DIOLISTYCzne znakowanie neuronów w skrawkach mózgu gryzoni i naczelnych niebędących ludźmi
6 lipca 2010
Prezentujemy zastosowanie pistoletu genowego do wprowadzania barwników fluorescencyjnych, takich jak DiI, do neuronów wyrytych z plastrów mózgu gryzoni oraz naczelnych innych niż człowiek w różnym wieku. W tym konkretnym przypadku wykorzystujemy dorosłe myszy (w wieku 3–6 miesięcy) oraz dorosłe makaki krabikowate (w wieku 9–15 lat). Technika ta, pierwotnie opisana przez laboratorium dr. Lichtmana (Gan et al., 2000), jest odpowiednia do badania rozgałęzień dendrytycznych oraz morfologii kolców dendrytycznych i może być łączona z tradycyjnym barwieniem immunologicznym, pod warunkiem zachowania niskiego stężenia detergentów.
Nazywam się Gail Siebel i jestem stypendystką podoktorską w laboratorium dr Veronica Alvarez w Narodowym Instytucie Nadużywania Alkoholu i Alkoholizmu. Praca ta została wykonana we współpracy z dr Kathleen Grant i Andrew Wow z Oregon Primate Center oraz dr Jamesem Dene z Wake Forest University, który dostarczył tkankę naczelnych niedźwiedzi użyte w tym badaniu. Ogólnym celem tej procedury jest wprowadzenie barwników fluorescencyjnych do neuronów i znakowanie przekrojów mózgu różnych gatunków, takich jak gryzonie i naczelne w każdym wieku.
W celu badania morfologii dendrytów i kolców dendrytycznych, w pierwszej kolejności powleka się Ts oraz kuleczki barwnikiem lipofilowym, takim jak D eye. Drugim etapem procedury jest wyłożenie rurek kuleczkami powleczonymi barwnikiem D eye i pocięcie ich na małe fragmenty, które służą jako amunicja dla systemu genowej armaty Helios. Trzecim etapem procedury jest wstrzelenie kuleczek powleczonych barwnikiem D eye do przekrojów mózgu za pomocą genowej armaty.
Ostatni krok procedury jest opcjonalny, ponieważ stylistyka może być łączona z barwieniem immunologicznym w celu jednoczesnej lokalizacji innych markerów. W rezultacie można uzyskać rzadkie znakowanie fluorescencyjne neuronów, odpowiednie do obrazowania o wysokiej rozdzielczości, takiego jak mikroskopia konfokalna lub dwufotonowa, a także do badania rozgałęzień dendrytów i morfologii kolców dendrytycznych. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z naszymi dotychczasowymi metodami jest to, że stylistyka może być stosowana do przekrojów mózgu zwierząt wszystkich gatunków, w każdym wieku i o dowolnym genotypie.
Metodę tę można stosować w połączeniu z immunobarwieniem; pozwala ona na uzyskanie rzadkiego znakowania fluorescencyjnego, odpowiedniego do mikroskopii o wysokiej rozdzielczości. Przed przygotowaniem kulek należy pokryć kuleczki wolframowe barwnikiem lipofilnym w dygestorium, używając 450 ml chlorku metylenu i 13,5 mg barwnika lipofilnego, aby uzyskać stężenie końcowe 30 mg/ml. Należy wziąć jedną probówkę Eloqua zawierającą 300 mg kuleczek wolframowych i dodać 300 µl chlorku metylenu, a następnie energicznie pipetować, aby resuspendować kuleczki i przygotować jednorodny roztwór.
Na każdy zestaw kulek używa się jedynie 100 mg kulek wolframowych; należy pipetować je w górę i w dół, aby utrzymać je w zawiesinie, a następnie nanieść 100 µL kulek oraz rozpuszczonego barwnika na szkiełko podstawowe i dokładnie wymieszać. Za pomocą końcówki pipety należy pozwolić im całkowicie wyschnąć na powietrzu, aż kulki zmienią kolor na jasnoszary. Pod szkiełkiem należy umieścić czysty kawałek woskowanego białego papieru. Dla każdego koloru kulek należy zeskrobać je ze szkiełka za pomocą czystej żyletki i rozetrzeć barwnik na drobny proszek.
Zeskrob powlekane kuleczki na papier serwatkowy i przelać je do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Dodać 3 ml wody i poddać sonikacji w kąpieli wodnej przez 10–30 minut w temperaturze pokojowej, aby całkowicie rozbić wszelkie grudki. Odciąć 0,7 m rurki w kolorze morskim, wykonując skos na jednym z końców, a drugi koniec podłączyć do strzykawki o pojemności 12 ml za pomocą adaptera do rurek; umieścić wolny koniec rurki w probówce zawierającej 10 ml roztworu poliwiniłopironu (PVP) o stężeniu 10 mg/ml i całkowicie zassać roztwór przez rurkę do strzykawki.
