Name: Izolacja ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-04-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Naucz się izolacji komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) z pępowiny ludzkiej do badań nad angiogenezą. Protokół obejmuje enzymatyczne uwolnienie komórek kolagenazą i hodowlę in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Procedura
<ol>
<li>Położyć pępowinę na czystej podkładce i odsączyć nadmiar krwi. Wykonać świeże cięcia na obu końcach pępowiny.</li>
<li>Wprowadzić igłę 21 1/2 G z założoną plastikową osłonką do żyły. (Żyła to największy otwór; dwa mniejsze to tętnice)</li>
<li>Zacisnąć igłę w miejscu za pomocą kleszczyków hemostatycznych i podłączyć do igły strzykawkę 20cc z roztworem Hanksa.</li>
<li>Przepchnąć roztwór Hanksa przez żyłę z umiarkowanym naciskiem. Zebrać odpady do zlewki z wybielaczem. (Przytrzymywanie igły i pępowiny jedną ręką podczas pchania zapobiegnie wysunięciu się igły z żyły). Jeśli w żyle znajduje się dużo krwi, wypłukać ją drugi raz.</li>
<li>Położyć pępowinę na podkładce i zacisnąć drugi koniec żyły. Wypełnić kilkoma mL roztworu Hanksa, aby sprawdzić szczelność wzdłuż pępowiny. Odciągnąć 5 mL i odłączyć dolny zacisk.</li>
<li>Odłączyć strzykawkę 20cc. Wyjąć tłok ze strzykawki 10cc. Podłączyć strzykawkę 10cc do igły, wlać 10ml kolagenazy i założyć tłok. Wprowadzić kolagenazę do żyły, aż pierwsza porcja wypłynie z otwartego końca. Ponownie zacisnąć otwarty koniec i wypełniać kolagenazą do momentu umiarkowanego rozszerzenia żyły. Zbyt duże rozszerzenie prowadzi do zanieczyszczenia komórkami mięśni gładkich.</li>
<li>Delikatnie masować pępowinę.</li>
<li>Inkubować pępowinę (z założonymi kleszczykami, igłą i strzykawką) w DPBS w temperaturze 37°C przez 15 min.</li>
<li>Podczas inkubacji kontynuować kroki 1-8 z 2nd pępowiną.</li>
<li>Po inkubacji wyjąć pępowinę ze zlewki i, trzymając ją nad probówką 50mL, odciąć koniec powyżej dolnego zacisku. Należy upewnić się, że wszystko zostało zebrane do probówki. Przepchnąć pozostałą kolagenazę przez pępowinę, następnie podłączyć strzykawkę 20cc i przepchnąć roztwór Hanksa z umiarkowanym naciskiem.</li>
<li>Jeśli komórki mięśni gładkich nie są potrzebne, utylizować pępowinę na tym etapie. W przeciwnym razie umieścić tę samą pępowinę w drugiej probówce 50mL z ~5ml kolagenazy i inkubować w 37°C przez 30-60 min.</li>
<li>Przechowywać probówki do czasu obróbki wszystkich pępowin.</li>
<li>Wirować probówki przy ~1200 rpm przez 5 min.</li>
<li>Odssać nadsącz (z wyjątkiem ~1-2 mL). Resuspendować osad w 5mls PHEC+ i wysiać do naczynia T25.</li>
<li>Inkubować w 37°C przy 5% CO2 przez noc.</li>
<li>Następnego dnia usunąć nadsącz i zastąpić go świeżą pożywką. Jeśli występuje dużo RBC, przemyć raz medium M199, a następnie dodać PHEC+. Kontynuować inkubację w zwykły sposób, aż warstwa komórek w naczyniu stanie się konfluentna (1-4 dni). Przesiać do żelatynizowanego naczynia T75.</li>
<li>Gdy T75 stanie się konfluentne, przenieść komórki do trzech naczyń T75. Zamrozić dwie fiolki z każdego naczynia.</li>
</ol>
Uwaga: Komórki śródbłonka (nieaktywne) mają wygląd brukowany. Komórki śródbłonka bywają czasami aktywowane (wydłużone i zaostrzone) bezpośrednio po izolacji; po kilku pasażach zazwyczaj powracają do stanu nieaktywnego.
Sprzątanie
<ol>
<li>Bardzo ostrożnie wyrzuć igły do pojemnika na odpady ostre.</li>
<li>Wyrzuć strzykawki do dużego pojemnika na odpady biologiczne.</li>
<li>Umieść wszystkie tkanki w małej torebce na odpady biologiczne. Zamknij torebkę&nbsp;i zamroź w temperaturze -20° do czasu spalenia.</li>
<li>Namocz wszystkie instrumenty w środku wirubójczym przez co najmniej 10 min.</li>
<li>Dodaj podłoża inkubacyjne do zlewki z odpadami/wybielaczem. Pozostaw na co najmniej 10 min.</li>
<li>Wyrzuć podkładki laboratoryjne do odpadów biologicznych.</li>
<li>Spryskaj wnętrze i zewnętrzną stronę zlewek, blat laboratoryjny oraz pokrywę łaźni wodnej środkiem wirubójczym. Pozostaw na 10 min, a następnie wytrzyj.</li>
<li>Opłucz zlewki i instrumenty ciepłą wodą i powieś na stojaku do wyschnięcia (osusz instrumenty, aby nie zardzewiały).</li>
<li>Wylej zdekontaminowane odpady do zlewu.</li>
<li>Włóż niewykorzystane podłoża z powrotem do lodówki.</li>
<li>Wyrzuć rękawiczki do odpadów biologicznych.</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0,1% kolagenaza </td><td></td><td></td><td>10 mL na pępowinę, ogrzane do 37 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Flaski do hodowli tkankowych</td><td></td><td></td><td>T75, jedna na pępowinę.</td></tr><tr><td>Pożywka Hanksa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>nożyczki</td><td></td><td></td><td>sterylne</td></tr><tr><td>zlewka</td><td></td><td></td><td>sterylna</td></tr><tr><td>probówki 50 mL</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (huvec)

