Pierwotna hodowla miocytów serca dorosłego szczura

Zabieg rozpoczyna się od wycięcia serca dorosłego szczura i zawieszenia go na układzie perfuzyjnym. Roztwory enzymatyczne pozostawia się do perfuzji przez około 30 minut, po czym usuwa się serce. Rozdrobnione i enzymatyczne trawienie pozostawione do kontynuowania w małej zlewce.

Pod koniec trawienia komórki są dysocjowane na zawiesinę pojedynczej komórki przez mechaniczne mieszanie i filtrowane do sterylnej probówki. Pierwotne komórki serca są trzykrotnie myte w o rosnącym stężeniu wapnia, ponownie zawieszane w hodowli, pożywce i platerowane na pokrytych laminatem szalkach do hodowli tkankowych. Cześć, jestem Shahi i pracuję w laboratorium Henry'ego Cowa na Wydziale Fizjologii i Fizyki Komórkowej na Uniwersytecie Columbia.

Dzisiaj pokażemy Ci procedurę izolowania i hodowli innych komórek serca szczura. Używamy tej procedury w naszym laboratorium do badania kanałów wapniowych w sercu. Więc zacznijmy.

Dzień przed operacją na szczurach upewnij się, że wszystkie roztwory są przygotowane, ale nie dodawaj jeszcze żadnych enzymów. A, B i bufor do płukania powinny być przefiltrowane pod kątem sterylności przed przechowywaniem w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Sześć dokładnych płytek do hodowli tkankowych należy również dzień wcześniej pokryć roztworem laminatu i przechowywać w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze CO2.

W dniu zabiegu. Przygotuj narzędzia chirurgiczne, odkażając nożyczki zaciskowe i kleszcze 70% etanolem i pozostaw do wyschnięcia na ręczniku papierowym. Gotowa jest strzykawka o pojemności jednego mililitra wypełniona pół mililitrem roztworu heparyny.

Teraz dobrą praktyką jest mycie aparatu perfuzyjnego przepuszczającego 70% etanol z pompą perystaltyczną w odwrotnym kierunku. Po zakończeniu, płukaniu etanolem, przepłukać aparat wodą podwójnie destylowaną, a na koniec spłukać buforem A. Przepływ zbiera się do zlewki i umieszcza w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby przygotować oczyszczony aparat do profuzji, napełnij prawą rurkę strzykawki 40 mililitrami buforu A, a lewą rurkę strzykawki 40 mililitrami buforu B. Zalej rurkę perfuzyjną do końcówki cewnika, pozwalając buforowi A przepływnąć przez aparat.

Napełnij bufor strzykawką do poziomu 40 mililitrów. Upewnij się, że po tym kroku w rurkach nie ma pęcherzyków powietrza, teraz odciąć bufor, strzykawkę z zaworem odcinającym i powtórzyć proces tak, aby rurka profuzyjna była teraz zalana buforem B. Aparat do obfitości jest wreszcie gotowy i pozostaje z buforem. B zawór kurka odcinającego otwarty, ale przepływ jest zatrzymany.

Za pomocą regulatora na przewodzie dożylnym wylać przepływ buforu do zlewki zbiorczej. Ostatnią rzeczą, którą należy zrobić przed operacją, jest dodanie wymaganych enzymów do roztworu podstawowego, a następnie przefiltrowanie roztworu enzymatycznego, tak jak inne roztwory zostały przefiltrowane dzień wcześniej. Po przefiltrowaniu roztwór ten można pozostawić w temperaturze pokojowej zgodnie ze standardowym protokołem.

Poddaj szczura eutanazji izofluorem w komorze gazowej. Zdezynfekuj obszar nacięcia na klatce piersiowej 70% etanolem. Otwórz klatkę piersiową za pomocą nożyczek i odsłoń serce.

Wstrzyknąć do lewej komory 0,5 mililitra roztworu heparyny. Usuń serce z nienaruszoną dużą częścią aorty. Natychmiast wprowadzić cewnik do aorty.

Typowe serce szczura powinno dawać dużą frakcję zdrowych miocytów w kształcie pręcików i kilka martwych zaokrąglonych komórek. Jeśli poniższa procedura jest prawidłowo przestrzegana, aby rozpocząć zaciskanie aorty na cewniku. Końcówka cewnika nie powinna być wciskana zbyt głęboko w serce, aby zapewnić dobre ukrwienie serca przez tętnicę wieńcową.

Po zaciśnięciu przywiąż aortę do cewnika za pomocą szwu. Następnie otwórz regulator linii dożylnej, aby umożliwić szybkie kapanie i pozwól pszczole buforowej wypłukać serce podczas płukania pszczoły buforowej. Użyj małych nożyczek i kleszczy, aby usunąć przedsionki i wszelką tkankę tłuszczową lub płucną przylegającą do serca.