Mieszaj roztwór kulek na wirówce, jednocześnie pompując strzykawką, aby uzyskać jednorodną mieszaninę; działaj szybko, aby uniknąć precypitacji kulek, a następnie całkowicie wciągnij roztwór do rurki. Unikaj wprowadzania pęcherzyków powietrza, które zapobiegłyby przywieraniu kulek do rurki w tym miejscu, trzymając rurkę napiętą z obu końców. Przechylaj ją na boki, aby zapewnić równomierne rozmieszczenie.
Rozdziel kuleczki. Wprowadź rurkę do stacji preparatywnej i odczekaj od 30 do 60 sekund, aż kuleczki osiądą. Użyj strzykawki, aby przesuwać zawartość powoli, lecz płynnie.
Usunąć wodę, pozostawiając koraliki. Natychmiast odłączyć strzykawkę i rozpocząć wirowanie rurek. Ustawić przepływ azotu na stacji przygotowawczej na 4 do 5 LPM suchego gazu przez 10 do 20 minut, aż kropelki wody przestaną być widoczne.
Zdejmij przewody ze stacji przygotowawczej, potnij pellety na odcinki o długości 13 milimetrów za pomocą przecinaka do przewodów; dobre pellety będą pokryte jednolitym, bladym szarym nalotem wewnątrz. Umieść pellety w owiniętych folią fiolkach scyntylacyjnych zawierających środek osuszający, taki jak bezwodny siarczan wapnia. Przechowuj w temperaturze pokojowej do momentu wykonania pomiarów.
Znakowanie Diic może być stosowane do barwienia neuronów w tkance mózgowej różnych gatunków i w różnym wieku, utrwalonej różnymi metodami. Przenieś skrawki mózgu, które zostały utrwalone albo przed, albo po cięciu, do dołków płytki 24-dołkowej.
Przemyć plastry w 1X PBS trzy razy, przez 5 do 10 minut podczas każdego płukania. Odessać PBS i za pomocą pędzla wycentrować plaster w dołku. Umieścić kawałek filtra 3,0 µm pomiędzy dwiema metalowymi sitami dyfuzyjnymi na końcu tulei lufy armatki genowej.
Trzymaj pistolet genowy w taki sposób, aby koniec wkładki lufy znajdował się 1,5 centymetra od próbki. Wstrzyknij kuleczki w skrawek, stosując ciśnienie gazu helu od 120 do 180 PSI. Szybko przemyj skrawki trzy razy roztworem 1x PBS, aby usunąć nadmiar barwnika.
Upewnij się, że powierzchnia cięcia plastra jest skierowana do góry podczas wszystkich etapów dozowania cieczy. Przechowuj plastry w PBS od trzech do sześciu godzin, aby umożliwić rozprzestrzenienie się DAI wzdłuż dendrytów, przykrywając je folią. Ponieważ DAI jest światłoczułe, plastry można na tym etapie zamontować lub poddać dalszemu barwieniu przeciwciałami, zgodnie z opisem w następnej sekcji; aby kontynuować barwienie, nanieś od 300 do 500 µL roztworu permeabilizującego zawierającego 0,01% TRITTON X 100 w 1xPBS na każdy plaster i inkubuj w temperaturze pokojowej przez dokładnie 15 minut.
Usuń roztwór do permeabilizacji z dołków i zablokuj skrawki w roztworze zawierającym 10% serum koziego oraz 0,01% Tritonu X 100 w 1x PBS; inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Do każdego dołka dodaj od 300 do 500 µL przeciwciała pierwszorzędowego rozcieńczonego w roztworze blokującym. Inkubuj w temperaturze pokojowej od jednej do dwóch godzin lub przez noc, w zależności od przeciwciała. Przepłucz skrawki trzykrotnie w 1x PBS przez 5 do 15 minut podczas każdego płukania, a następnie usuń roztwór z dołka.
Do każdej dołki dodaj od 300 do 500 µL przeciwciała wtórnego rozcieńczonego w roztworze blokującym. Przemyj dołki czterokrotnie za pomocą 1×PBS, poświęcając od 5 do 15 minut na każde płukanie, analogicznie jak poprzednio. Przenieś skrawki na szkiełko przedmiotu za pomocą fluorescencyjnego medium montującego i przykryj szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 18 by 18 mm. Pozostaw do wyschnięcia na 6 do 12 godzin w temperaturze pokojowej, a następnie zabezpiecz krawędzie bezbarwnym lakierem do paznokci i przechowuj w ciemności lub pod przykryciem w temperaturze 4 °C.
Tutaj przedstawiono przykładowe obrazy znakowanych przekrojów mózgu. Dwiema ważnymi cechami, na które należy zwrócić uwagę, są rzadki wzór znakowania przy małym powiększeniu oraz możliwość zidentyfikowania poszczególnych komponentów komórkowych. Nieprawidłowe przygotowanie kulek lub nadmierna fiksacja tkanki mogą prowadzić do złego znakowania, co pokazano tutaj.
