5.7: Podawanie związków II

1. Aplikacja miejscowa

1. Przed nałożeniem jakichkolwiek maści i kremów usuń całą sierść z tego obszaru za pomocą kremu do depilacji lub golenia.
2. Dokładnie oczyść i osusz skórę.
3. Substancję należy nanosić bezpośrednio na skórę za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką lub za pomocą bezpośrednio umieszczonej kropli, aby uniknąć kontaktu z technikiem.
4. Aby uzyskać najlepsze rezultaty, nałóż kilka cienkich warstw maści lub kremu, zamiast jednorazowego nakładania grubej warstwy.
5. Nałóż płyn, rozdzielając włosy i nakładając kroplę na odsłoniętą skórę.
6. W przypadku stosowania substancji miejscowo istnieje ryzyko wchłaniania ogólnoustrojowego ze względu na pielęgnację obszaru przez zwierzę. Należy podjąć środki zapobiegawcze w celu uniknięcia przypadkowego spożycia lub przedwczesnego usunięcia substancji. Dostępne są małe obroże lub tarcze, aby zapobiec dotarciu zwierzęcia do dotkniętych części ciała. Może być również wymagane indywidualne trzymanie, aby zapobiec przebywaniu w pomieszczeniach ze strony współwięźniów z klatki.

Rysunek 1. Stosowanie miejscowe u myszy.

2. Dawkowanie doustne

1. W przypadku podawania zwierzętom związków chemicznych w postaci paszy lub wody, należy obliczyć minimalną dawkę dobową w oparciu o masę ciała. Średnia waga szczepu myszy lub szczura użytego w doświadczeniu może być wykorzystana do dokonania obliczeń, chyba że określono konieczność zważenia każdego zwierzęcia i obliczenia dawki dla każdego osobnika.
2. W przypadku protokołów, które wymagają, aby spożycie pokarmu i/lub wody było dokładnie mierzone, zwierzęta muszą być trzymane indywidualnie.
3. Specjalistyczne karmy lub smakołyki mogą być produkowane w celu zaspokojenia potrzeb eksperymentalnych.
   1. Zastąp standardową dietę dietą opracowaną w formule, która pozwala zwierzętom spożywać ten związek przez cały dzień.
   2. Żywność może wymagać częstszej wymiany niż standardowa żywność ze względu na niestabilność związku.
4. Substancje mogą być również podawane poprzez rozpuszczenie ich w wodzie pitnej, co pozwala zwierzętom na otrzymywanie związku przez cały dzień
   1. Do wody dodaje się niewielką ilość cukru, aby była smaczna. Dokładna ilość, którą należy dodać, zależy od przyjęcia wody przez myszy. Użyj najmniejszego możliwego przyrostu.
   2. Częstotliwość wymiany wody zależy od stabilności związku. Niektóre substancje mogą być wrażliwe na światło lub wytrącać się z czasem.

3. Procedura zgłębnika

Proste lub zakrzywione igły dozujące o rozmiarze 20-25 x 1,5 cala są używane dla myszy. W przypadku szczurów stosuje się proste lub zakrzywione igły dozujące o rozmiarze 18-20 x 2-3 cale. Są one dostępne jako igły wielokrotnego użytku ze stali nierdzewnej lub jako igły jednorazowe. Igły jednorazowe mogą mieć metalowy lub elastyczny plastikowy trzonek z silikonową końcówką.

