Test ELISPOT: Wykrywanie splenocytów wydzielających IFN-γ

1. Ustawienie

Bufory i odczynniki

1. Sterylny roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanami (PBS) bez wapnia i magnezu
2. Bufor powlekający - sterylny PBS lub bufor węglanowy
3. Rozcieńczalnik do oznaczania - 10% płodowa surowica bydlęca (FBS) w PBS
4. Pożywka do hodowli komórkowych - RPMI 1640 z 10% FBS, penicyliną/streptomycyną i L-glutaminą
5. Bufor do płukania - PBS zawierający 0,05% Tween20
6. Woda podwójnie destylowana (ddH₂O)
7. Substrat detekcyjny - 100 mg AEC (3-amino-9-etylo-karbazol) w 10 ml DMF (n,n, dimetyloformamid).

Sprzęt

8. Okap z przepływem laminarnym
9. Inkubator nawilżany (ustawiony na 37°C, 5% CO₂)
10. Automatyczny czytnik ELISPOT lub mikroskop preparacyjny

Materiały

11. Płytki ELISPOT
12. Zbiorniki sterylne i niesterylne
13. Pipety i końcówki
14. Sterylne pipety serologiczne
15. Sterylne, stożkowe rurki polipropylenowe
16. Dwie wyciskane butelki do mycia talerzy

Odczynniki specyficzne dla testów

17. Komórki- pierwotne komórki lub linie komórkowe (tutaj użyto splenocytów myszy C57BL/6)
18. Używki - mitogen lub antygen (tutaj zastosowano 12-mirystynian 13-octanu forbolu (PMA, 50 ng/mL) i jonomycynę (1 μM)
19. Przeciwciało pierwszorzędowe - biotynylowane przeciwciało wykrywające antycytokiny (rozcieńczone do 2 μg/ml w rozcieńczalniku do oznaczania)
20. Przeciwciało drugorzędowe - streptawidyna-peroksydaza chrzanowa (SAv-HRP)

2. Procedura

Powłoka

1. Utrzymując warunki sterylne i wewnątrz okapu z przepływem laminarnym, rozcieńczyć oczyszczone przeciwciało wychwytujące antycytokiny do końcowego stężenia 0,5-4,0 μg / ml w sterylnym buforze powlekającym. (Uwaga: dla IFN-γ i IL-6 należy użyć 5 μg/ml).
2. Przenieść roztwór przeciwciała wychwytującego, 100 μl/basenik, na płytkę ELISPOT.
3. Przykryj płytkę pokrywą talerza i uszczelnij ją, aby zapobiec parowaniu.
4. Inkubować płytkę przez noc w temperaturze 4°C.

Blokowanie

5. Następnego dnia odsłoń płytkę ELISPOT w okapie z przepływem laminarnym. Szybko odwróć płytkę na sterylne chusteczki w celu usunięcia roztworu przeciwciał wychwytujących z każdej studzienki.
6. Następnie dodaj 200 μl pożywki do hodowli komórkowych do każdej studzienki. Ten krok zablokuje niespecyficzne wiązanie podczas testu.
7. Załóż pokrywę płytki i inkubuj płytkę przez 2 godziny w temperaturze 37°C.

Posiewanie i aktywacja komórek

8. Podczas inkubacji płytki przygotuj 2X roztwór mitogenu zawierający 50 ng/ml PMA i 1 μM jonomycynę w pożywce do hodowli komórkowej.
9. Następnie przygotuj docelowe zawiesiny komórkowe do stężenia podstawowego 2 x 10⁶ komórek/ml.
10. Po zakończeniu inkubacji należy usunąć pożywkę do hodowli komórkowych z każdej studzienki, szybko odwracając płytkę na sterylne chusteczki wewnątrz okapu z przepływem laminarnym.
11. Następnie wygeneruj 2-krotne seryjne rozcieńczenie roztworu zawiesiny komórek podstawowych. W tym celu należy najpierw dodać 200 μl przygotowanego roztworu podstawowego zawiesiny komórkowej do studzienek w górnym rzędzie płytki ELISPOT.
12. Następnie dodać 100 μl zwykłej pożywki do hodowli komórkowych do następnych pięciu rzędów płytki poniżej rzędów zawierających komórkowy roztwór podstawowy.
13. Następnie wykonać 2-krotne rozcieńczenie szeregowe, pipetując 100 μl zawiesiny komórkowej z górnego rzędu do rzędu znajdującego się bezpośrednio poniżej. Upewnij się, że mieszanie jest prawidłowe, delikatnie pipetując ten roztwór w górę i w dół, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie komórek.
14. Powtórz ten proces dla pozostałych czterech rzędów.
15. Pozostaw szósty rząd tylko z podłożem hodowlanym. Będzie on służył jako kontrola eksperymentalna.
16. Następnie dodaj 100 μl przygotowanego roztworu mitogenu do dołków doświadczalnych pierwszych pięciu rzędów płytki. Do studzienek kontrolnych i szóstego rzędu dodać 100 μl pożywki do hodowli komórkowych bez mitogenu.
17. Załóż pokrywę płytki i inkubuj płytkę w temperaturze 37°C, 5% CO₂ w inkubatorze przez 20-48 godzin. (Uwaga: 20-24 godziny są zwykle wystarczające do wykrycia IL-2 i TNF-α, podczas gdy 48 godzin jest optymalne dla IL-4 i IFN-γ).

