5.4: Test ELISPOT: Wykrywanie splenocytów wydzielających IFN-γ

1. Ustawienie

Bufory i odczynniki

1. Sterylny roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanami (PBS) bez wapnia i magnezu
2. Bufor powlekający - sterylny PBS lub bufor węglanowy
3. Rozcieńczalnik do oznaczania - 10% płodowa surowica bydlęca (FBS) w PBS
4. Pożywka do hodowli komórkowych - RPMI 1640 z 10% FBS, penicyliną/streptomycyną i L-glutaminą
5. Bufor do płukania - PBS zawierający 0,05% Tween20
6. Woda podwójnie destylowana (ddH₂O)
7. Substrat detekcyjny - 100 mg AEC (3-amino-9-etylo-karbazol) w 10 ml DMF (n,n, dimetyloformamid).

Sprzęt

8. Okap z przepływem laminarnym
9. Inkubator nawilżany (ustawiony na 37°C, 5% CO₂)
10. Automatyczny czytnik ELISPOT lub mikroskop preparacyjny

Materiały

11. Płytki ELISPOT
12. Zbiorniki sterylne i niesterylne
13. Pipety i końcówki
14. Sterylne pipety serologiczne
15. Sterylne, stożkowe rurki polipropylenowe
16. Dwie wyciskane butelki do mycia talerzy

Odczynniki specyficzne dla testów

17. Komórki- pierwotne komórki lub linie komórkowe (tutaj użyto splenocytów myszy C57BL/6)
18. Używki - mitogen lub antygen (tutaj zastosowano 12-mirystynian 13-octanu forbolu (PMA, 50 ng/mL) i jonomycynę (1 μM)
19. Przeciwciało pierwszorzędowe - biotynylowane przeciwciało wykrywające antycytokiny (rozcieńczone do 2 μg/ml w rozcieńczalniku do oznaczania)
20. Przeciwciało drugorzędowe - streptawidyna-peroksydaza chrzanowa (SAv-HRP)

2. Procedura

Powłoka

1. Utrzymując warunki sterylne i wewnątrz okapu z przepływem laminarnym, rozcieńczyć oczyszczone przeciwciało wychwytujące antycytokiny do końcowego stężenia 0,5-4,0 μg / ml w sterylnym buforze powlekającym. (Uwaga: dla IFN-γ i IL-6 należy użyć 5 μg/ml).
2. Przenieść roztwór przeciwciała wychwytującego, 100 μl/basenik, na płytkę ELISPOT.
3. Przykryj płytkę pokrywą talerza i uszczelnij ją, aby zapobiec parowaniu.
4. Inkubować płytkę przez noc w temperaturze 4°C.

Blokowanie

5. Następnego dnia odsłoń płytkę ELISPOT w okapie z przepływem laminarnym. Szybko odwróć płytkę na sterylne chusteczki w celu usunięcia roztworu przeciwciał wychwytujących z każdej studzienki.
6. Następnie dodaj 200 μl pożywki do hodowli komórkowych do każdej studzienki. Ten krok zablokuje niespecyficzne wiązanie podczas testu.
7. Załóż pokrywę płytki i inkubuj płytkę przez 2 godziny w temperaturze 37°C.

