Izolacja ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC)

Ten protokół wideo ilustruje izolację i hodowlę komórek śródbłonka żyły pępowinowej człowieka (HUVEC) z ludzkiej pępowiny. Po wyizolowaniu komórki te można wykorzystać do testów angiogenezy in vitro, takich jak zoptymalizowany test kulek żelowych fibryny, również zademonstrowany przez laboratorium Hughes.

Cześć, nazywam się Jager Davis i dzisiaj pokażę Ci, jak wyizolować ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej, znane również jako ic. Będziemy używać różnych pożywek, zaczynając od roztworu soli równoważnej Hanka, który będzie używany do oczyszczania naszych komórek z wszelkich czerwonych krwinek lub innych zanieczyszczeń, które mogą znajdować się w żyle. Po drugie, będziemy używać kolagenazy zawieszonej w DPBS, a ten roztwór zostanie użyty do usunięcia naszego ubic z żyły i będziemy się posiewać w 20% pożywce, czyli M1 99 z ciepłem w aktywowanym FBS i roztworze do usuwania pióra.

Będziemy również uzupełniać naszą zawiesinę Resus o suplement wzrostu komórek śródbłonka firmy BD Biosciences. Dobra, mam parę nożyczek preparacyjnych. Zamierzam wykonać cięcie prosto w poprzek przewodu w ten sposób.

W następnym zamierzam iść dalej i wyczyścić przewód. Więc to, co zamierzam zrobić, to zidentyfikować tętnice i żyłę. Są więc dwie tętnice i jedna żyła.

Zwykle identyfikuję tętnice po tych dwóch. Oni wychodzą w twoją stronę. Mamy więc jedną arterię tutaj, a drugą tutaj.

Jak widzicie, żyła wchodzi do pępowiny i to właśnie tam umieścimy naszą igłę motylkową. Używamy igły motylkowej Accutane o rozmiarze 21 i trzech czwartych. Więc otwórz to.

Po prostu wejdę w ten sposób. Ponownie, zamierzam zidentyfikować tętnice. Mamy jedną tętnicę i drugą tętnicę, a potem jest nasza żyła.

Wezmę więc igłę motylkową i włożę ją do żyły bardzo delikatnie, ale możesz napotkać pewien opór. Lubię więc po prostu lekko przekręcić sznurek, a następnie popchnąć igłę w tym samym czasie i wykonać ten rodzaj ruchu, i po prostu kontynuować, aż skrzydełka igły motylkowej zrównają się ze sznurkiem, tak po prostu. I wszystko jest gotowe i śmiało to zaciskamy.

Więc to, co zamierzam teraz zrobić, to napełnić dwie strzykawki o grubości 20 mililitrów atramentem. Następnie zamierzam napełnić stożkową fiolkę o pojemności 50 mil z pięcioma mililitrami 20% efektu. A następnie zamierzam odpipetować 10 mililitrów DPBS do jednej z tych stożkowych fiolek o średnicy 15 mililitrów.

Więc te 15 miligramów DPBS, dodam 10 miligramów naszego proszku kolagenazy, które odmierzę w równowadze. I zamierzam ponownie zawiesić kolagenazę, po prostu odwracając tubkę kilka razy, aż proszek zejdzie ze ścianek tubki. Więc około pięć lub sześć razy po tym, zamierzam sterylnie przefiltrować kolagen za pomocą strzykawki o średnicy 10 mil, aby dodać filtr.

A teraz jesteśmy gotowi, aby przepuścić te media przez przewód. Więc to, co zrobiłem, to wlałem pozostały DPPS do tego litrowego piekarnika i zamierzam umieścić go w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni i pozwolić mu się rozgrzać. A to posłuży do inkubacji naszego sznurka przez około 15 minut.

To jest nasze rozwiązanie z filtrowaną kolagenazą. Umieszczę tę stożkową fiolkę w kąpieli wodnej o temperaturze 37 stopni, pozwalając jej się rozgrzać, a następnie użyję jej w dalszej części procedury, aby usunąć uve z wnętrza naszej żyły. Więc to, co zamierzam zrobić dalej, to zacisnąć pępowinę na końcu igły motylkowej i zamierzam przepuścić przez nią 20 milicali motków, aby wypłukać wszelkie krwinki.

Po zabezpieczeniu igły motylkowej zamierzam przepchnąć 20 milicali naszych motków. Zamierzam to robić bardzo powoli, aby zapobiec pęknięciu żyły. I chodzi o prędkość, z jaką chcesz, aby wyszedł, ale nie chcesz przesyłać strumieniowo motków.

Oznacza to, że naciskasz na to zbyt mocno. Więc zwykle to robię, wiesz, kropla po kropli. I znowu wpycham motki tylko po to, żeby oczyścić żyłę.

A ty odsłaniasz nasze komórki końcowe. Więc po tym przeszliśmy przez wszystkie nasze zawieszenia. Zamierzam iść dalej i położyć przewód, a następnie zamierzam zacisnąć dolny koniec przewodu i wyjąć strzykawkę, umieścić ją w torbie na wypadek zagrożenia biologicznego.

