Odkrywanie zawiłości ksenofagii: Lekcje z Legionella pneumophila

Rozpowszechnienie szczepów bakterii opornych na leki sprawiło, że konieczne jest poszukiwanie nowych metod antybakteryjnych w walce z chorobami zakaźnymi. Autofagia, fundamentalny proces eukariotyczny polegający na rozwoju pęcherzyków fagocytowych zawierających białka komórkowe lub organelli, odgrywa istotną rolę w regulacji homeostazy komórkowej i różnych procesów metabolicznych¹. W miarę pogłębiania wiedzy o autofagii naukowcy odkryli, że pęcherzyki autofagiczne mogą selektywnie atakować konkretne organelle, białka lub patogeny². Ksenofagia odnosi się do procesu, w którym komórki selektywnie rozpoznają patogeny wewnątrzkomórkowe poprzez autofagię i dostarczają je do lizosomów w celu usunięcia³. Proces ten jest kluczowy dla mechanizmu obronnego wrodzonego układu odpornościowego u organizmów eukariotycznych⁴. W związku z tym wyjaśnienie mechanizmów i regulacji jest kluczowym obszarem badań, mającym istotne znaczenie dla rozwoju nowych strategii antyinfekcyjnych.

Legionella pneumophila to Gram-ujemny patogen wewnątrzkomórkowy, który zazwyczaj infekuje wodne jednokomórkowe protisty. Jednak ludzie mogą rozwinąć oportunistyczne infekcje w kontakcie z zanieczyszczoną wodą, prowadząc do choroby legionistów, ciężkiej formy zapalenia płuc⁵. Po wejściu do komórki gospodarza Legionella wykorzystuje system wydzielania typu IV (T4SS) do transportu około 330 białek efektorowych, co pomaga w unikaniu odpowiedzi immunologicznej gospodarza i zapewnia przeżycie oraz proliferację bakterii w komórkach. Legionella, podobnie jak Salmonella, utrudnia ksenofagię gospodarza za pomocą białek efektorowych, choć dokładny mechanizm molekularny nie został jeszcze ustalony⁶. Na przykład Salmonella Typhimurium dostarcza efektory wydzielania typu III (np. SopF), które ADP-rybosylują vakuolną V-ATPazę i blokują inicjację autofagii⁷, podczas gdy L. pneumophila wykorzystuje T4SS oraz efektory takie jak RavZ i SidE do zakłócania późniejszych stadiów ksenofagii ^6,8. Pomimo tych różnych taktyk, oba patogeny ostatecznie unikają oczyszczania ksenofagii, co podkreśla strategie zbieżności w unikaniu autofagii. Dlatego badanie tych białek zjadliwości nie tylko przyczynia się do rozwoju specyficznych terapii przeciwinfekcyjnych, ale także ma potencjał rzucić światło na molekularne zawiłości ksenofagii.

Mechanizmy ksenofagii w usuwaniu patogenów

W 1984 roku Rikihisa i in. dokonali istotnego odkrycia, że neutrofile zakażone riketcją produkują autofagosomy, co stanowi pierwszy przypadek udziału autofagii w infekcjach bakteryjnych⁹. Dalsze badania wykazały, że indukcja autofagii w makrofagach za pomocą rapamycyny prowadzi do współlokalizacji białek związanych z autofagią LC-3 i Beclin-1 z pęcherzykami zawierającymi Mycobacterium tuberculosis , co zapobiega proliferacji bakterii w komórkach¹⁰. Ponadto wiadomo, że patogeny wewnątrzkomórkowe, takie jak Salmonella typhi, Listeria, Shigella flexneri i Burkholderia mallei , indukują autofagię, co następnie kontroluje ich wzrost w komórkach gospodarza¹¹.

