Kultura mikroeksplantów szkieletowych mięśni dorosłych i embrionalnych oraz izolacja komórek macierzystych mięśni szkieletowych

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wyizolowanie wzbogaconych populacji komórek macierzystych mięśni szkieletowych z mikrodysekcyjnych implantów tkankowych otrzymanych z mięśni dorosłych osobników lub embrionów, w celu zbadania ich zachowania i funkcji. Komórki te mogą mieć również zastosowanie terapeutyczne. Cel ten osiąga się poprzez wstępną dysekcję docelowych mięśni z ciał dorosłych myszy lub embrionów z tkanki macicy w warunkach aseptycznych.

Drugim krokiem procedury jest płukanie i oczyszczanie tkanek mięśniowych w przypadku tkanek mięśniowych osobników dorosłych, wycięcie tkanki tłuszczowej oraz tkanki łącznej i przeniesienie ich do świeżego medium DF 20 w przypadku embrionów. Należy usunąć błony zewnętrzne oraz narządy wewnętrzne i przenieść próbki do świeżego medium DF 20, a następnie przeprowadzić wycinek w celu wyizolowania obszarów bogatych w mięśnie.

Trzecim krokiem procedury jest mikrodysekcja izolowanych tkanek do sześcianów o boku 400 µm. Przenieś pojedynczo eksplantaty do środkowych 60 studzienek płytki 96-dołkowej i inkubuj w temperaturze 37 °C. Ostatnim krokiem procedury jest ocena komórek.

Komórki zaczną wyłaniać się z udanych eksplantów x w czasie od kilku godzin do dwóch tygodni po eksplantacji, w zależności od pochodzenia tkanki. Ostatecznie można uzyskać wyniki pokazujące, że komórki zaczynające wyłaniać się z udanych eksplantów X mogą być namnażane, a następnie wykorzystywane do szeregu różnych celów in vitro i in vivo, w tym do badań nad proliferacją i apoptozą oraz do identyfikacji markerów białkowych. Komórki te mogą być również pochodne klonalnie, modyfikowane genetycznie, a ostatecznie przeszczepiane do organizmu gospodarza w celu badania regeneracji lub testowania zastosowań terapeutycznych.

Witajcie, jestem Janet Smith z laboratorium biologii komórek macierzystych mięśni szkieletowych na School of Biosciences Uniwersytetu w Birmingham. Jestem Dean Lana z laboratorium Janet Smith, a ja jestem Byron Chen, również z laboratorium Janet Smith. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę uzyskiwania kultur komórek macierzystych mięśni szkieletowych z mikrodissectowanych fragmentów tkanek pobranych z mięśni dorosłych oraz embrionów.

Procedurę tę stosujemy w laboratorium do badania zachowań macierzystych komórek mięśni szkieletowych, takich jak proliferacja, apoptoza i różnicowanie, a także do badania zaburzeń funkcji komórek macierzystych mięśni w chorobach takich jak dystrofia mięśniowa. Zacznijmy zatem. Podstawowa metoda otrzymywania kultur mikroeksplantów z mięśni szkieletowych rozpoczyna się od wycięcia docelowych mięśni z niedawno uśpionej myszy w warunkach aseptycznych.

W tej demonstracji mięśnie kończyn tylnych zostają wypreparowane, przemyte poprzez dwukrotną zmianę medium DF 20, a następnie umieszczone w świeżym medium DF 20 w szalce o średnicy 60 mm. Przy użyciu stereomikroskopu chirurgicznego należy ostrożnie wypreparować mięśnie w warunkach sterylnych, aby usunąć tkankę tłuszczową, łączną oraz kość. Następnie, posługując się pęsetą jubilerską, należy pociąć oczyszczone fragmenty mięśnia na sześciany o boku 400 µm.

Umieść poszczególne fragmenty mięśni w środkowych 60 studzienkach płytki 96-dołkowej zawierającej 50 µL DF 20 na studzienkę. Pozostałe studzienki wypełnij solą fizjologiczną, aby zapobiec wysychaniu studzienek zawierających eksplantaty. Sprawdź studzienki pod mikroskopem, a następnie umieść płytkę 96-dołkową w inkubatorze w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2.