Posiewanie i aktywacja komórek

8. Podczas inkubacji płytki przygotuj 2X roztwór mitogenu zawierający 50 ng/ml PMA i 1 μM jonomycynę w pożywce do hodowli komórkowej.
9. Następnie przygotuj docelowe zawiesiny komórkowe do stężenia podstawowego 2 x 10⁶ komórek/ml.
10. Po zakończeniu inkubacji należy usunąć pożywkę do hodowli komórkowych z każdej studzienki, szybko odwracając płytkę na sterylne chusteczki wewnątrz okapu z przepływem laminarnym.
11. Następnie wygeneruj 2-krotne seryjne rozcieńczenie roztworu zawiesiny komórek podstawowych. W tym celu należy najpierw dodać 200 μl przygotowanego roztworu podstawowego zawiesiny komórkowej do studzienek w górnym rzędzie płytki ELISPOT.
12. Następnie dodać 100 μl zwykłej pożywki do hodowli komórkowych do następnych pięciu rzędów płytki poniżej rzędów zawierających komórkowy roztwór podstawowy.
13. Następnie wykonać 2-krotne rozcieńczenie szeregowe, pipetując 100 μl zawiesiny komórkowej z górnego rzędu do rzędu znajdującego się bezpośrednio poniżej. Upewnij się, że mieszanie jest prawidłowe, delikatnie pipetując ten roztwór w górę i w dół, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie komórek.
14. Powtórz ten proces dla pozostałych czterech rzędów.
15. Pozostaw szósty rząd tylko z podłożem hodowlanym. Będzie on służył jako kontrola eksperymentalna.
16. Następnie dodaj 100 μl przygotowanego roztworu mitogenu do dołków doświadczalnych pierwszych pięciu rzędów płytki. Do studzienek kontrolnych i szóstego rzędu dodać 100 μl pożywki do hodowli komórkowych bez mitogenu.
17. Załóż pokrywę płytki i inkubuj płytkę w temperaturze 37°C, 5% CO₂ w inkubatorze przez 20-48 godzin. (Uwaga: 20-24 godziny są zwykle wystarczające do wykrycia IL-2 i TNF-α, podczas gdy 48 godzin jest optymalne dla IL-4 i IFN-γ).

Wykrywanie

Przeciwciało pierwotne

18. Przygotować biotynylowane przeciwciało wykrywające antycytokiny o stężeniu 2 μg/ml w rozcieńczalniku do oznaczania.
19. W tym czasie przygotuj 20-25 ml buforu do płukania, mieszając 0,05% Tween-20 z PBS.
20. Po zakończeniu inkubacji odkręć płytkę i szybko odwróć ją nad zlewem, aby usunąć cały płyn z dołków. (Uwaga: Po tym momencie płytka nie musi być już utrzymywana w sterylności).
21. Następnie umyj płytkę, dodając ~200 μl buforu do płukania do każdej studzienki. Wyrzuć ten płyn, szybko odwracając i przesuwając talerz nad zlewem. Powtórz ten proces, w sumie pięć prań.
22. Następnie dodaj 100 μl rozcieńczonego biotynylowanego roztworu przeciwciała wykrywającego antycytokiny do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4°C.

Przeciwciało wtórne

23. Po zakończeniu inkubacji wydalić przeciwciało wykrywające, odwracając i przesuwając płytkę nad zlewem.
24. Tak jak poprzednio, umyj płytkę 5 razy buforem myjącym o pojemności ~200 μL, usuwając płyn między każdym myciem.
25. Następnie dodać 100 μl rozcieńczonego roztworu streptawidyny i peroksydazy chrzanowej do każdego dołka (rozcieńczonego do wcześniej ustalonego optymalnego stężenia w rozcieńczalniku do oznaczania).
26. Załóż pokrywę płytki i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 1,5-2 godziny w temperaturze 37°C.

Podłoże

27. Po inkubacji, nie więcej niż 15 minut przed użyciem, najpierw aktywuj roztwór substratu AEC zgodnie z instrukcjami producenta.
28. Następnie wyrzuć zawartość studzienek i umyj płytkę pięciokrotnie buforem do mycia, tak jak poprzednio.
29. Następnie natychmiast dodaj 100 μl przygotowanego roztworu substratu AEC do każdej studzienki.
30. Inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez ~10-20 minut, monitorując rozwój plamki.
31. Przerwij reakcję, spłukując talerz wodą i przesuwając talerz nad zlewem.
32. Osusz talerz na ręcznikach papierowych i pozostaw talerz do wyschnięcia na powietrzu przez noc lub do całkowitego wyschnięcia. Wyjęcie plastikowej tacki pod talerzem ułatwi suszenie.

3. Akwizycja i analiza danych

1. Po wyschnięciu plamy są gotowe do zliczenia za pomocą automatycznego czytnika płytek. W tym przypadku używany jest czytnik CTL Immunospot, ale protokół ten można dostosować do każdego czytnika.
2. Najpierw włącz instrument, a następnie komputer. Następnie otwórz program CTL i kliknij "liczba skanów".
3. Naciśnij przycisk "wysuń", aby taca wysunęła się z urządzenia. Następnie wyjmij plastikowy adapter i wyrównaj rząd "A" na płytce ELISPOT i adapterze.
4. Wybierz nazwę pliku i lokalizację, w której chcesz go zapisać, a następnie załaduj płytę na tacę.
5. Następnie kliknij "załaduj" w oprogramowaniu i zamknij drzwi z boku maszyny.
6. Naciśnij "start - po zliczeniu". Upewnij się, że plik został zapisany, a następnie otwórz oprogramowanie kontroli jakości "QC", aby przeanalizować dane i policzyć liczbę miejsc.

