Analiza naprawy pęknięcia podwójnej nici DNA (DSB) w komórkach ssaków

W tym protokole wideo zademonstrowano metodę pomiaru skuteczności i dokładności naprawy hamulców dwuniciowych DNA przez NHEJ lub HR w linii komórkowej ssaków. Procedura rozpoczyna się od wygenerowania linii komórkowej zawierającej chromosomalnie zintegrowaną pojedynczą kopię kasety reportera NHEJ lub HR. Te komórki reporterowe są następnie transfekowane mieszaniną I SCE, jednego plazmidu eksprymującego i czerwonego DS i jednego plazmidu.

Ja sce. Jedna endonukleaza powoduje podwójne pęknięcie nici w konstrukcji reporterowej, a DS RED służy jako kontrola transfekcji. Procent komórek GFP dodatnich i czerwonych dodatnich DS jest następnie analizowany faksem w celu ilościowego określenia skuteczności NHEJ lub HR, jeśli jest to pożądane.

Wierność naprawy jest analizowana poprzez uratowanie produktów reporterowych w E. coli i sekwencjonowanie produktów naprawczych. W ten sposób określa się wydajność i wierność pęknięcia nici dubletowej lub naprawy DSB w danej linii komórkowej na podstawie kwantyfikacji zdarzeń naprawczych metodą cytometrii przepływowej i sekwencjonowania produktów naprawy. Metoda ta ma wiele zalet w porównaniu z istniejącymi metodami analizy naprawy hamulców dwustrunowych.

Przede wszystkim metoda ta wyraźnie rozróżnia rekombinację homologiczną oraz niehomologiczną i łączącą. Wtedy metoda jest wysoce ilościowa, co pozwala na analizę milionów komórek za pomocą cytometrii przepływowej, a następnie metoda nie wymaga obszernego pakowania komórek po zakończeniu naprawy w celu selekcji opornych na antybiotyki cls. I wreszcie, zakończenie naprawy może być monitorowane w czasie rzeczywistym, patrząc na wygląd zielonych komórek.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie naprawy, takie jak pomiar HR i skuteczności naprawy HEGA w typach komórek zmutowanych wirusa lub po leczeniu farmakologicznym. Zbadaj naprawę A na różnych etapach cyklu komórkowego i mierząc szybkość naprawy Tak ogólnie. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowicjuszami w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ ważne jest, aby osiągnąć dobrą wydajność transfekcji.

W tej procedurze. Dwie kasety reporterowe są używane do oznaczania naprawy pęknięć dwuniciowego DNA. Jedna kaseta służy do badania niehomologicznego łączenia końcówek lub naprawy N-H-E-J-D-N-A.

Drugi służy do przyjrzenia się rekombinacji homologicznej lub naprawie DNA HR niehomologicznego końca. Dołączanie kasety reporterskiej zawiera gen GFP z zmodyfikowanym intronem o mocy trzech kilozasad z genu PEM jeden lub GFP PEM jeden. Krótko mówiąc, intro P one zawiera egzon adenowirusowy otoczony sekwencjami rozpoznającymi dla trzech endonukleaz hindi i I SCE jednej endonukleazy do indukcji pęknięć dwuniciowych.

Miejsca I SCE one są orientacją odwróconą, a pierwsze SCE mają sekwencję rozpoznawania niepalindromiczną, stąd dwa odwrócone miejsca generują niezgodność. Końcówki DNA są niezgodne. Końcówki DNA najlepiej naśladują naturalnie występujący dss.

Nieułożona kaseta NAEJ jest GFP ujemna, ponieważ ekson adenowirusowy zaburza G-F-P-O-R-F. Po indukcji pęknięć dwuniciowego DNA przez ISEE one, ekson adenowirusowy jest usuwany, a NHEJ przywraca funkcję genu GFP. Kaseta reportera rekombinacji homologicznej jest również oparta na jednym konstrukcie GFP PEM w kasecie HR.

Pierwszy ekson G FP PEM zawiera delecję 22 par zasad w połączeniu z insercją trzech miejsc restrykcyjnych. I SCE jeden hindi trzy I SCE E jeden. Usunięcie gwarantuje, że również w tym przypadku nie będzie można odtworzyć zwykłej praktyki rolniczej za pomocą zdarzenia NHEJ.