Przymocowanie i przerost mikroeksplantatów ocenia się po 24 do 48 godzinach inkubacji, a następnie w odstępach od 48 do 72 godzin, zależnie od tempa wzrostu hodowanych mięśni. Przedstawione tutaj przykłady ukazują przerost w drugim dniu z eksplantowanych mięśni szkieletowych dorosłych oraz ugruntowany przerost z eksplantatu z zagregowanymi kulturami i wysoką gęstością komórek. Eksplantaty ocenia się zgodnie z poziomem konfluencji komórek w każdej poszczególnej studni, co zostanie zaprezentowane później w kontekście ekspansji i izolacji komórek SMS.

Kulturę wypływową (outgrowth culture) należy monitorować indywidualnie pod kątem komórek o morfologii typowej dla komórek SMS, tj. sferycznych komórek jednojądrowych o wysokiej refrakcyjności, które rosną w postaci agregujących skupisk. Procedurę należy rozpocząć od wyseparowania zarodków E 12.5 z macicy. W ten sam sposób można wyseparować zarodki w stadiach od E 11.5 do E 17.5.

Umieść zarodki pojedynczo w szalkach Petriego zawierających PECM w celu przygotowania do szczegółowej mikrodysekcji. Następnie poszczególne zarodki poddaje się dalszej dysekcji, aby wyizolować obszary bogate w mięśnie szkieletowe. W pierwszej kolejności usuń narządy wewnętrzne, wypreparuj ogon, kończyny tylne i przednie, a także górne i dolne ściany ciała.

Wszystkie wypreparowane tkanki należy umieścić w świeżym PECM w celu utrwalenia embrionu. Z wypreparowanych czterech kończyn, kończyn tylnych oraz górnych i dolnych ścian ciała należy za pomocą mikrodysekcji wyciąć małe kostki tkanek o jednakowej wielkości. Wycinki te należy umieścić pojedynczo w środkowych 60 studniach płytki 96-dołkowej, w których znajduje się po 50 µL PECM na studnię.

W celu hodowli embrionów należy przygotować minimum 60 dołków, z jednym eksemplarzem rośliny na dołek dla każdego badanego embrionu. Środkowe 60 dołków można podzielić na regiony wskazujące miejsce pobrania eksplantatu. Taki układ pozwala na przeznaczenie po 15 dołków odpowiednio dla kończyny przedniej, górnej ściany ciała, kończyny tylnej oraz dolnej ściany ciała.

Inkubuj eksplanty w temperaturze 37°C i 5% CO2 przez trzy tygodnie. W trakcie trzytygodniowej inkubacji eksplanty ocenia się w trzeciej, siódmej, czternastej i dwudziestej pierwszej dobie hodowli za pomocą mikroskopu odwróconego. Eksplanty ocenia się na podstawie stopnia konfluencji komórek w każdej pojedynczej studzience.

Ten przykład ilustruje różne stopnie konfluencji pierwotnych hodowli eksplantów embrionalnych E 15.5 barwionych mithrylem: 0 do 14%, 15 do 24%, 25 do 49%, 50 do 74% oraz 75 do 100%. Zdjęcia kultur można wykonać po osiągnięciu konfluencji; hodowle eksplantów wykazujące cechy morfologiczne komórek SMS mogą zostać poddane subkulturze. Usunąć pożywkę z wybranych studni i przefiltrować ją za pomocą filtra strzykawkowego z dyskiem ACR 0,2 µm.

Zachować pożywkę do dalszego użytku; jest to pożywka warunkowana dla każdej próbki. Do każdej studni dodać 100 µL dysków rozcieńczonych 1:10 w PECM. Następnie ponownie umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 20 minut.

Po 20 minutach za pomocą końcówki pipety delikatnie zeskrobcie poluzowane komórki z powierzchni studzienki, a następnie odwirujcie zawiesinę komórkową z prędkością 1000 ×g przez trzy minuty, aby uzyskać pellet komórek. Komórki rozcieńczono poprzez resuspensję w 2 ml PECM, a następnie przeniesiono je do studzienek nowej płytki 48-dołkowej. Na koniec przeniesiono mieszaninę komórek do płytek 48-dołkowych w celu dalszej ekspansji.

Aby przygotować komórki do analizy, w celu uzyskania obrazu z płytek, należy wysiać pierwotne hodowle zarodkowe Splunk w PECM i medium warunkowanym na szkiełka w płytkach 48-dołkowych. Komórki wysiewa się w gęstości 3 × 10³ komórek/cm². Inkubować w temperaturze 37 °C, aby umożliwić adhezję komórek, co zazwyczaj trwa od czterech do sześciu godzin, w celu oceny apoptozy i proliferacji. Komórki na szkiełkach należy przemyć dwukrotnie w PBS, a następnie utrwalić w 4% paraformaldehydzie przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Po utrwaleniu przemyć szkiełka przez 10 minut w PBS, a następnie zabarwić DPI w stężeniu 10 µg/ml przez trzy minuty.

