In vivo (in vivo) Obrazowanie bioluminescencyjne guzów sutka z wykorzystaniem spektrum IVIS

Aby rozpocząć tę procedurę, linia komórkowa guza sutka wyrażająca lucyferazy jest rozmrażana z zamrożonych łodyg, a następnie rozwijana w hodowli do 90% płynności COF. Seryjne rozcieńczanie zawieszonych komórek jest następnie wysiewane w 96. Płytki studzienne wystawione na działanie lucyfera, a następnie optymalna liczba komórek generujących emisje fluorescencyjne powyżej 500 fotonów są określane za pomocą płytki Następnie wstrzykuje się komórki czytnika, podskórnie w bok zwierzęcia, a następnie wstrzykuje się lucyferazy.

Komórki wewnątrzotrzewnowe można obrazować już po 10 minutach od podania Lucyfera, a masę guza można uwidocznić do miesiąca in vivo do wystąpienia martwicy. Cześć, nazywam się Ed Lim i pracuję w Laboratorium Obrazowania w Caliper Life Sciences w Alameda w Kalifornii. Dzisiaj pokażemy Ci procedurę nieinwazyjnego monitorowania wzrostu guza u myszy za pomocą bioluminescencji.

Procedura ta jest stosowana w naszym laboratorium i ivus lab, na całym świecie do badania wzrostu i rozwoju guza, zwłaszcza po leczeniu związkami leków. Więc zacznijmy. Procedura ta rozpoczyna się od przygotowania linii komórek nowotworowych do wstrzyknięcia myszy.

Szeroki zakres linii komórkowych rakowych wykazujących ekspresję lucyferazy może być wykorzystany w bioluminescencyjnych eksperymentach przedklinicznych. Komórki te są dostarczane jako wolna od patogenów zamrożona hodowla, która z łatwością rośnie w standardowych podłożach bez konieczności stosowania markerów selekcyjnych. W naszym eksperymencie użyjemy 41 Luke'a dwu mysich linii komórek guza sutka, która wyraża gen lucyferazy, który służy jako optyczny wskaźnik ekspresji genów lub nowotworu.

In vivo użyjemy ekspresji lucyferazy do nieinwazyjnego śledzenia wzrostu guza pierwotnego, ale może być również wykorzystana do lokalizacji i monitorowania zmian przerzutowych. Aktywność lucyferazy musi zostać zweryfikowana przed wstrzyknięciem, a w tym celu trypsyna zbiera 90% zlewającą się kolbę, a następnie zlicza. Następnie dozuje się 50 000 komórek do jednego dołka na płytce do mikromiareczkowania i przeprowadza się seryjne rozcieńczanie.

Lucyfer dodaje się do studzienek w ilości 150 mikrogramów na mililitr i inkubuje przez dwie minuty. Mikropłytkę można zobrazować w ivus lub czytniku płytek luminescencyjnych w celu określenia poziomów ekspresji. Ta linia komórkowa wyraża do 6 500 fotonów na sekundę na komórkę, ale każdy poziom ekspresji powyżej 30 fotonów na sekundę na komórkę może być z powodzeniem zobrazowany in vivo.

Teraz, gdy mamy komórki o optymalnej aktywności, możemy przejść do etapu iniekcji podskórnej. Aby ułatwić optymalne wykrycie guza, używamy szczepu myszy nagich z obniżoną odpornością A. Przed wstrzyknięciem zwierzęta są znieczulane przy użyciu 3% fluoru ISO przez pięć minut w celu głębokiego znieczulenia.

Następnie wstrzykniemy podskórnie w bok 250 000 komórek w stu mikrolitrach PBS. Załaduj komórki do strzykawki o pojemności jednego mililitra i przymocuj igłę o rozmiarze 26. Delikatnie unieś skórę kleszczami, aby zrobić namiot i wstrzyknij komórki u podstawy.

Nowo wstrzyknięte komórki można natychmiast zobrazować. W sumie 150 miligramów Lucyfera na kilogram masy ciała jest następnie podawane w dwóch zastrzykach do jamy otrzewnej. W tym badaniu zwierzęta są obrazowane 10 minut po wstrzyknięciu lucyferia, aby zapewnić stały strumień fotonów.

Pokażemy Ci to w następnym kroku. W naszym eksperymencie użyjemy systemu obrazowania in vivo widma IVUS, który wykorzystuje urządzenie sprzężone z ładunkiem wstecznie rozcieńczonym schłodzone do minus 90 stopni Celsjusza, aby osiągnąć maksymalną czułość. Aby umożliwić bezwzględną ocenę ilościową, system mierzy ciemny ładunek podczas przestoju i przeprowadza autokalibrację podczas inicjalizacji.