Po zakończeniu buforu B przełącz na chwilę przepływ na bufor. Bufor A może płynąć przez pięć minut. Ogrzej roztwór enzymu w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Gdy bufor A jest zubożony ze strzykawki, ale nadal obecny w przewodach, należy załadować 50 mililitrów roztworu enzymatycznego w strzykawce A aparatu do fuzji. Teraz konieczne jest odrzucenie całego przepływu ze zlewki zbiorczej w łaźni wodnej, aż roztwór enzymu dostanie się do serca. Gdy tylko roztwór enzymatyczny dostanie się do serca, aktywuj pompę perystaltyczną, która jest ustawiona w celu przenoszenia roztworu enzymu ze zlewki zbiorczej do uzupełnionej strzykawki.

A pozwól, aby roztwór enzymu przepływał przez serce przez 10 minut. Gdy serce trawi, zaczyna wyglądać na wzdęte przy 37,5 mikrolitrach 0,1-molowego chlorku wapnia do roztworu enzymu w strzykawce A, aby uzyskać skuteczne stężenie 0,1 milimolowego wapnia. Jest to pierwszy z kilku dodatków chlorku wapnia stosowanych w celu zwiększenia stężenia po 10 minutach, zwiększenia stężenia wapnia do 0,2 milimola poprzez dodanie dodatkowych 50 mikrolitrów 0,1 molowego chlorku wapnia do strzykawki A i pozostawienia obfitości przez kolejne 10 minut.

Po upływie 10 minut odciąć komory i przenieść serce do małej sterylnej zlewki zawierającej 20 mililitrów roztworu enzymatycznego w zlewce. Zwiększ stężenie wapnia do 0,4 milimola, dodając 40 dodatkowych mikrolitrów 0,1-molowego chlorku wapnia, delikatnie zmiel serce na 10 lub więcej kawałków za pomocą małych sterylnych nożyczek. Teraz inkubuj zlewkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, delikatnie kołysząc.

Po pięciu minutach inkubacji dodaj 40 mikrolitrów 0,1-molowego chlorku wapnia, aby uzyskać skuteczne stężenie 0,6 milimolowego wapnia i delikatnie powtórz kawałki serca plastikową pipetą transferową trzy do pięciu razy po inkubacji przez dodatkowe pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, dodaj 40 mikrolitrów 0,1 molowego chlorku wapnia i delikatnie powtórz jak poprzednio. Użyj sterylnego filtra o średnicy 500 mikrometrów, aby oddzielić strawione pojedyncze miocyty od niestrawionej tkanki łącznej. Pozwól komórkom osiąść w 50-mililitrowej probówce przez 10 minut w temperaturze pokojowej, szarpnij, wyrzuć supernatant z transferem VI Delikatnie zawieś ponownie komórki w buforze do płukania numer jeden i pozwól komórkom osiąść przez 10 do 20 minut w temperaturze pokojowej, podczas gdy komórki osiadają.

Weź małą porcję i wykorzystaj ten czas jako okazję do oceny jakości i żywotności komórek w zawiesinie pod odwróconym mikroskopem. Dobry preparat będzie zawierał dużą ilość komórek przypominających pręciki z wyraźnymi prążkami. Gdy komórki osiądną, wyrzuć snat i delikatnie zawieś komórki w buforze do mycia.

Po drugie, pozwól komórkom osiągnąć w temperaturze pokojowej, co powinno ponownie zająć od 10 do 20 minut i wyrzuć supernatant. Delikatnie zawiesić komórki w 5% pożywce surowicy przed przeniesieniem komórek na płytki do hodowli tkankowych. Umyj płytki jednym XSFM.

Przenieść komórki o żądanej gęstości i inkubować w inkubatorze do hodowli tkankowych CO2. Na trzy do pięciu godzin zmień pożywkę na jedną Komórki XSFM można hodować przez okres do czterech dni i wykorzystywać w razie potrzeby do eksperymentów. Pod odwróconym mikroskopem powinno znajdować się ponad 70% żywych miocytów serca, jeśli protokół jest wykonany prawidłowo.

Są to izolowane miocyty transfekowane YFP REM po hodowli przez 48 godzin. Komórki tej jakości są zwykle hodowane w wyniku tej procedury. Pokażemy tylko, jak się wyizolować, a kultura to gorące komórki.

Wykonując tę procedurę, należy pamiętać, aby być tak szybkim i czystym, jak to tylko możliwe. Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.