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

Angiogeneza to złożony, wieloetapowy proces, w którym w odpowiedzi na bodźce angiogenne z istniejącego układu naczyniowego powstają nowe naczynia. Etapy te obejmują: degradację błony podstawnej, proliferację i migrację (kiełkowanie) komórek śródbłonka (EC) do macierzy zewnątrzkomórkowej, ustawianie się EC w sznury, formowanie światła naczynia, anastomozę oraz tworzenie nowej błony podstawnej. Opracowano wiele testów in vitro do badania tego procesu, jednak większość z nich naśladuje jedynie określone stadia angiogenezy, a naczynia pod względem morfologicznym często nie przypominają naczyń in vivo. Przedstawiamy tutaj zoptymalizowany test angiogenezy in vitro z wykorzystaniem ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej oraz fibroblastów. Model ten odwzorowuje wszystkie kluczowe wczesne etapy angiogenezy, a co istotne, naczynia wykazują drożne światła wewnątrzkomórkowe otoczone spolaryzowanymi komórkami EC. Naczynia można łatwo obserwować za pomocą mikroskopii fazowo-kontrastowej i time-lapse oraz odzyskiwać w czystej formie do dalszych zastosowań.

Niniejszy protokół wideo przedstawia izolację i hodowlę ludzkich komórek śródbłonka żyły pępekowej (HUVEC) z ludzkiej pępowiny. Po izolacji komórki te mogą być wykorzystywane w testach angiogenezy in vitro, takich jak zoptymalizowany test kulek z żelu fibrynowego, zaprezentowany również przez laboratorium Hughesa.

Izolacja ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC)

Angiogeneza jest złożonym, wieloetapowym procesem, w którym w odpowiedzi na bodźce angiogenne z istniejącego układu naczyniowego powstają nowe naczynia. Etapy te ...