Ksenofagia, forma selektywnej autofagii, obejmuje trzy odrębne procesy: rozpoznawanie ładunku, rekrutację receptorów autofagii oraz degradację pośredniczoną przez lizosomy (jak pokazano na Rysunku 1). Jednak mechanizm, dzięki którym komórki rozpoznają najeźdźające patogeny (rozpoznanie ładunku) i inicjują autofagię, pozostaje niejasny. Badania sugerują, że gdy bakterie przenikają do cytoplazmy, ligaza ubikwityny przyczepia się do vakuoli lub białek zakażonych patogenami obecnych na powierzchni patogenów 12,13,14. Te oznakowane białka następnie łączą się w powłokę ubikwityną, otaczając patogen i działając jako platforma sygnalizacji do rekrutacji adaptatorów autofagii, głównie p62/SQSTM1, NDP52, NBR1 i optineuriny. Adaptory autofagii ułatwiają ksenofagię poprzez interakcję z białkami poprzez domenę oddziałującą LC3 (LIR), z wyjątkiem domeny wiążącej ubikwitynę (UBD), która pośredniczy w wiązaniu białek ubikwitynowanych¹⁵. Na przykład ligazy gospodarza E3, takie jak LRSAM1 i Parkin, przyczepiają ubikwitynę do atakujących bakterii, generując tym samym sygnał powłoki ubikwityny, który oznacza ich do usunięcia ksenofagii^16,17. Ponadto receptory ksenofagii mogą również inicjować ksenofagię poprzez wiązanie się z galektyną na powierzchni fagosomu bakterii lub bezpośrednią interakcję z białkami powierzchniowymi bakterii^18,19. Inna perspektywa zakłada, że bakterie wewnątrz fagosomu mogą zmieniać gradienty jonów pęcherzyka poprzez uszkodzenie błony, co prowadzi do zmian konformacyjnych w V-ATPazach błony fagosomowej, które rekrutują kompleks Atg5-Atg12-Atg16L1 poprzez wiązanie z domeną WD40 ATG16L1 ^7,20. ATG16L1 może również wiązać się do uzupełnienia C3, który pokrywa pochłonięte bakterie poprzez domenę WD40, rekrutując kompleks Atg5-Atg12-Atg16L1 do fagosomu bakteryjnego²¹. Wciąż nie jest jasne, czy te różne mechanizmy rozpoznawcze celują w różne gatunki bakterii, czy też występują na różnych etapach infekcji. Aby w pełni zrozumieć te mechanizmy, konieczne są dalsze badania i eksploracja.

Strategie patogenów mające na celu uniknięcie ksenofagii

Podczas współewolucji z gospodarzem patogeny wewnątrzkomórkowe wykształciły różne mechanizmy hamujące ksenofagię 22,23,24. Powoduje to słabą odpowiedź ksenofagiczną podczas infekcji, co utrudnia obserwację²⁵. Na przykład beta-hemolityczny Streptococcus wydziela proteazę cysteinową o nazwie SpeB, która celuje w p62, NDP52 i NBR1 w celu degradacji. Mutanci z delecją SpeB nie byli w stanie oprzeć się autofagii, a ich wzrost wewnątrz komórek był hamowany. Te odkrycia potwierdzają istotną rolę tych adaptorów autofagii w ksenofagii. Białko zjadliwości VirG Shigella flexneri wykazało indukcję ksenofagii poprzez rekrutację Atg5 na powierzchnię bakterii¹⁹. Jednak bakteria wykorzystuje również system wydzielania typu III do transportu białka efektorowego IcsB, który hamuje wiązanie ATG5 z VirG¹⁹. W konsekwencji autofagia zostaje powstrzymana¹⁹. Ta konkurencja między białkami bakteryjnymi a mechanizmem autofagii sugeruje, że białka Atg mogą bezpośrednio rozpoznawać białka powierzchniowe bakterii, aby zainicjować ksenofagię. Podobnie, białko zjadliwości CpbC Streptococcus pneumoniae indukuje autofagiczną degradację Atg14 poprzez tworzenie kompleksu p62-CpbC-Atg14, co z kolei obniża poziom Atg14. Dotyczy to kompleksu Atg14-STX17, który pośredniczy w interakcji lizosomów, hamując tym samym ksenofagię²⁶.

W badaniu wykorzystującym Salmonellę jako bakterię modelową Xu i in. odkryli, że uszkodzenie pęcherzyków błonowych spowodowane infekcją jest wykrywane przez V-ATPazę, która prowadzi do aktywacji ksenofagii poprzez wiązanie z domeną WD40 ATG16L1⁷. Ta aktywacja nie jest częścią typowej ścieżki autofagii. Ponadto białko zjadliwości SopF ma zdolność pośredniczenia w ADP-rybozylacji (ADPRylacji) V-ATPaz oraz hamowania ich zdolności do inicjowania ksenofagii⁷. Ilustruje to, jak bakterie i ich wydzielane białka zjadliwości mogą być wykorzystywane jako cenne narzędzia do badania i zrozumienia złożonych zjawisk oraz mechanizmów autofagii, które często są trudne do zbadania w normalnych warunkach fizjologicznych.