Witryny I SCE one są w orientacji odwróconej. Tak więc I SCE jedno trawienie pozostawia niekompatybilne końce. Po pierwszym egzemplarzu GFP PMM następuje promotor pomniejszony o TG, mniej o pierwszy ekson i intro GFP M1. Nienaruszony konstrukt jest ujemny GFP po indukcji pęknięcia podwójnej nici przez I sce E jedno trawienie.

Funkcjonalny gen GFP jest odtwarzany przez zdarzenie konwersji genu między dwiema zmutowanymi kopiami pierwszego GFP PMM jednego eksonu, inne rodzaje naprawy DSB, takie jak krzyżowanie przez jednoniciowe klęczenie. A NHEJ nie odtworzy genu GFP. Ponieważ brakuje drugiej kopii genu GFP.

Rozdzielczość pierwszego kodonu A TG i drugiego eksonu poprzez skrzyżowanie lub jednoniciowe klęczenie nie przywraca aktywności GFP. Konstrukcja ta pozwala zatem na wyłączne wykrywanie rozdzielczości poprzez konwersję genów, która jest dominującym szlakiem HR w komórkach ssaków. Aby rozpocząć tę procedurę, użyj zestawu endo free firmy Kyogen, aby przygotować wysokiej jakości zapas plazmidu reporterowego NHEJ lub HR, linearyzować 10 mikrogramów plazmidu i oczyścić DNA z roztworu trawiącego.

Zapoznaj się z dołączonym pisemnym protokołem, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat przygotowania plazmidu. W ramach przygotowań do transfekcji. Upewnij się, że normalne ludzkie fibroblasty są utrzymywane w najlepszych warunkach wzrostu.

Jeśli zaczynasz od zamrożonej fiolki, podziel komórki dwukrotnie przed transfekcją. Jeśli zaczynasz od płytki konfluencji, komórki dzielą się na części, wyhoduj komórki do 70 do 80% konfluencji. Zajmuje to około dwóch dni dla pięciu razy 10 do piątych komórek platerowanych na 100-milimetrowej płytce.

Aby uzyskać najlepszą wydajność transfekcji, doprowadź komórki do wzrostu logarytmicznego. Aktywnie rosnąca kultura zawiera komórki w stadium M widziane jako zaokrąglone komórki przyczepione do powierzchni w celu transfekcji zbioru około dwa razy 10 z sześciu komórek z dwóch 100-milimetrowych płytek. Bardzo ważne jest, aby nie przesadzać z trypsyną, komórki przestają trypsynować, gdy tylko 80% komórek oderwie się od płytki.

Ponownie zawiesić komórki w roztworze NHDF. Ponieważ komórki są wrażliwe na roztwór NHDF, zminimalizuj czas inkubacji i delikatnie wymieszaj komórki. Następnie użyj efektora amaxa nucleo, aby transfekować komórki 0,5 mikrograma linearyzowanego konstruktu reporterowego dla normalnych ludzkich fibroblastów.

Te warunki transfekcji skutkują integracją pojedynczej kopii konstruktu reporterowego przez większość 24 godzin po transfekcji przy jednym miligramie na mililitr genetycznego lub G 4 18. Aby wybrać komórki z chromosomalnie zintegrowanymi konstruktami reporterowymi, kontynuuj selekcję przez siedem do 10 dni, a następnie wybierz pojedyncze kolonie odporne na G 4 1 8 lub połącz odporne klony. Rozwiń kulturę do około pięciu 100-milimetrowych płytek.

Zamroź trzy płytki do wykorzystania w przyszłości i rozszerz pozostałe dwie płytki do pięciu razy 10 do piątych komórek na 100 milimetrową płytkę. Dziesięć stumilimetrowych płytek wystarcza zwykle na pięć transfekcji. Dwa dni po posiewie, gdy komórki zawierające konstrukt reporterowy osiągnęły 70 do 80% konfluencji z mieszaniną pięciu mikrogramów I sce, jednego plazmidu eksprymującego i 0,1 mikrograma czerwonego plazmidu DS.

Jako kontrolę wydajności transfekcji użyj efektora nukleo AM maxon, aby transfekować około dwa razy 10 z sześciu komórek z logarytmicznie rosnącej kultury. Ponieważ wydajność DSP jest mierzona jako stosunek dodatnich komórek GFP do czerwonych dodatnich komórek DS, zmiany w mieszaninie ISCE one i czerwonego plazmidu DS mogą wpływać na wyniki. Jakość plazmidu może również wpływać na wyniki poprzez zmianę wydajności transfekcji.