Aby rozpocząć obrazowanie, należy zainicjować system IVUS i ustawić parametry obrazowania dla eksperymentu. Wybierz pole widzenia. W przypadku liczby obrazowanych zwierząt w instrumencie można utrzymać do pięciu zwierząt za pomocą zintegrowanego kolektora znieczulającego.

Etap odbywa się przy stałej temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby utrzymać temperaturę ciała zwierząt. Port EKG służy do monitorowania stanu zdrowia zwierząt podczas stresujących procedur w żywym obrazie, ekspozycja, czas F-stop i wiązanie pix mogą być zoptymalizowane w oparciu o poziom ekspresji linii komórkowej. Ustawienia te można zmienić w dowolnym momencie eksperymentu bez wpływu na wynik ilościowy.

Ivus uzyskuje fotograficzny obraz zwierzęcia w białym świetle w ilościowym sygnale bioluminescencyjnym lub fluorescencyjnym, który jest nakładany na obraz, sygnał bioluminescencyjny jest wyrażany w fotonach na sekundę i wyświetlany jako mapa intensywności. Wyświetlanie obrazu jest regulowane w celu zapewnienia optymalnego kontrastu i rozdzielczości obrazu bez wpływu na ocenę ilościową. Luminescencję z komórek można zmierzyć w miejscu wstrzyknięcia za pomocą obszaru zainteresowania. Narzędzie.

Dane pomiarowe są wyświetlane w tabeli wraz ze wszystkimi parametrami eksperymentalnymi związanymi z przechwytywaniem obrazu, które można zapisać lub wyeksportować. Do analizy można uzyskać i porównać wiele obrazów oraz badania podłużne trwające sekundy lub miesiące, w zależności od charakteru eksperymentu. Będziemy mierzyć strumień fotonów z guza w czasie zero i monitorować przez cztery tygodnie.

Przy obrazowaniu w odstępach dwutygodniowych strumień fotonów z guza jest proporcjonalny do liczby żywych komórek wykazujących ekspresję lucyferazy. Tak więc bioluminescencja koreluje bezpośrednio z wielkością guza po pięciu dniach od implantacji. Guz nie jest jeszcze wyczuwalny, ale komórki można określić ilościowo za pomocą bioluminescencji i widać, że guz aktywnie rośnie.

Na tym etapie sygnał bioluminescencji jest znacznie silniejszy. Czas ekspozycji, przysłonę i obracanie pikseli można regulować tak, aby obraz był wyraźny, a aparat nie był nasycony. IVUS automatycznie kompensuje zmiany w zbieraniu światła.

Tak więc pomiary te można było porównać z tymi zebranymi wcześniej i później. W eksperymencie. Po 15 dniach od implantacji guzy są wyczuwalne palpacyjnie, a pomiar bioluminescencji wygenerował już dane z 15 dni.

Po 28 dniach guzy po implantacji stają się martwicze, a komórki zaczynają obumierać. Wielkość guza oszacowana za pomocą pomiaru suwmiarką nie zmienia się znacząco, ale luminescencja guza zmniejszy się. Wskazanie kalibru śmierci komórki i pomiar bioluminescencji można kontynuować aż do osiągnięcia humanitarnego punktu końcowego.

Martwica guza spowodowana niedotlenieniem lub schematami leczenia będzie wskazywana przez zmniejszoną bioluminescencję, nawet jeśli nie zmniejszą one masy guza. Właśnie pokazaliśmy, jak monitorować rozwój guza podskórnego, prosty model myszy ksenoprzeszczepu wykorzystujący obrazowanie bioluminescencyjne. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o sprawdzeniu poziomu ekspresji komórek przed implantacją.

Po drugie, aby uzyskać maksymalną odtwarzalność, zobrazuj zwierzęta w optymalnym czasie po wstrzyknięciu lucyferia. Czułość metody umożliwia monitorowanie rozwoju guza we wczesnych stadiach, ponieważ guzy można mierzyć za pomocą bioluminescencji na długo przed tym, jak będzie można je wiarygodnie zmierzyć za pomocą suwmiarki. Pamiętaj o optymalizacji parametrów obrazowania na każdym etapie Ten sygnał luminescencji nie nasyca się, ale dzięki luminescencji zwierzęta mogą być monitorowane ilościowo przez miesiące w celu zbadania efektów remisji i nawrotu.

Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.