Hodowla i utrzymanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Cześć, nazywam się Leah Kent i pracuję w STEM Gent. Dzisiaj pokażemy Ci procedury karmienia, usuwania różnicowania i pakowania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych. Używamy tych technik w naszym laboratorium do rutynowej hodowli i konserwacji komórek HES.

Więc zacznijmy. Ogólną jakość hodowli ocenia się, obserwując kolonie przy niskiej mocy przy użyciu dwóch lub pięciu powiększeń. Patrząc na komórki pod mikroskopem, zwróć uwagę na następujący normalny kolor podłoża: brak widocznych zanieczyszczeń, wielkość i gęstość kolonii oraz ogólną jakość komórek.

Świeża pożywka do hodowli ludzkich komórek ES ma zwykle pomarańczowy lub słomkowy kolor po całonocnej inkubacji. Pożywka hodowlana często wydaje się bardziej żółta ze względu na zmianę pH i wyczerpanie składników odżywczych w pożywce. Jeśli podłoże wydaje się fioletowe, jak pokazano w tym przykładzie, nastąpiło zasadnicze przesunięcie pH.

Jeśli pożywka wydaje się bardzo żółta, oznacza to, że podłoże uległo zakwaszeniu, co może być wynikiem skrajnie przeludnionych kolonii lub zanieczyszczenia. Podłoże powinno być przez cały czas klarowne. Jeśli kultura nie zawiera dużych lub gęstych kolonii, komórki nie wymagają pakowania, ale wymagają codziennego karmienia.

Zabierz komórki do szafy bezpieczeństwa biologicznego. Zdejmij pokrywkę naczynia hodowlanego i odessaj zużytą pożywkę. Nie pozwól, aby końcówka pipety dotykała jakiejkolwiek części płytki innej niż bezpośrednio wewnątrz studzienek.

Używając sterylnej szklanej pipety z odpowiednią ilością ciepłej hodowli ludzkich komórek ES, pożywką do każdego dołka dla kultur na płytce sześciodołkowej w ilości 2,5 mililitra pożywki na basenik po podaniu komórek, należy umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze. Różnicowanie często występuje na obrzeżach kolonii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych. Za pomocą mikroskopu i sterylnego narzędzia do pobierania zróżnicowane komórki można delikatnie usunąć z krawędzi kolonii, pozostawiając niezróżnicowane komórki.

W celu kontynuacji hodowli tę samą procedurę można zastosować podczas usuwania zróżnicowanych komórek ze środka kolonii, pozostawiając pierścień niezróżnicowanych ludzkich komórek ES wokół obszaru komórek, które zostały usunięte. Jeśli kultura zawiera więcej niż około 10% różnicujących się kolonii, komórki należy oczyścić, ręcznie usuwając zróżnicowane obszary. Aby to zrobić najpierw, przekształć dziewięciocalowe szkło obok pipet w narzędzia do zbierania.

Formując końcówki nad kontrolowanym płomieniem palnika alkoholowego, upewnij się, że końcówka pipety jest uszczelniona, aby zapobiec zanieczyszczeniu i zaokrąglona. Aby uniknąć zarysowania plastiku naczynia hodowlanego przed użyciem narzędzi do zbierania, sterylizuj je za pomocą źródła światła UV w komorze bezpieczeństwa biologicznego przez 15 do 20 minut. Aby usunąć zróżnicowane komórki, najpierw oddziel je od reszty kolonii, rysując linię przez kolonię końcem narzędzia do wybierania.

Po oddzieleniu kawałków kolonii delikatnie przesuwaj narzędzie do zbierania po płytce, aby odłączyć niechciane komórki. Uważaj, aby w tym procesie nie zeskrobać zbyt dużej ilości warstwy podajnika metamfetaminy między koloniami. Gdy wszystkie zróżnicowane komórki zostaną usunięte z płytki i unoszą się w pożywce, należy przenieść hodowlę do komory bezpieczeństwa biologicznego.

Odessać pożywkę zawierającą zróżnicowane komórki i zastąpić ją świeżą ludzką hodowlą ESL. Medium do przejścia. Ludzkie komórki Ees.

Kolonie są delikatnie zeskrobywane z powierzchni płytki hodowlanej za pomocą pipety serologicznej po krótkiej inkubacji enzymów, która chce, aby wszystkie studzienki zostały zeskrobane. Kawałki kolonii zbiera się w 15-mililitrowej stożkowej probówce i odwirowuje w celu uzyskania luźno upakowanego osadu komórkowego. Supernatant jest następnie usuwany, a osad komórkowy jest ponownie zawieszany do komórki o odpowiedniej wielkości.

Agregaty przez pipetowanie w świeżej pożywce dla ludzi związanych z ESL. Po wypłukaniu nowej płytki hodowlanej zawierającej świeżo napromieniowaną warstwę podajnika metamfetaminy, ludzkie komórki Ees są równomiernie rozmieszczone w dołkach nowej płytki i pozostawione do przyczepienia się na noc. Jeśli hodowla zawiera duże lub gęste kolonie lub warstwa zasilająca MEF ma więcej niż 12 dni, komórki należy przenieść do sterylnej komory bezpieczeństwa biologicznego.