Dlatego, aby uzyskać spójne pomiary, ważne jest, aby użyć tej samej mieszanki plazmidów w jednym eksperymencie W tym samym czasie przygotuj trzy kontrole kalibracyjne dla faktów dla każdej kontroli. Transfekcja około dwa razy 10 z sześciu komórek. Trzy kontrole to pięć mikrogramów plazmidu eksprymującego EGFP, pięć mikrogramów DS, plazmid czerwony i pięć mikrogramów.

Plazmid kontrolny, który nie wykazuje ekspresji białka fluorescencyjnego. Trzy dni po transfekcji sprawdzić skuteczność transfekcji i ekspresji czerwonych białek GFP i DS za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu odwróconego z filtrami do wykrywania GFP i DS. Czerwone komórki rosną przez dodatkowy dzień przed analizą faksową, cztery dni po transfekcji zbierają transfekowane komórki I SCE i komórki kontrolne. Na tym etapie bardzo ważne jest, aby zebrać wszystkie komórki i mieć komórki o okrągłym kształcie.

Aby to osiągnąć, należy użyć dłuższego czasu cytacji trypsyny lub wyższego stężenia trypsyny. Zbadaj komórki pod mikroskopem, aby potwierdzić, że 99% komórek jest oderwanych od płytki i ma okrągły kształt. Ponownie zawiesić ogniwa w 500 mikrolitrach PBS i przenieść do lamp faksowych.

Utrzymuj komórki na lodzie i chroń je przed światłem, dopóki możliwe jest przechowywanie komórek na lodzie przez kilka godzin. Aby uzyskać najlepsze wyniki, przeanalizuj komórki natychmiast po zbiorach. Następnie skalibruj fakty za pomocą TFP DS RED i kontroli negatywnych.

Dostosuj napięcie i kompensację koloru, aby uwzględnić wszystkie ogniwa fluorescencyjne w analizie. Należy pamiętać, że intensywność fluorescencji w próbkach eksperymentalnych jest niższa niż w próbach kontrolnych. Po skalibrowaniu faktów z kontrolami, przeanalizuj I SCE jedną transfekowaną komórkę, policz co najmniej 20 000 komórek dla każdego zabiegu, aby zapobiec potencjalnym zakłóceniom między GFP i ds.

Czerwona fluorescencja utrzymuje procent komórek GFP dodatnich lub czerwonych dodatnich DS poniżej 25%Jeśli procent jest wyższy, zmniejsz ilość plazmidu DS RED lub I sce E. Procent komórek GFP dodatnich odpowiada skuteczności naprawy D-N-A-D-S-P, a procent czerwonych komórek DS dodatnich wskazuje na skuteczność transfekcji. Oblicz względną skuteczność naprawy D-N-A-D-S-P jako stosunek komórek GFP dodatnich do czerwonych komórek dodatnich DS.

W celu określenia dokładności naprawionych nakazów, uratuj konstrukty reporterowe, trawiąc genomowe DNA za pomocą krążenia enzymu eco R i transformacji w kompetentne komórki E. coli. To uratowanie jest możliwe, ponieważ oryginalne konstrukty zawierają bakteryjne pochodzenie replikacji analizowane przez restrykcję, trawienie i sekwencjonowanie. Są to typowe fakty, wyniki badań kontrolnych oraz eksperymentów NHEJ i HR.

Intensywność fluorescencji i liczba komórek fluorescencyjnych są niższe w komórkach transfekowanych I SCE w porównaniu z komórkami kontrolnymi. Różnica w sygnale fluorescencji wynika z różnicy w liczbie kopii konstruktów GFP i DS RED w tych komórkach. Każda komórka w eksperymencie zawiera jedną kopię zintegrowanej konstrukcji reporterowej.

W ten sposób udane zdarzenia naprawcze odtwarzają gen GFP we frakcji komórek. Skuteczność NHEJ i HR oblicza się jako stosunek dodatnich komórek GFP do czerwonych dodatnich komórek DS. NHEA jest bardziej wydajnym procesem niż HR w komórkach ludzkich, w ludzkich fibroblastach wydajność NHEJ wynosi zwykle od 0,6 do 1,3, a wydajność HR wynosi od 0,05 do 0,3.

Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się naprawą DNA do zbadania roli różnych czynników w HEG i HR oraz zbadania kinetyki i regulacji NHEG i HR w komórkach ssaków. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak mierzyć wydajność i dokładność HR i GJ w komórkach ssaków za pomocą testu fluorescencyjnego.