1. Podłączyć igłę dozującą do strzykawki wybranej na podstawie objętości i lepkości badanego roztworu. Do dozowania gęstych płynów preferowana jest strzykawka typu Luer lock. Są one ogólnie dostępne od rozmiaru 3 cm³ z podziałką 100 μl. Może to nie być odpowiednie dla mniejszych objętości lub gdy istnieje potrzeba dokładnych objętości dawek w mniejszych przyrostach.
2. Przymocować strzykawkę do igły w taki sposób, aby podziałki na cylindrze można było odczytać bez obracania igły. Po umieszczeniu igły w przełyku, każde obroty mogą spowodować pęknięcie przełyku, powodując śmierć zwierzęcia.
3. Napełnić strzykawkę odpowiednią objętością artykułu do podania (optymalna objętość = 5 ml/kg i maksymalna objętość = 20 ml/kg)⁴
4. Odpowiednie unieruchomienie jest niezbędne do tej procedury. ⁷
   1. Ręcznie krępuj myszy, chwytając skórę u podstawy głowy i potrząsając nimi. Ważne jest, aby ciało było trzymane w taki sposób, aby było zawieszone w linii prostej od głowy do ogona. Jakiekolwiek skręcenie ciała utrudni umieszczenie igły do zgłębnika w przełyku.
   2. Chwyć mocno kark, aby głowa miała minimalny ruch na boki. Kończyny tylne muszą być ustabilizowane, aby zapobiec rotacji ciała.
   3. Aby złapać szczura, chwyć go za ramiona za pomocą palca wskazującego i środkowego po obu stronach szyi, a dłoni po grzbiecie zwierzęcia. Kciuk, trzeci i czwarty palec powinny otaczać klatkę piersiową, aby zwierzę nie mogło poruszać się do przodu lub do tyłu. Ułożenie palców po obu stronach szyi zapobiega obracaniu głowy przez szczura.
   4. Ważne jest, aby ciało było w linii prostej i nie było skręcone, aby pomóc w umieszczeniu igły do zgłębnika bez uszkodzenia jamy ustnej, gardła, przełyku lub żołądka.
   5. Upewnij się, że głowa nie ma nadmiernych ruchów na boki.
   6. Kończyny tylne mogą być ustabilizowane, aby zapobiec rotacji ciała. Osiąga się to, pozwalając tylnym stopom spoczywać na blacie lub klatce.
5. Podawanie substancji
   1. Ustawić igłę tak, aby krzywizna była skierowana w dół i zrównała się z naturalną krzywizną szyi. Wprowadzić igłę do jamy ustnej z prawej lub lewej strony, między siekacze i zęby trzonowe pod kątem w kierunku tylnej części gardła.
   2. Gdy igła znajdzie się w jamie ustnej, odchyl głowę do tyłu za pomocą igły do zgłębnika, aż nos będzie skierowany do góry. Jest to szczególnie ważne w przypadku używania prostych igieł. Igła powinna łatwo wsunąć się do przełyku. Nie wciskać igły na siłę. Jeśli wyczujesz jakikolwiek opór, wycofaj igłę i spróbuj ponownie.
   3. Gdy igła znajdzie się na swoim miejscu w żołądku, delikatnie odłóż związek.
   4. Wyjąć igłę, upewniając się, że nie następuje obrót zakrzywionej igły.
   5. Jeśli zwierzę zacznie się szarpać, wyjmij igłę dozującą i mocniej unieruchomij zwierzę.
   6. W trakcie wykonywania zabiegu, jeśli zwierzę wykazuje objawy sinicy lub niewydolności oddechowej lub jeśli z jego pyska wypływa roztwór, należy natychmiast wyjąć igłę dozującą i wypuścić zwierzę do klatki.
   7. Ogólnie rzecz biorąc, podczas zgłębnikowania szczurów i myszy, szczególnie z substancją żrącą, zalecaną praktyką jest downętrzne dostarczenie niewielkiej ilości – w celu zbadania kaszlu – przed podaniem całej objętości. W ten sposób, jeśli igła zostanie nieprawidłowo umieszczona, objętość dostarczana do płuc będzie mniejsza, a zwierzę ma większe szanse na wyzdrowienie.

Rysunek 2. Zgłębnik doustny u myszy (po lewej) i szczurów (po prawej).