Uwagi:

1. Minimalna liczba komórek powinna zostać określona we wstępnych doświadczeniach. Optymalna liczba miejsc to ~50/studnia. Jeśli załadowanych zostanie zbyt wiele komórek, trudno będzie wykryć wyraźne plamy. Dodatkowo komórki będą się na siebie nakładać i mogą nie tworzyć monowarstwy na membranie, co może zmniejszyć poziom wykrywalności.
2. Optymalizując eksperyment, należy wziąć pod uwagę oczekiwany poziom ekspresji białka docelowego. Im niższe wyrażenie, tym większa liczba komórek wymaganych na studzienkę.
3. W przeciwieństwie do testu ELISA, lepiej jest umyć płytkę ręcznie niż używać myjki do płyt. Płytki ELISPOT są delikatniejsze i należy unikać przebijania membrany PVDF.
4. Należy ograniczyć ruch płytki w okresie inkubacji, ponieważ może to spowodować rozmazywanie się plam.
5. Płytki należy przechowywać w ciemności, ponieważ ekspozycja na bezpośrednie światło powoduje blaknięcie plam.

Test Immunospot sprzężony z enzymem lub ELISPOT to metoda analizy odpowiedzi immunologicznej na patogen lub uszkodzenie komórek. Pozwala na ilościowe określenie aktywacji różnych komórek odpornościowych poprzez wykrycie określonych białek, które wydzielają. Na przykład ELISPOT jest powszechnie stosowany do pomiaru odpowiedzi limfocytów T po ekspozycji na obcy antygen poprzez wykrywanie wydzielanych cytokin.

W przypadku testu ELISPOT opartego na cytokinach proces rozpoczyna się od pokrycia mikropłytki ELISPOT przeciwciałem wychwytującym, które jest specyficzne dla docelowej cytokiny. Po pokryciu przeciwciałem limfocyty T są dodawane do studzienek i stymulowane przez czynnik zewnętrzny, taki jak na przykład przeciwciało anty-CD3. Komórki następnie wydzielają docelową cytokinę, która natychmiast zostaje unieruchomiona przez przeciwciało wychwytujące. Ponieważ białko jest wychwytywane natychmiast po wydzieleniu z żywych komórek, bez rozcieńczania lub degradacji, test ten ma wysoką dokładność. Po unieruchomieniu docelowej cytokiny dodaje się przeciwciało wykrywające, które również wiąże się z wychwyconą cytokiną.

Technika ELISPOT może być również wykorzystana do ilościowego oznaczania komórek B pamięci po zakażeniu lub szczepieniu poprzez analizę produkcji przez nie specyficznych przeciwciał. W badaniu ELISPOT opartym na przeciwciałach zamiast przeciwciała stosuje się specyficzny antygen na etapie wychwytywania, w którym antygen zostanie związany z płytką, lub na etapie wykrywania, gdy antygen wykrywa przeciwciało docelowe po wychwyceniu. We wszystkich wariantach procesu, w przypadku limfocytów T lub limfocytów B, przeciwciało lub antygen detekcyjny jest biotynylowany, co pozwala mu wiązać się z enzymem wykrywającym sprzężonym ze streptawidyną, takim jak peroksydaza chrzanowa. Następnie, po dodaniu substratu peroksydazy, AEC, wytwarzany jest ciemny, nierozpuszczalny osad. Osad ten wyznacza lokalizację wychwyconego białka, a każda komórka wydzielnicza tworzy widoczną plamę, którą można określić ilościowo za pomocą czytnika ELISPOT lub mikroskopu. Wielkość plamek jest względnym oszacowaniem ilości białka wydzielanego z każdej komórki. Test ten może wykrywać odpowiedzi immunologiczne z pojedynczych komórek, nawet w stosunkowo małych subpopulacjach komórek wydzielniczych, co czyni go przydatnym do badania odpowiedzi immunologicznych na poziomie komórkowym.