Witam, nazywam się Jager Davis i dzisiaj pokażę Państwu, jak izolować ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej, znane również jako HUVEC. Będziemy używać różnych pożywek, zaczynając od zrównoważonego roztworu soli Hanksa, który posłuży do oczyszczenia komórek z erytrocytów lub innych zanieczyszczeń, które mogą znajdować się w żyle. Po drugie, użyjemy kolagenazy resuspendowanej w DPBS; roztwór ten posłuży do uwolnienia HUVEC z żyły, a następnie wysiejemy je na pożywkę wzrostową 20%, która składa się z M199 z inaktywowanym termicznie FBS oraz roztworem pen-strep.Będziemy również uzupełniać naszą zawiesinę Resus suplementem wzrostu komórek śródbłonka firmy BD Biosciences. Dobrze, mam parę nożyczek sekcyjnych. Wykonam cięcie prostopadle przez sznur w ten sposób.W następnym kroku zajmę się oczyszczeniem pępowiny. Najpierw zidentyfikuję tętnice i żyłę. Występują tutaj dwie tętnice oraz jedna żyła.Zazwyczaj identyfikuję tętnice jako dwie struktury skierowane w stronę obserwatora. Mamy tutaj jedną tętnicę, a tutaj drugą.Jak widać, żyła wchodzi bezpośrednio w pępowinę i to właśnie w tym miejscu umieścimy igłę motylkową. Używamy igły motylkowej Accutane o rozmiarze 21 G i długości 3/4 cala. Proszę ją teraz otworzyć.Przystępuję do pracy w ten sposób. Ponownie zidentyfikuję tętnice. Mamy pierwszą tętnicę i drugą tętnicę, a następnie naszą żyłę.Wprowadzę teraz igłę motylkową do żyły bardzo delikatnie, jednak można napotkać pewien opór. W takim przypadku najlepiej lekko przekręcić kaniulę, jednocześnie wsuwając igłę – wykonując taki właśnie ruch – i kontynuować, aż skrzydełka igły motylkowej przylegną do skóry, dokładnie w ten sposób. Jesteśmy gotowi, teraz można założyć zacisk.W tej chwili napełnię dwie strzykawki o pojemności 20 µL taką samą ilością tuszy (20 µL). Następnie napełnię stożkową probówkę o pojemności 50 µL ilością 5 µL 20%effect. W kolejnym kroku pipetuję 10 µL DPBS do jednej z tych stożkowych probówek o pojemności 15 µL.Do tych 15 ml DPBS dodam 10 mg proszku kolagenazy, który odważę na wadze analitycznej. Następnie resuspenderuję kolagenazę, odwracając probówkę kilka razy, aż proszek oderwie się od ścianek. Po około pięciu lub sześciu takich ruchach przefiltruję kolagenazę sterylnie, używając strzykawki 10 ml do założenia filtra.Teraz jesteśmy gotowi do przepuszczenia tych pożywek przez sznur. Wlałem pozostały DPPS do tego jednego litrowego kolby i umieścę ją w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C, aby go ogrzać. Posłuży to do inkubacji naszego sznura przez około 15 minut.Jest to nasz przefiltrowany roztwór kolagenazy. Umieścimy tę probówkę stożkową w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C, aby roztwór się ogrzał; będziemy go używać później w procedurze do usunięcia tkanki z wnętrza żyły. W następnym kroku zacisnę przewód w miejscu igły motylkowej i przepłuczę go 20 ml roztworu Hanksa, aby usunąć komórki krwi.Po zabezpieczeniu igły motylkowej podam 20 ml heparyny. Będę to robić bardzo powoli, aby zapobiec pęknięciu żyły. Taka prędkość wypływu jest pożądana, jednak należy unikać gwałtownego podawania heparyny.Oznacza to, że robisz to zbyt gwałtownie. Dlatego zazwyczaj robię to, wiecie, kropla po kropli. I ponownie, przepycham roztwór hanksa tylko po to, aby oczyścić żyłę.Następnie odsłaniamy komórki końcowe. Po przejściu przez wszystkie zawieszenia rozłożę sznur, a następnie zaklempiuję jego dolny koniec, usunę strzykawkę i umieszczę ją w worku na odpady biologiczne.W następnym kroku podłączę nową strzykawkę 10 ml. Teraz przepłuczę