Wiele eksperymentów wymaga, aby związek był podawany zwierzęciu drogą doustną lub miejscową, tak aby metoda lepiej naśladowała naturalne przyjmowanie substancji doświadczalnej.

W przypadku dawkowania doustnego związek ten może być rozpuszczony w wodzie pitnej lub włączony do pokarmu spożywanego przez zwierzęta. Inną, bardziej precyzyjną metodą dawkowania doustnego jest zgłębnik doustny, w którym za pomocą dużej igły umieszcza się związek bezpośrednio w żołądku. Z drugiej strony, środek miejscowy może być umieszczony bezpośrednio na powierzchni skóry i zazwyczaj ma na celu oddziaływanie tylko na obszar, na który jest stosowany. Każda z tych strategii ma zalety i ograniczenia, które omówimy w tym filmie. Następnie pokażemy, jak wykonywać te techniki podawania związków u zwierząt laboratoryjnych i niektóre z ich zastosowań.

Zanim zagłębimy się w protokoły, przyjrzyjmy się rozważaniom, korzyściom i wadom tych technik. Doustne dawkowanie tabletek, kapsułek lub płynów jest najczęściej stosowaną metodą podawania leków u ludzi. Jednak tabletki i kapsułki są niepraktyczne dla gryzoni, więc powszechne dawkowanie doustne odbywa się poprzez rozpuszczenie związku w wodzie pitnej lub pożywieniu.

Podczas dozowania przez wodę pitną sacharoza jest często dodawana do wody w celu zwiększenia smakowitości. Powinien być jednak dobrze zbilansowany, aby zachęcać do normalnego spożywania wody i nie nadmiernego picia ze względu na słodki smak. Dobrą zasadą jest rozpoczęcie od 10% roztworu sacharozy, a następnie dostosowanie w zależności od spożycia. Innym sposobem doustnego dawkowania zwierzęcia jest specjalistyczna karma. Istnieje dostępna na rynku pasza, która zawiera powszechnie dozowane związki, takie jak fenbendazol. Firmy produkujące karmę dla gryzoni mogą również tworzyć specjalistyczne diety testowe, aby spełnić wymagania eksperymentalne.

Zaletą tej formy dawkowania doustnego jest to, że jest nieinwazyjny, podaje związek w sposób ciągły i naśladuje doustne podawanie leku przez człowieka. Brakuje jednak precyzji, ponieważ spożycie związku zależy od przyjęcia pokarmu lub wody, stabilności związku i liczby zwierząt obecnych w klatce. Jeśli dokładne dawkowanie nie jest kluczowe dla eksperymentu, ta nieinwazyjna metoda jest najlepsza dla dobrego samopoczucia zwierząt.

Do bardziej precyzyjnego podawania doustnego można użyć zgłębnika doustnego, który osadza związek bezpośrednio w żołądku o określonej porze i objętości. Jednak do wykonania tej techniki wymagane jest odpowiednie szkolenie, ponieważ może dojść do poważnych uszkodzeń zwierzęcia, jeśli nie jest ono odpowiednio unieruchomione.

Jeśli chodzi o środki do stosowania miejscowego, należą do nich kremy, balsamy, maści, spraye i żele. Zazwyczaj środki miejscowe mają na celu wpływanie tylko na obszar, na który są stosowane. Jednak mogą one również zostać wchłonięte do krwiobiegu, co może być zamierzone lub niezamierzone. Wchłanianie to zależy od: stanu skóry, użytej powierzchni, stężenia substancji, czasu kontaktu i rozpuszczalności lipidowej środka.

Teraz, gdy omówiliśmy tło metod podawania doustnego i miejscowego, poznajmy protokoły, zaczynając od podawania doustnego za pośrednictwem paszy lub wody.