Legionella i ksenofagia

L. pneumophila tworzy niszę replikacyjną zwaną wakuolą zawierającą legionellę (LCV), manipulując istotnymi aktywnościami biologicznymi, takimi jak ubikwitynacja gospodarza²⁷, transport pęcherzyków²⁸, metabolizm energii²⁹ oraz ruchliwość komórek³⁰. Pomimo obecności licznych białek ubikwitynowanych w bakteriach wewnątrzkomórkowych³¹, Legionella rozwinęła różne mechanizmy przeciwdziałające autofagii, zapobiegając fuzji LCV z lizosomami ^6,8.

RavZ hamuje autofagię przez rozszczepienie LC3-II

Pierwszym białkiem efektorowym Legionella wykazanym jako regulujący autofagię jest RavZ (Lpg1683). Jako proteaza cysteina, RavZ rozszczepia wiązanie amidowe pomiędzy glicyną na końcu węgla a poprzednią aminokwasową resztą LC3, prowadząc do nieodwracalnego uszkodzenia lipidacji LC3⁸. W porównaniu z dzikim typem Legionella, mutowany szczep z delecją RavZ (ΔravZ) wykazał istotny wzrost poziomu LC3-II oraz liczby punktów LC3 w komórkach gospodarza po infekcji⁸. Genetycznie modyfikowany szczep Listerii (ΔhlyΔprfAcLLO) może wywołać silną odpowiedź ksenofagiczną po wejściu do komórek. Podczas współinfekowania komórek dziki typ Legionella może tłumić gromadzenie LC3 wokół szczepu ΔhlyΔprfAcLLO, ale ΔravZ traci zdolność hamowania indukcji ksenofagii⁶ przez szczep. Ponadto przejściowa ekspresja RavZ w komórkach gospodarza hamuje autofagię wywołaną głodem⁸. Wyniki te sugerują, że RavZ wywiera szeroki efekt transaktywujący (czyli rozpraszający się w cytosolu), antagonizując autofagię. Co zaskakujące, replikacja mutantaΔ ravZ nie została zmieniona w komórkach gospodarza i nie zaobserwowano rekrutacji LC3 na błonie LCV zawierającej mutantaΔ ravZ ^6,8. Te odkrycia sugerują, że Legionella może wykorzystywać inne białka efektorowe oprócz RavZ, aby unikać ksenofagii gospodarza.

Rodzina SidE i ksenofagia

Rodzina SidE składa się z czterech homologicznych białek o wielkości powyżej 170 kDa, nazwanych SdeA, SdeB, SdeC i SidE³². Te białka zjadliwości są strukturalnie podobne z redundancją funkcjonalną, a wszystkie zawierają domenę mono ADP-rybosyltransferazy (mART) oraz domenę fosfodiesterazy (PDE). Badania wykazały, że w przypadku braku enzymu aktywującego ubikwitynę (E1) i enzymu sprzęgającego ubikwitynę (E2), rodzina SidE funkcjonuje jako niezależna ligaza ubikwitynowa (E3), katalizując unikalną modyfikację ubikwitynacji fosforybozyli (PR-Ub) substratów 33,34,35. Proces ten przebiega w dwóch etapach. Weźmy SdeA jako przykład, najpierw SdeA modyfikuje resztę Arg42 ubikwityny (Ub) grupą rybozy adenozinodifosforanu (ADPR) pochodzącą z NAD+ przy użyciu domeny mART, generując produkt pośredni ADPR-Ub^33,36. Następnie wiązanie fosfodiestrowe ADPR-Ub jest rozszczepiane przez funkcjonalną domenę PDE SdeA, co skutkuje uwolnieniem AMP i połączeniem PR-Ub z resztą serynową białka^{substratu 36}.