Następną rzeczą jest dołączenie nowej strzykawki o średnicy 10 mil. Okej, następnie wepchnę kolagenazę przez przewód, a to ma na celu wypłukanie wszelkich resztek wisienia, które mogą pozostać w naszej żyle. A ja przepchnę kolagenazę tylko na tyle.

Więc kiedy wyjdzie z końca tutaj, zobaczymy go mniej więcej tego samego koloru, co to, co jest w strzykawce. A potem zamierzam zacisnąć dolny koniec przewodu. To, co zamierzam teraz zrobić, to przepchnąć trochę więcej kolagenazy na tyle, aby zobaczyć, jak przewód się rozszerza.

Więc po tym, jak trochę się rozwinie, pójdę dalej i masuję przewód, zaczynając od lewej do prawej. Zwykle używam trzech palców przy dość mocnym nacisku. To prawie jak wałkowanie ciasta na nitki.

Nie chcesz iść i pchać przewodu zbyt mocno, ale nie za miękko. Jeśli popchniesz go zbyt mocno, masz ryzyko zanieczyszczenia mięśni gładkich. Ale jeśli zrobisz to zbyt delikatnie, nie usuniesz żadnej części Q z powrotem.

Więc w około pięć do sześciu sekund w jednym miejscu i w pewnym sensie schodzisz w dół. Więc pójdę dalej i przeniosę przewód ze stołu do łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni, a następnie pozostawię go na 15 minut i będę inkubował. Więc jedna partia, którą być może będziesz musiał inkubować przez 15 minut.

Kolejna partia może trwać 20 minut, a trzecia partia może trwać 10 minut. Dlatego ważne jest, aby zoptymalizować czas inkubacji dla naszej konkretnej partii. Oto 15 minut.

Pójdziemy dalej i usuniemy nasze przewody z wanny DPVS. Położymy go tutaj na chwilę. Zdejmujemy nakrętkę z naszej stożkowej fiolki o pojemności 15 mililitrów, zawierającej nasze pięć mililitrów 20% mięsa.

20%feck ma inhibitor trypsyny, więc zatrzyma działanie naszej kolagenazy. Więc pójdę dalej i przytrzymam sznurek nad rurką naszymi nożyczkami. A to, co zamierzam teraz zrobić, to przeciąć wzdłuż linii naszego zacisku.

W tym miejscu przenosisz dolną sekcję. Okej, więc teraz mamy świeże cięcie na końcu naszego sznurka. A to, co zamierzam teraz zrobić, to przepchnąć się przez naszą kolagenazę.

I znowu, podobnie jak w przypadku motków, nie chcesz pchać zbyt szybko. A chodzi o prędkość, z jaką chcesz przepchnąć swoją natychmiastową realizację. I to by było na tyle, jeśli chodzi o naszą kolagenazę.

Czasami może się okazać, że strzykawka jest zamocowana trochę zbyt mocno. Więc to, co zrobię w takich sytuacjach, to użyję zacisku, który mieliśmy na naszej pępowinie i po prostu złapię go tutaj i delikatnie przykręcię, i tylko na tyle, aby się poluzował i mogę go usunąć ręką lub usunąć sam. Więc następnie wezmę naszą pozostałą strzykawkę o grubości 20 mil i przymocuję ją do naszej igły, a następnie przepchnę całą objętość zawieszenia.

Ponownie, zamierzam przeć bardzo powoli, tak jak w przypadku kolagenazy i drugiej strzykawki z motkami, tutaj pojawia się kropla po kropli. Chodzi o prędkość, z jaką chcesz przepchnąć swoje multimedia. Zawiera 20% efektu są motki i nasz roztwór kolagenazy.

Więc to, co zamierzam teraz zrobić, to umieścić go w wirówce i wirować przez pięć minut z prędkością 1200 obr./min. Więc zamierzam dokładnie sprawdzić, aby upewnić się, że pokrywa jest bezpieczna. Nasza dwójka, a ja umieszczę ją w naszej wirówce.

Mamy wirowanie przez pięć minut przy 1200 obr./min. Więc obróciliśmy naszą stożkową fiolkę o pojemności 50 mil przez pięć minut przy 1200 sugerowanej cenie detalicznej M. A to, co nam pozostało, to mała granulka na dnie tuby. To, z czego składa się ta pastylka, to niektóre pozostałe czerwone krwinki i nasze komórki śródbłonka.

To, co zrobię dalej, to zassanie Berneta i reusa, zawieszenie naszego pelletu i delikatne głaskanie pięciu mililitrów rury zasilanej 20% w górę iw dół kilka razy, aż okaże się, że w zawiesinie jest niewiele zanieczyszczeń. I zamierzam pogłaskać całe pięć mililitrów i nałożyć je na T 25 fla. Staram się i jestem ostrożny, aby nie generować żadnych bąbelków.

I zamierzam dodać swoje ECPS. Dodam 50 mikrolitrów i po prostu delikatnie kołyszę kolbą, aby upewnić się, że wszystkie ECPS rozprowadzają się w klasie. I to wszystko.

Dalej. Kolba i inkubować 37 stopni.