Owiń płytkę folią aluminiową, a szkiełka nakrywkowe przemyj raz w PBS przez 5 do 10 minut. Następnie wyjmij szkiełko nakrywkowe z dołka i odwróć je na kroplę medium montażowego DacCyto na szkiełku przedmiotowym. Zaklej krawędzie szkiełka nakrywkowego lakierem do paznokci w celu przechowywania.

Owinięto preparaty folią i przechowywano w temperaturze -20 °C do czasu zliczenia. Preparaty oglądano w fluorescencji przy użyciu mikroskopu pionowego i oceniano liczbę komórek apoptotycznych oraz mitotycznych, stosując skalę IP. Gdy eksplantaty zostaną ostrożnie wszczepione z dorosłego mięśnia szkieletowego lub z embrionów, zaczną generować komórki w ciągu od kilku do 72 godzin inkubacji w temperaturze 37 °C.

W zależności od źródła, ekspansja populacji komórek będzie trwała kilka dni w przypadku implantów z zarodków lub kilka tygodni w przypadku starszych implantów mięśni szkieletowych, aby uzyskać pierwotne hodowle agregujące komórki SMS o wysokiej gęstości; tutaj przedstawiono reprezentatywne wyniki udanej derywacji klonalnej komórki SMS. Pojedyncza komórka wyizolowana do płytki 96-dołkowej staje się kolonią pochodzącą z jednej komórki, co ostatecznie prowadzi do powstania ustabilizowanej populacji klonalnej. Następnie w celu weryfikacji tożsamości komórek SMS stosuje się immunohistochemię MIF five.

Dorosłe komórki macierzyste pochodzące z mięśni szkieletowych zostały przeszczepione do mięśnia piszczelowego przedniego myszy biorcy; komórki te zidentyfikowano za pomocą znakowania beta GC na tym obrazie wykonanym trzy miesiące po wstrzyknięciu. Trzy niedawno zlane komórki beta-galakto-dodatnie, zabarwione na niebiesko, są widoczne w włóknie mięśniowym 14 miesięcy po wstrzyknięciu, a znaczny udział komórek beta-galakto-dodatnich we włóknach mięśniowych wykryto za pomocą przeciwciała anty-beta-galakto, zabarwionego na brązowo. Beta-galakto-dodatna komórka satelitarna jest wskazana strzałką na tym obrazie. Brak zabarwienia stwierdzono w kontroli, w której nie użyto przeciwciała pierwszorzędowego, w próbkach wyizolowanych z wstrzykniętych mięśni biorcy 12 miesięcy po wstrzyknięciu.

Kariotypowanie hodowli proliferujących komórek beta-galaktozo-dodatnich z klonalnej linii komórkowej SMS myszy wykazuje prawidłowy diploidalny komplement chromosomowy. Ekspresję beta-galaktozydazy w kolonii komórek PD 50 A wykazano za pomocą histochemii. Analizy in vitro dystroficznych myoblastów embrionalnych MIF5-dodatnich ujawniły, że myoblasty te wykazują hiperproliferację i skłonność do apoptozy. Jak pokazano na tym wykresie, szybkość wzrostu myoblastów embrionalnych z hodowli eksplantów mięśni X jest zwiększona zarówno u mutantów z nokautem MDX, jak i CAV3, w porównaniu z eksplantem X typu dzikiego. Tutaj przedstawiono przykład immunobarwionego eksplantu MIF5. Hiperproliferację myoblastów embrionalnych zaobserwowano u tych mutantów z nokautem MDX i CAV3, co określono na podstawie immunoreaktywności Ki67-dodatniej.

Ponadto w obu tych mutantach występuje zwiększona apoptoza, co wykazano w barwieniu DPI; na tym obrazie widoczny jest przykład komórki apoptotycznej wskazanej strzałką. Przedstawiliśmy właśnie sposób izolacji komórek macierzystych mięśni szkieletowych z dorosłych osobników oraz z mikrodissektowanych eksplantów embrionalnych. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby zwrócić szczególną uwagę na rozmiar mikrodissektowanych eksplantów.

Jeśli będą zbyt duże, dojdzie do przeludnienia i komórki zginą. Jeśli będą zbyt małe, nie zapewnią odpowiedniego wzrostu komórek.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.