sznur kolagenazą, aby usunąć wszelkie pozostałości, które mogły pozostać w żyle. Przetłoczę kolagenazę w ilości wystarczającej do przepłukania.Gdy roztwór wypłynie tutaj z końca, zauważymy, że ma on taki sam kolor jak zawartość strzykawki. Następnie zacisnę zaciskiem dolny koniec sznura. W następnym kroku przepchnę nieco więcej kolagenazy, dokładnie tyle, abyśmy mogli zaobserwować rozszerzenie się sznura.Po lekkim rozszerzeniu przejdę do masowania sznura, przesuwając palcami od lewej do prawej strony. Zazwyczaj używam trzech palców, wywierając dość mocny nacisk. Przypomina to rolowanie ciasta na nitki.Nie należy naciskać sznura zbyt mocno, ale nie można tego robić zbyt delikatnie. Przy zbyt silnym nacisku istnieje ryzyko zanieczyszczenia próbki mięśniami gładkimi. Z kolei przy zbyt delikatnym nacisku nie uda się usunąć żadnej z tkanek Q.Zatem przez około pięć do sześciu sekund w jednym miejscu, przesuwając się stopniowo w dół. Teraz przeniosę sznur z stołu do kąpieli wodnej o temperaturze 37°C i pozostawię go na 15 minut w celu inkubacji. Zatem jedną partię może być konieczne inkubować przez 15 minut.Inna partia może wymagać 20 minut, a trzecia 10 minut. Dlatego ważne jest zoptymalizowanie czasu inkubacji dla konkretnej partii. W tym przypadku wynosi on 15 minut.Przystąpimy teraz do wyjęcia kordów z kąpieli DPVS. Położymy je tutaj na chwilę. Zdejmujemy zakrętkę z probówki stożkowej o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml 20% feck.Roztwór 20% feck zawiera inhibitor trypsyny, więc zablokuje on działanie naszej kolagenazy. Dlatego teraz przytrzymam pępowinę nad probówką za pomocą nożyczek. Następnie przetnę ją wzdłuż linii zacisku.Przesuwamy dolną sekcję tutaj. Dobrze, teraz mamy świeże cięcie na końcu sznura. Następnie wprowadzę kolagenazę.Podobnie jak w przypadku splotów, nie należy tłoczyć zbyt szybko. Jest to przybliżona prędkość, z jaką należy przetłaczać materiał. To wszystko w kwestii naszej kolagenazy.Czasami zdarza się, że strzykawka jest zamocowana zbyt mocno. W takich sytuacjach używam zacisku, którego używaliśmy do pępowiny; chwytam go w tym miejscu i delikatnie odkręcam go tylko tyle, by poluzować połączenie, co pozwala mi na usunięcie strzykawki ręką. Następnie wezmę pozostałą strzykawkę 20 ml z roztworem HANKS, podłączę do niej igłę i przetłoczę całą objętość HANKS.Ponownie będę podawać roztwór bardzo powoli, tak jak w przypadku kolagenazy i drugiej strzykawki z roztworem Hanksa – podaję go kropla po kropli. To jest prędkość, z jaką należy podawać pożywkę. Zawiera ona 20% roztworu Hanksa oraz nasz roztwór kolagenazy.W tej chwili umieszczę próbkę w wirówce i będę wirować przez pięć minut przy 1200 RPM. Sprawdzę teraz, czy pokrywa jest dobrze zamknięta. Mamy dwie próbki, które umieszczę w wirówce.Wirujemy próbkę przez pięć minut przy 1200 RPM. W ten sposób wirowaliśmy naszą probówkę stożkową o pojemności 50 ml przez pięć minut przy 1200 RPM. To, co pozostało, to mały osad na dnie probówki. Osad ten składa się z pozostałych erytrocytów oraz naszych komórek śródbłonka.W następnym kroku odessam supernatant, zawiesząc osad w 5 mL 20% FBS, delikatnie pipetując go w górę i w dół kilka razy, aż zawiesina będzie wolna od widocznych resztek materiału. Następnie przeleję całe 5 mL i przełożę do kolby T25, starając się nie wytworzyć pęcherzyków powietrza.Następnie dodaję moje ECPS. Dodam 50 µL, a następnie delikatnie potrząsam kolbą, aby upewnić się, że wszystkie ECPS rozpowszeczyły się w klasie. I to wszystko.Kontynuuj. Kolbę inkubowano w temperaturze 37 °C.