W celu obliczenia dawkowania, najpierw należy znać zamierzoną dawkę, która ma być podawana. Po drugie, musisz określić masę ciała. Zamiast ważyć pojedyncze zwierzęta, do obliczeń można użyć średniej wagi szczepu myszy lub szczura, chyba że określono inaczej. Po trzecie, powinieneś zdawać sobie sprawę z liczby zwierząt w klatce, a po czwarte, musisz znać średnie dzienne spożycie wody lub pożywienia na klatkę.

Pamiętaj, że przygotowana żywność lub woda pitna z rozpuszczonym związkiem może wymagać częstszej wymiany niż standardowa żywność lub woda ze względu na niestabilność związku. Niektóre związki mogą być wrażliwe na światło lub mogą z czasem się wytrącać.

Teraz nauczmy się, jak doustnie podawać precyzyjne dawki, wykonując doustne zgłębnik u myszy i szczurów.

Pierwszym krokiem jest dobranie odpowiedniej igły do zabiegu. Są one wielokrotnego użytku wykonane ze stali nierdzewnej lub jednorazowe z elastycznym plastikowym trzonkiem i silikonową końcówką. W przypadku myszy odpowiednie są proste lub zakrzywione igły dozujące o średnicy 20-25 o długości 1,5 cala. W przypadku szczurów wybierz proste lub zakrzywione igły dozujące o rozmiarze 18-20 o długości 2-3 cali. Prawidłowy rozstaw igieł i wybór strzykawki zależy również od objętości i lepkości. Zapoznaj się z filmem Podawanie związków chemicznych I, aby zrozumieć wpływ tych czynników. Do dozowania gęstych płynów preferowana jest strzykawka typu Luer lock.

Po dokonaniu selekcji przymocować strzykawkę do igły w taki sposób, aby podziałki na cylindrze można było odczytać bez obracania igły. Jest to ważne, ponieważ po umieszczeniu igły w przełyku każde obroty mogą spowodować pęknięcie ściany przełyku, powodując śmierć zwierzęcia. Następnie napełnić strzykawkę odpowiednią objętością roztworu, który ma być podany.

Metodę tę należy zawsze wykonywać u zwierząt przytomnych z nienaruszonymi odruchami połykania, aby zapobiec przypadkowemu umieszczeniu w tchawicy. Stosowanie odpowiedniej techniki unieruchamiania ma kluczowe znaczenie dla tej procedury. W przypadku myszy chwyć skórę u podstawy głowy i mocno przytrzymaj kark. Dzięki temu głowa ma minimalną możliwość poruszania się na boki. Upewnij się również, że ciało jest zawieszone w linii prostej od głowy do ogona; Każde skręcenie utrudni umieszczenie igły do zgłębnika w przełyku. Kończyny tylne muszą być również ustabilizowane, aby zapobiec rotacji ciała.

Aby powstrzymać szczura, chwyć go za ramiona za pomocą palca wskazującego i środkowego po obu stronach szyi. Zapobiegnie to obracaniu głowy szczura z boku na bok. Kciuk, trzeci i czwarty palec otaczają klatkę piersiową, aby zapobiec poruszaniu się zwierzęcia do przodu lub do tyłu.

Po prawidłowym unieruchomieniu zwierzęcia ustaw igłę tak, aby krzywizna była skierowana w dół i zgodna z naturalną krzywizną szyi. Następnie wprowadź igłę do ust z prawej lub lewej strony, przez diastemę oraz między siekaczami a zębami trzonowymi pod kątem w kierunku tylnej części gardła. Teraz, gdy igła jest umieszczona w jamie ustnej, użyj jej, aby odchylić głowę do tyłu, aż nos zostanie skierowany do góry. W tym momencie igła powinna łatwo wsunąć się do przełyku. Po umieszczeniu igły w żołądku, delikatnie zdeponuj związek. Następnie wyjmij igłę ze zwierzęcia, uważając, aby jej nie obracać. Ważne jest, aby NIE wciskać igły na siłę. Jeśli poczujesz opór, usuń go i spróbuj ponownie. W trakcie wykonywania zabiegu, jeśli zwierzę wykazuje oznaki sinicy lub niewydolności oddechowej lub jeśli z jego pyska wypływa roztwór, należy natychmiast usunąć igłę dozującą i wypuścić zwierzę do klatki.

