samców myszy, AST-F: Poziomy AST u samic myszy (P = 0,4470). Nie zaobserwowano istotnych różnic między samcami a samicami, a wszystkie wartości mieściły się w normie dla myszy C57BL/6 (norma ALT: 30-70 U/L, AST norma: 50-100 U/L), n=7. Dane są przedstawione jako średnie ± SEM. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego wykresu.

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.