Rodzina SidE posiada liczne eukariotyczne substraty białkowe. Oprócz pośrednictwa w ubikwitynacji fosforybozyla u GTPaz, takich jak Rab1A, Rab6A i Rab33B, w celu zakłócenia transportu pęcherzyka^33,37, najnowsze badania wykazały, że rodzina SidE ma również funkcje antagonistyczne wobec ksenofagii 6,38,39,40. W porównaniu z dzikim typem Legionella, zmutowane szczepy pozbawione genów kodujących rodzinę SidE (ΔsidE) wykazują istotny wzrost rekrutacji p62 na LCV⁶. W przeciwieństwie do RavZ, który działa w trans, rodzina SidE działa w cis (działając lokalnie w LCV), chroniąc własną wakuolę Legionelli przed ksenofagią. Legionella transportująca białka rodziny SidE nie jest w stanie powstrzymać rekrutacji p62 wokół współzakażonych szczepów ΔlyΔprfAcLLO Listeria ⁶. Podobnie jak szczepravZ Δ, mutantΔ sidEs również może unikać ksenofagii gospodarza. Mechanizm, w jaki SidE antagonizuje ksenofagię, nie jest jasny i może być powiązany z jego ingerencją w system ubikwitynacji gospodarza, pośredniczoną przez ubikwitynację fosforybozylu. Na przykład fosforybosylacja ubikwityny przez SidE mogłaby uniemożliwić rozpoznanie LCV przez receptory wiążące ubikwitynę, blokując tym samym rekrutację adaptorów takich jak NDP52 czy optineurina do vakuoli.

Inne efektory zaangażowane w ksenofagię

Oprócz RavZ i SidE, L. pneumophila koduje inne efektory – w tym LpSpl, Lpg1137 i Lpg2936 – które celują w różne etapy szlaku autofagii. LpSpl to enzym wydzielany naśladujący liazę sfingozyny-1-fosforanową, rozszczepiając sfingozynę-1-fosforan (S1P) na metabolity⁴¹. To wyczerpanie S1P przez LpSpl zapobiega gromadzeniu się sfingozyny i prowadzi do aktywacji mTORC1, hamując tym samym inicjację autofagii⁴¹. Lpg1137 to proteaza, która rozszczepia białko SNARE Syntaxin 17 (Stx17), niezbędne do fuzji autofagosom-lizosomów⁴². Poprzez degradację Stx17, Lpg1137 zakłóca dojrzewanie autofagosomów i blokuje ostatni etap fuzji ksenofagii⁴². Lpg2936 to efektor jądrowy, który powoduje epigenetyczne modyfikacje genów związanych z autofagią (takich jak ATG7 i LC3B), prowadząc do obniżonej ekspresji⁴³. To obniżenie poziomu rdzeniowych komponentów autofagii hamuje biogenezę autofagosomów na poziomie^{transkrypcyjnym 43}. Jednak niewiele wiadomo o roli LpSpl, Lpg1137 i Lpg2936 w infekcji Legionellą ; Ich wkład w unikanie ksenofagi in vivo pozostaje do pełnej odpowiedzi.

Tabela 1 podsumowuje kluczowe efektory L. pneumophila zaangażowane w tłumienie ksenofagii, ich cele i funkcje oraz stadia ksenofagii, na które wpływają.