isolation-of-human-umbilical-vein-endothelial-cells-huvec

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Izolacja komórek śródbłonka żył pępowiny ludzkiej (HUVEC)

Pępowiny są wykorzystywane do izolacji komórek mięśni gładkich za pomocą różnych metod. W niniejszej pracy do izolacji komórek mięśni gładkich zastosowano obróbkę enzymatyczną.

Izolacja ludzkich komórek mięśni gładkich tętnicy pępowinowej (HUASMC)

Przedstawiamy metodę izolacji i hodowli czystych populacji komórek śródbłonka zastawek serca (VEC). Komórki VEC można izolować z obu stron cuspisu lub płatka zastawki, a bezpośrednio po tym procesie możliwe jest łatwe wyizolowanie znajdujących się pod nimi komórek śródmiąższowych (VIC).

Izolacja komórek śródbłonka zastawek

Niniejszy artykuł opisuje najpierw procedurę izolacji ludzkich komórek śródbłonka z żył pępkowych, a następnie pokazuje, jak wykorzystać te komórki do badania transmigracji neutrofili w warunkach przepływu. Dzięki zastosowaniu komory przepływowej o małej objętości, wykonanej z polimeru o właściwościach optycznych szkła, możliwe jest również obrazowanie fluorescencyjne żywych komórek rzadkich populacji komórkowych.

Izolacja ludzkich komórek śródbłonka żyły pępkowej oraz ich zastosowanie w badaniu transmigracji neutrofili w warunkach przepływu

Opisano metodę ilościowego oznaczania adhezji neutrofili. Ta metoda tworzy dynamiczne środowisko przepływu podobne do tego, które występuje w naczyniu krwionośnym. Pozwala to na badanie adhezji neutrofili do oczyszczonych cząsteczek adhezyjnych (ligand) lub substratu komórek śródbłonka (HUVEC) w kontekście podobnym do środowiska in vivo z czystym stresem.

Test adhezji w komorze przepływu ludzkich neutrofili

Ten protokół jest przygotowany, aby podzielić się naszą metodą izolowania komórek śródbłonka naczyń wieńcowych myszy w celu obrazowania lub przeprowadzania eksperymentów z biologii molekularnej.

Izolacja mysich komórek śródbłonka naczyń wieńcowych

Szczegółowo opisano protokoły hodowli ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC), przejściowej transfekcji znakowanych fluorescencyjnie markerów wzrostu mikrotubul, obrazowania żywych komórek i automatycznej analizy dynamiki wzrostu mikrotubul międzyfazowych.

Obrazowanie poklatkowe w wysokiej rozdzielczości i automatyczna analiza dynamiki mikrotubul w żywych ludzkich komórkach śródbłonka żyły pępowinowej

Celem tego protokołu jest odizolowanie komórek progenitorowych śródbłonka od krwi pępowinowej. Niektóre z zastosowań obejmują wykorzystanie tych komórek jako biomarkera do identyfikacji pacjentów z ryzykiem sercowo-naczyniowym, leczenia chorób niedokrwiennych oraz tworzenia konstruktów naczyń krwionośnych i zastawek serca za pomocą inżynierii tkankowej.

Izolacja śródbłonkowych komórek progenitorowych z ludzkiej krwi pępowinowej

Tutaj prezentujemy zintegrowany protokół, który mierzy transport subpopulacji monocytów w przepływie in vitro za pomocą specyficznych markerów powierzchniowych i konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej. Protokół ten może być wykorzystany do zbadania sekwencyjnych etapów rekrutacji, a także do profilowania innych podtypów leukocytów przy użyciu innych specyficznych markerów powierzchniowych.

Równoczesne badanie rekrutacji subpopulacji monocytów w warunkach przepływu in vitro

Chociaż jest to trudne, izolacja komórek śródbłonka płuc jest niezbędna do badań nad zapaleniem płuc. Niniejszy protokół opisuje procedurę wysokowydajnej izolacji komórek śródbłonka makronaczyniowego i mikronaczyniowego o wysokiej czystości.

Izolacja i oczyszczanie komórek śródbłonka mikronaczyniowego i makronaczyniowego z próbek pochodzących z płuc

Obecne badanie opisuje protokół monitorowania zmian w ludzkich komórkach śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) podczas infekcji wirusowej za pomocą systemu analizy komórek w czasie rzeczywistym (RTCA).

Monitorowanie zmian w komórkach śródbłonka żyły pępowinowej po zakażeniu wirusowym za pomocą analizy komórek w czasie rzeczywistym opartej na impedancji

Opisujemy protokół izolacji i hodowli ludzkich komórek śródbłonka żyły odpiszczelowej (hSVECs). Udostępniamy również szczegółowe metody wytwarzania naprężeń ścinających i rozciągania w celu zbadania naprężeń mechanicznych w hSVEC.

Izolacja komórek śródbłonka żyły odpiszczelowej człowieka i narażenie na kontrolowane poziomy naprężeń ścinających i rozciągania

Naucz się izolacji komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) z pępowiny ludzkiej do badań nad angiogenezą. Protokół obejmuje enzymatyczne uwolnienie komórek kolagenazą i hodowlę in vitro.

Izolacja ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC)

Przeglądaj więcej filmów