Na koniec przyjrzyjmy się procedurom podawania miejscowego zwierzętom laboratoryjnym. Zacznij od znieczulenia zwierzęcia. Odbywa się to zwykle za pomocą szybko działającego środka wziewnego, który umożliwia szybką regenerację zwierząt. Aby uzyskać więcej informacji na temat podawania znieczulenia, zobacz inny film z tej kolekcji.

Następnie za pomocą maszynki do strzyżenia włosów usuń całą sierść z obszaru aplikacji. Aby uniknąć skaleczeń, przyłóż płaską powierzchnię maszynki do strzyżenia przy skórze i gol się w kierunku przeciwnym do kierunku wzrostu włosów. Następnie oczyść skórę wodą i osusz ją gazikiem. Teraz za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką nałóż substancję bezpośrednio na skórę. Aby uzyskać najlepsze rezultaty, nałóż kilka cienkich warstw maści lub kremu, zamiast jednorazowego nakładania grubej warstwy. Aby zapobiec przypadkowemu spożyciu miejscowo stosowanego związku z powodu pielęgnacji, umieść małą obrożę lub osłonę, aby zapobiec dotarciu zwierzęcia do dotkniętej części ciała. Ponadto, aby zapobiec przebywaniu w pomieszczeniach przez kolegów z klatki, zwierzęta powinny być trzymane indywidualnie.

Teraz, gdy już rozumiesz te alternatywne drogi podawania, zobaczmy, jak są one obecnie wykorzystywane w badaniach biomedycznych.

Jednym z ważnych zastosowań zgłębnika doustnego jest precyzyjne podawanie substancji w celu zbadania ich bezpośredniego wpływu na przewód pokarmowy. W tym przypadku naukowcy wykorzystali tę metodę do dostarczenia przekształconych drożdży probiotycznych bezpośrednio do żołądka zwierzęcia. A następnie przeprowadzili sekcję plastrów Peyera, które są zorganizowanymi guzkami limfatycznym z jelita cienkiego, aby zbadać przyleganie dostarczonego mikroorganizmu.

Nieinwazyjna droga doustna może być stosowana do naśladowania naturalnego sposobu infekcji przenoszonej przez żywność. W tym eksperymencie naukowiec opracował model doustnego przenoszenia Listeria monocytogenes u myszy poprzez spożycie skażonej żywności. Po zakażeniu naukowcy pobrali różne narządy, takie jak jelito cienkie, okrężnica, śledziona, wątroba i woreczek żółciowy, aby przeanalizować rozprzestrzenianie się infekcji na te tkanki.

Wreszcie, niektórzy badacze są zainteresowani badaniem mechanizmu, za pomocą którego promieniowanie UV może prowadzić do oparzeń słonecznych. W tym przypadku naukowcy wykorzystali drogę miejscową, aby zastosować substancję farmakologiczną, która indukuje produkcję melaniny naskórka - środka chroniącego przed promieniowaniem UV. Następnie zastosowali protokół, który jest podobny do badań na ludziach, aby zbadać działanie ochronne środka stosowanego miejscowo przeciwko rumieniowi wywołanemu promieniowaniem UV.

Właśnie obejrzałeś drugą część JoVE dotyczącą metod podawania związków związanych z dawkowaniem doustnym i miejscowym. Powinieneś teraz zrozumieć, w jaki sposób można doustnie dawkować zwierzęciu przy użyciu paszy lub wody i jak można wykonać bardziej precyzyjne, doustne podawanie przez zgłębnik. Na koniec należy zapoznać się z rozważaniami i metodą podawania miejscowego oraz zastosowaniami tych różnych technik. Jak zawsze, dziękujemy za oglądanie!