Perspektywa przyszłości

Pozostają kluczowe niepewności i sugerują konkretne kolejne kroki. Po pierwsze, hierarchia czasowa efektorów Legionella działających na ksenofagię pozostaje nierozstrzygnięta (wczesny LpSpl/mTORC1 kontra średni/późny RavZ, SidE); po drugie, kilka efektorów modulujących autofagię (np. LpSpl, Lpg2936) nie posiada walidacji in vivo ; Po trzecie, heterogeniczność odpowiedzi ksenofagicznych według typów komórek pomiędzy podzbiorami makrofagów, nabłonkiem i neutrofilami jest słabo zmapowana. Proponujemy atlasy zakażeń o rozdzieleniu czasowym (pulse-chase, lipidomika LC3, proteomika PR-ubikwityny, reporterzy na żywo) do porządkowania działań efektorowych; parowane szczepy delecyjne efektora (ΔravZ/ΔsidE/ΔlpSpl/Δlpg2936) w specyficznych dla typu komórki modelach myszy w celu ustalenia przyczynowości; oraz multiomiki pojedynczej komórki/przestrzennej oraz CRISPR/perturb-seq skupiających się na osi V-ATPazy-ATG16L1, tagowaniu LRSAM1/Parkin oraz modułach adaptacyjnych (OPTN/NDP52/p62). Translacjonalnie przewidujemy inhibitory skierowane na efektory, które blokują RavZ (aktywne miejsce proteazy cysteinowej) lub SidE (mART/PDE PR-UBIKWITYNACJA), ABY PRZYWRÓCIĆ PULE LC3-II i rekrutację adaptatorów na LCV, obok boosterów skierowanych do gospodarza, które wzmacniają oznakowanie ładunku (aktywują LRSAM1/Parkin), stabilizują zaangażowanie adaptera-LC3 i przejściowo dostroją strumień (aktywacja TFEB, moderowany mTORC1). Dostarczanie ukierunkowane na płuca (np. wdychane nanocząstki łączące środek anty-RavZ/SidE z agonistą TFEB) powinno być porównywane za pomocą odczytów oznaczonych czasowo i typu komórek (strumień LC3, zajętość PR-Ub, rekrutacja adaptora, metryki fuzji) oraz skuteczność in vivo (obciążenie bakteriami, patologia, przeżywalność).

L. pneumophila wypracowała imponujący zestaw strategii unikania ksenofagii, głównie dzięki różnorodnym białkom efektorowym, które zakłócają rozpoznawanie ładunku, ubikwitynację, dojrzewanie autofagosomów oraz fuzję lizosomalną. Mechanizmy te nie tylko umożliwiają patogenowi przetrwanie i replikację w komórkach gospodarza, ale także ujawniają nowe aspekty regulacji autofagii. Zrozumienie tych taktyk unikania daje cenne informacje o złożonym współdziałaniu między obroną gospodarza a adaptacją mikroorganizmów. Przyszłe badania powinny koncentrować się na identyfikacji dodatkowych efektorów, wyjaśnieniu ich celów molekularnych oraz wyjaśnieniu ich regulacji czasowej podczas infekcji. Co więcej, wykorzystanie tych mechanistycznych wniosków mogłoby kierować rozwojem terapii ukierunkowanych na gospodarza lub nowych środków przeciwdrobnoustrojowych przywracających funkcję ksenofagii. Dalsza integracja zaawansowanych metod obrazowania, biologii strukturalnej i omiki będzie kluczowa dla analizy dynamicznych interakcji między L. pneumophila a aparaturą autofagii, co może prowadzić do powstania innowacyjnych strategii zwalczania patogenów wewnątrzkomórkowych.

Wreszcie, wiele efektorów Legionella działa wielofunkcyjnie, wpływając na wiele procesów gospodarza poza autofagią. Te same efektory, które pomagają L. pneumophila unikać ksenofagii, mogą również modulować śmierć komórek gospodarza (apoptozę) oraz szlaki sygnalizacji immunologicznej, co dodatkowo wspiera przeżywalność bakterii23,30,35,44,45. To przenikanie się między unikaniem autofagii a innymi mechanizmami obrony gospodarza podkreśla potrzebę holistycznego badania taktyk zjadliwości Legionelli. Zbadanie, jak efektory ukierunkowane na autofagię jednocześnie wpływają na apoptozę i stan zapalny, zapewni pełniejsze zrozumienie interakcji gospodarz-patogen i może ujawnić nowe cele interwencji terapeutycznej.

Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie mechanizmu ksenofagii. Gdy bakterie wnikają do cytoplazmy, ubikwityna jest sprzężona przez ligazę ubikwitynową z białkami obecnymi na powierzchni patogenu lub w wakuolach zakażonych patogenem, po czym następuje powstanie powłoki ubikwityny, która otacza patogen. Ta powłoka ubikwitynowa pełni rolę platformy sygnalizacyjnej do rekrutacji adaptatorów autofagii. Dodatkowo receptory autofagii mogą inicjować ksenofagię, wiążąc się z galektyną powierzchniową fagosomu bakteryjnego lub bezpośrednio oddziałując z białkami powierzchniowymi bakterii. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Tabela 1: Strategie unikania ksenofagii przez efektory L. pneumophila. Ta tabela przedstawia wybrane białka efektorowe L. pneumophila, ich cele lub aktywności molekularne oraz stadium szlaku ksenofagii, który one zakłócają.