Z tego filmu dowiesz się, jak wykonać test ELISPOT, a następnie określić ilościowo plamki reprezentujące komórki wydzielnicze.

Przez cały czas trwania eksperymentu należy zapewnić sterylne warunki, pracując w kapturze z przepływem laminarnym i nosząc rękawice.

Wszystkie obliczenia w tym protokole opierają się na objętości potrzebnej na jedną płytkę 96-dołkową.

Najpierw rozcieńczyć przeciwciało wychwytujące antycytokiny. Aby to zrobić, przenieś 10 mililitrów buforu do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów. Następnie za pomocą pipety dodaj 10 mikrolitrów jednego miligrama na mililitr przeciwciała monoklonalnego do buforu, aby utworzyć roztwór o końcowym stężeniu jednego mikrograma na mililitr. Następnie wlać roztwór przeciwciała wychwytującego do sterylnego zbiornika i za pomocą pipety wielokanałowej rozprowadzić 100 mikrolitrów do każdej studzienki 96-dołkowej płytki ELISPOT.

Przykryj płytkę pokrywą płytki, uszczelnij ją, aby zapobiec parowaniu, i inkubuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia odsłoń płytkę ELISPOT w okapie z przepływem laminarnym. Szybko odwróć płytkę na sterylne chusteczki w celu usunięcia roztworu przeciwciał wychwytujących z każdej studzienki. Następnie za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 200 mikrolitrów pożywki do hodowli komórkowych do każdej studzienki. Ten krok zablokuje niespecyficzne wiązanie podczas testu. Załóż pokrywę płytki i inkubuj w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny.

Podczas inkubacji płytki przygotuj 2X roztwór mitogenu, dodając jeden mikrolitr PMA i 20 mikrolitrów jonomycyny do 10 mililitrów pożywki do hodowli komórkowych, aby osiągnąć końcowe stężenie 15 nanogramów na mililitr PMA i jedną mikromolową jonomycynę.

W tym czasie należy również przygotować zawiesiny komórkowe mysich splenocytów w sterylnym kapturze. Za pomocą mikroskopu i hemocytometru zmierz stężenie komórek i dostosuj całkowitą objętość, aż do osiągnięcia stężenia wyjściowego dwóch milionów komórek na mililitr.

Po zakończeniu inkubacji szybko odwróć płytkę na sterylne chusteczki w celu usunięcia pożywki do hodowli komórkowych z każdej studzienki. Następnie dodać 200 mikrolitrów przygotowanego roztworu podstawowego zawiesiny komórkowej do studzienek w górnym rzędzie płytki ELISPOT. Skonfiguruj eksperyment w trzech egzemplarzach, tak aby każdy testowany typ komórki został posiany w zestawie trzech zgrupowanych kolumn. Poniżej dodaj 100 mikrolitrów zwykłej pożywki do hodowli komórkowych do następnych pięciu rzędów płytki, poniżej rzędów zawierających komórkowy roztwór podstawowy.

Następnie wykonaj rozcieńczenie seryjne, pipetując 100 mikrolitrów zawiesiny komórek z górnego rzędu do rzędu bezpośrednio poniżej, delikatnie pipetując roztwór w górę iw dół, aby równomiernie rozprowadzić komórki. Powtórz ten proces dla pozostałych rzędów, przesuwając 100 mikrolitrów z poprzedniego rzędu do rzędu poniżej na każdym kroku, kontynuując, aż piąty rząd zostanie seryjnie rozcieńczony. Pozostawić szósty rząd tylko z pożywką do hodowli komórkowych, aby służyła jako kontrola. Aby stymulować komórki w dołkach doświadczalnych płytki, dodaj 100 mikrolitrów przygotowanego roztworu mitogenu do zawiesin komórkowych w każdym dołku w rzędach od pierwszego do pięciu. Pamiętaj, aby pozostawić szósty rząd, który będzie służył jako kontrola, niestymulowany. Załóż pokrywkę i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 przez 24 do 48 godzin.