Wykrywanie

Przeciwciało pierwotne

18. Przygotować biotynylowane przeciwciało wykrywające antycytokiny o stężeniu 2 μg/ml w rozcieńczalniku do oznaczania.
19. W tym czasie przygotuj 20-25 ml buforu do płukania, mieszając 0,05% Tween-20 z PBS.
20. Po zakończeniu inkubacji odkręć płytkę i szybko odwróć ją nad zlewem, aby usunąć cały płyn z dołków. (Uwaga: Po tym momencie płytka nie musi być już utrzymywana w sterylności).
21. Następnie umyj płytkę, dodając ~200 μl buforu do płukania do każdej studzienki. Wyrzuć ten płyn, szybko odwracając i przesuwając talerz nad zlewem. Powtórz ten proces, w sumie pięć prań.
22. Następnie dodaj 100 μl rozcieńczonego biotynylowanego roztworu przeciwciała wykrywającego antycytokiny do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4°C.

Przeciwciało wtórne

23. Po zakończeniu inkubacji wydalić przeciwciało wykrywające, odwracając i przesuwając płytkę nad zlewem.
24. Tak jak poprzednio, umyj płytkę 5 razy buforem myjącym o pojemności ~200 μL, usuwając płyn między każdym myciem.
25. Następnie dodać 100 μl rozcieńczonego roztworu streptawidyny i peroksydazy chrzanowej do każdego dołka (rozcieńczonego do wcześniej ustalonego optymalnego stężenia w rozcieńczalniku do oznaczania).
26. Załóż pokrywę płytki i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 1,5-2 godziny w temperaturze 37°C.

Podłoże

27. Po inkubacji, nie więcej niż 15 minut przed użyciem, najpierw aktywuj roztwór substratu AEC zgodnie z instrukcjami producenta.
28. Następnie wyrzuć zawartość studzienek i umyj płytkę pięciokrotnie buforem do mycia, tak jak poprzednio.
29. Następnie natychmiast dodaj 100 μl przygotowanego roztworu substratu AEC do każdej studzienki.
30. Inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez ~10-20 minut, monitorując rozwój plamki.
31. Przerwij reakcję, spłukując talerz wodą i przesuwając talerz nad zlewem.
32. Osusz talerz na ręcznikach papierowych i pozostaw talerz do wyschnięcia na powietrzu przez noc lub do całkowitego wyschnięcia. Wyjęcie plastikowej tacki pod talerzem ułatwi suszenie.

3. Akwizycja i analiza danych

1. Po wyschnięciu plamy są gotowe do zliczenia za pomocą automatycznego czytnika płytek. W tym przypadku używany jest czytnik CTL Immunospot, ale protokół ten można dostosować do każdego czytnika.
2. Najpierw włącz instrument, a następnie komputer. Następnie otwórz program CTL i kliknij "liczba skanów".
3. Naciśnij przycisk "wysuń", aby taca wysunęła się z urządzenia. Następnie wyjmij plastikowy adapter i wyrównaj rząd "A" na płytce ELISPOT i adapterze.
4. Wybierz nazwę pliku i lokalizację, w której chcesz go zapisać, a następnie załaduj płytę na tacę.
5. Następnie kliknij "załaduj" w oprogramowaniu i zamknij drzwi z boku maszyny.
6. Naciśnij "start - po zliczeniu". Upewnij się, że plik został zapisany, a następnie otwórz oprogramowanie kontroli jakości "QC", aby przeanalizować dane i policzyć liczbę miejsc.

Uwagi:

1. Minimalna liczba komórek powinna zostać określona we wstępnych doświadczeniach. Optymalna liczba miejsc to ~50/studnia. Jeśli załadowanych zostanie zbyt wiele komórek, trudno będzie wykryć wyraźne plamy. Dodatkowo komórki będą się na siebie nakładać i mogą nie tworzyć monowarstwy na membranie, co może zmniejszyć poziom wykrywalności.
2. Optymalizując eksperyment, należy wziąć pod uwagę oczekiwany poziom ekspresji białka docelowego. Im niższe wyrażenie, tym większa liczba komórek wymaganych na studzienkę.
3. W przeciwieństwie do testu ELISA, lepiej jest umyć płytkę ręcznie niż używać myjki do płyt. Płytki ELISPOT są delikatniejsze i należy unikać przebijania membrany PVDF.
4. Należy ograniczyć ruch płytki w okresie inkubacji, ponieważ może to spowodować rozmazywanie się plam.
5. Płytki należy przechowywać w ciemności, ponieważ ekspozycja na bezpośrednie światło powoduje blaknięcie plam.