Zdjąć pokrywkę sześciostudzienkowego naczynia do hodowli i odessać zużytą pożywkę z dołków, które mają być przepuszczone. Używając sterylnej szklanej pipety, dodaj jeden mililitr podgrzanej kolagenazy cztery do każdej studzienki, która ma być przepasana. Włóż płytkę do inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza na pięć minut.

Po pięciu minutach obserwuj kolonie pod mikroskopem. Enzym powinien spowodować subtelną, ale obserwowalną zmianę na krawędziach kolonii. Stają się bardziej wyraziste, a wokół nich może pojawić się lekka aureola.

W komorze bezpieczeństwa biologicznego delikatnie odessać enzym z każdej studzienki i zastąpić dwoma mililitrami ludzkiej hodowli komórek ES. Średni. Przechyl lekko płytkę hodowlaną do siebie i weź dwa mililitry pożywki. W pierwszym dołku za pomocą szklanej pipety o pojemności pięciu mililitrów, trzymając pipetę prostopadle do dna płytki, delikatnie przesuwaj końcówkę pipety po studzience.

Powoli uwalniając pożywkę. Powtórz ten ruch skrobania i pipetowania trzy do czterech razy, aż wszystkie kolonie zostaną usunięte ze studzienki. Kiedy komórki zostaną usunięte z pierwszego, dobrze pozostaw zawartość w studzience i zacznij zeskrobywać komórki z następnej studzienki.

Po zeskrobaniu wszystkich studzienek, które mają być przeprowadzone, należy delikatnie zebrać pożywkę zawierającą kawałki kolonii z każdej studzienki w sterylnej 15-mililitrowej stożkowej pipecie z rurką, aby uniknąć rozbicia kolonii na zbyt małe kawałki. Małe płukanie zeskrobanych studzienek, dodając jeden mililitr ludzkiej kultury ESL. Średnio do każdego.

Dobrze zbierz to płukanie i delikatnie przenieś do stożkowej rurki w komórkach w probówce, aby rozbić kawałki kolonii do pożądanego rozmiaru. Odwirowywać komórki przez pięć minut w temperaturze 200 Gs, podczas gdy ludzkie komórki są odwirowywane. Przygotuj nową sześciodołkową płytkę podającą metamfetaminę.

Oznaczyć tabliczkę odpowiednią ludzką komórką ES informacyjną o linii komórkowej, numerze nowego pasażu i dacie przejścia. Odessać pożywkę metamfetaminy ze studzienek i dodać do każdej z nich jeden mililitr PVS. Dobrze delikatnie zakręć buforem wokół studzienek i zassaj płucz PBS.

Dodaj 1,5 mililitra ludzkiej kultury ESL. Pożywkę do każdej studzienki i odłóż talerz na bok. Po odwirowaniu ludzkich komórek ES należy przenieść probówkę z powrotem do szafy bezpieczeństwa biologicznego.

Odessać supernatant. Uważając, aby nie naruszyć luźno upakowanej osadki komórkowej. Ponownie zawiesić komórki w osadzie z wystarczającą ilością pożywki na jeden mililitr ludzkiej kultury ESL, pożywkę na nową studzienkę do platerowania.

Na przykład, podczas dzielenia na sześć nowych studzienek, resus, zawiesić pelety w sześciu mililitrach podłoża. Delikatnie odpipetuj kolonie, aby rozbić kawałki do odpowiedniej wielkości i równomiernie rozproszyć kawałki kolonii. Dodaj jeden mililitr zawiesiny komórkowej do każdego przygotowanego dołka płytki podającej MEF.

Umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i ostrożnie przesuń płytkę do przodu do tyłu i przesuń na bok, aby równomiernie rozprowadzić komórki w całej studzience. Pozwól komórkom przyczepić się w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Zróżnicowane ludzkie komórki ES mogą mieć różne morfologie, ale zwykle składają się z większych i bardziej rozproszonych komórek.

Różnicowanie może wystąpić w obrębie kolonii lub między koloniami. Są to różne morfologie ludzkich kultur ES, które można zobaczyć w małym powiększeniu pod mikroskopem. Dobra morfologia komórek i kolonii wygląda tak.

Komórki są bardzo małe, ciasno upakowane i rosną w monowarstwie. Kolonie powinny mieć czyste i wyraźne krawędzie z niewielkim lub zerowym zróżnicowaniem. Aby utrzymać zdrowe ludzkie hodowle ESL, komórki muszą być pasażowane w optymalnym czasie.

Kolonie, które są gotowe do pakowania, prawie osiągnęły maksymalny rozmiar kolonii, ale nie zaczęły się ze sobą łączyć ani różnicować. Nie czekaj, aż kolonie przerosną, aby je przejść. Właśnie pokazaliśmy, jak utrzymać zdrowe hodowle komórek HES podczas wykonywania tych procedur.

Upewnij się, że zachowujesz dobrą sterylną technikę i zawsze miej kopię zapasową. Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.