Przygotować rozcieńczone biotynylowane przeciwciało wykrywające antycytokiny. Najpierw przygotuj 50 mililitrów rozcieńczalnika do oznaczania, dodając 5 mililitrów 10% płodowej surowicy bydlęcej do 45 mililitrów PBS. Następnie rozcieńczyć przeciwciało wykrywające do stężenia 2 mikrogramów na mililitr w rozcieńczalniku do oznaczania. W tym czasie przygotuj również od 20 do 25 mililitrów buforu do mycia, mieszając .05% Tween-20 i PBS.

Po zakończeniu inkubacji odkręć płytkę i szybko ją odwróć, aby usunąć cały płyn z dołków. Umyj płytkę, dodając około 200 mikrolitrów buforu do płukania do każdej studzienki. Wyrzuć ten płyn, szybko odwracając i przesuwając talerz nad zlewem. Powtórz ten proces jeszcze cztery razy, co daje w sumie pięć prań. Następnie dodaj 100 mikrolitrów rozcieńczonego roztworu przeciwciała detekcyjnego do każdej studzienki, załóż pokrywkę i inkubuj w temperaturze pokojowej przez dwie godziny. Po inkubacji wyrzuć roztwór przeciwciała wykrywającego z dołków płytki, odwracając i przesuwając płytkę nad zlewem.

Tak jak poprzednio, umyj płytkę pięć razy buforem do mycia, usuwając płyn między każdym myciem. Po ostatnim myciu należy przygotować roztwór streptawidyny i peroksydazy chrzanowej, rozcieńczając go zgodnie z zaleceniami producenta. Następnie, przy pustych studzienkach płytki, dodaj 100 mikrolitrów rozcieńczonego roztworu streptawidyny i peroksydazy chrzanowej do każdej studzienki. Umieść pokrywkę z powrotem na płytce i inkubuj w temperaturze pokojowej przez dwie godziny.

Po inkubacji, nie więcej niż 15 minut przed użyciem, aktywuj gotowy roztwór substratu AEC. Wyrzuć zawartość studzienek i umyj płytkę pięciokrotnie buforem do mycia, tak jak poprzednio. Następnie natychmiast dodaj 100 mikrolitrów przygotowanego roztworu substratu AEC do każdej studzienki. Pozostaw płytkę w temperaturze pokojowej do rozwinięcia na około 10 do 20 minut, obserwując rozwój plamki. Plamy te pojawią się jako małe, pociemniałe kółka na powierzchni studni. Następnie zatrzymaj reakcję, spłukując talerz wodą i przesuwając go po zlewie. Osusz talerz na ręcznikach papierowych i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przez noc lub do całkowitego wyschnięcia. Wyjęcie plastikowej tacki pod talerzem ułatwi suszenie. Po wyschnięciu plamy są gotowe do zliczenia za pomocą automatycznego czytnika płytek.

W tym przypadku używany jest czytnik CTL ImmunoSpot, ale protokół ten można dostosować do każdego czytnika. Następnie otwórz program CTL i kliknij Scan Count (Liczba skanów). Naciśnij wysuwanie, aby taca wysunęła się z urządzenia. Następnie wyjmij plastikowy adapter i wyrównaj rząd A na płytce ELISPOT i adapterze. Wybierz nazwę pliku i lokalizację, w której chcesz go zapisać, a następnie załaduj płytę i adapter do tacy. Kliknij przycisk Załaduj oprogramowanie i zamknij drzwiczki z boku urządzenia. Następnie naciśnij Start po zliczeniu. Upewnij się, że plik jest zapisany, a następnie otwórz oprogramowanie Quality Control QC, aby przeanalizować dane i policzyć liczbę miejsc. Wyeksportuj te dane jako plik Excel. Po zakończeniu analizy kliknij przycisk Wysuń, aby pobrać płytę.

W tym eksperymencie komórki myszy typu dzikiego i myszy z nowotworem zostały posiane i przeanalizowane pod kątem IFN gamma. Zauważ, że liczba plamek zmniejsza się wraz ze spadkiem stężenia komórek. Zazwyczaj dane ELISPOT są przedstawiane jako liczba zliczeń plamek na liczbę platerowanych komórek. W tym przykładzie liczba plamek została wyświetlona na wykresie słupkowym, przy czym każde odpowiednie stężenie komórkowe jest wymienione na osi x. Zauważ, że liczba plamek wskazuje liczbę aktywowanych komórek na całkowitą liczbę komórek w danej populacji.