W tekście tutaj podano wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów. Przedstawiony jest obraz konfokalny neuronu kolczastego z ośrodka TAL mózgu myszy oraz jego złożony wzór rozgałęzień dendrytycznych. Sekcjonowanie optyczne uzyskiwane dzięki mikroskopii konfokalnej umożliwia izolację pojedynczych oznakowanych komórek w przekroju tkanki.
Zdjęcia przy dużym powiększeniu przedstawiają segmenty dendrytów z mózgu gryzonia oraz mózgu naczelnego niebędącego człowiekiem. Należy zauważyć wysoką intensywność barwienia fluorescencyjnego uzyskaną dzięki tej technice, co w przypadku połączenia ICS z barwieniem immunologicznym skutkuje wyraźnie zarysowanymi kolcami dendrytycznymi. Zdjęcie to przedstawia przykład kolokalizacji znakowania D eye w kolorze czerwonym z barwieniem immunologicznym ekspresji GFP w kolorze zielonym.
Ten obraz przedstawia przekrój przez obszar SAL myszy transgenicznej wykazującej ekspresję fluorescencyjnego białka GFP pod promotorem receptora dopaminowego D1. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat przygotowywania pelletów oraz wykorzystania pistoletu do mikroiniekcji w celu rzadkiego znakowania neuronów barwnikami fluorescencyjnymi. Technika ta umożliwia wyraźną wizualizację morfologii neuronów oraz badanie rozgałęzień dendrytów i kolców dendrytycznych.
Przegląd
Niniejsze badanie demonstruje zastosowanie armatki genowej do wprowadzania barwników fluorescencyjnych do neuronów w skrawkach mózgu gryzoni oraz naczelnych innych niż człowiek. Technika ta jest odpowiednia do badania rozgałęzień dendrytycznych i morfologii kolców.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Neuroanatomia
- Obrazowanie fluorescencyjne
Wstęp
- Technika gene gun umożliwia precyzyjne wprowadzanie barwników do neuronów.
- Do znakowania struktur neuronalnych wykorzystuje się barwniki fluorescencyjne, takie jak DiI.
- Metodę tę można zastosować do skrawków mózgu różnych gatunków i w różnym wieku.
- Połączenie tej techniki z immunobarwieniem usprawnia badanie morfologii neuronów.
Cel badania
- Wprowadzenie barwników fluorescencyjnych do neuronów w celu obrazowania.
- Badanie rozgałęzień dendrytycznych i morfologii kolców u różnych gatunków.
- Udoskonalenie istniejących metod znakowania neuronów.
Zastosowane metody
- Powlekanie kulek wolframowych barwnikiem lipofilnym.
- Wykorzystanie pistoletu genowego do wprowadzania kulek powlekanych barwnikiem do przekrojów mózgu.
- Opcjonalne barwienie immunocytochemiczne w celu dodatkowej lokalizacji markerów.
- Techniki obrazowania o wysokiej rozdzielczości, takie jak mikroskopia konfokalna.
Główne wyniki
- Skuteczne wprowadzenie barwników fluorescencyjnych do neuronów.
- Rzadkie znakowanie odpowiednie do obrazowania o wysokiej rozdzielczości.
- Wykazana skuteczność u różnych gatunków i w różnym wieku.
- Połączenie z immunobarwieniem zapewnia szczegółowe informacje morfologiczne.
Wnioski
- Technika biolistyki (gene gun) jest wszechstronna w badaniach nad neuronami.
- Umożliwia ona obrazowanie struktur dendrytycznych o wysokiej rozdzielczości.
- Metodę tę można dostosować do różnych potrzeb badawczych w neuronauce.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Znakowanie metodą DiOLISTIC umożliwia wysokorozdzielczą, ilościową analizę morfologii neuronów w skrawkach mózgu różnych gatunków i w różnym wieku, pokonując ograniczenia fluorescencyjnego znakowania zależnego od transgenów. Możliwość ta wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego oraz walidację celów w procesach odkrywania leków skoncentrowanych na neurobiologii, szczególnie tam, gdzie wymagana jest ciągłość translacyjna między modelami gryzoni i naczelnych niebędących ludźmi. Kompatybilność tej metody z immunobarwieniem dodatkowo zwiększa jej wartość w zakresie multipleksowej charakterystyki fenotypowej i dopasowania biomarkerów.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia szczegółową analizę struktury neuronów w celu weryfikacji hipotez mechanistycznych.
- Wspiera walidację funkcjonalną celów poprzez ilościowe określanie rozgałęzień dendrytycznych i morfologii kolców.
- Ułatwia biologiczną ocenę ryzyka w różnych gatunkach i genotypach, w tym u naczelnych innych niż człowiek.
- Zapewnia platformę do multipleksowej analizy markerów za pomocą kombinacji immunobarwień.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Przygotowuje zwalidowane systemy skrawków mózgu do dalszego przesiewania związków lub testów fenotypowych.
- Zapewnia odtwarzalne, rzadkie znakowanie fluorescencyjne odpowiednie dla przepływów pracy w obrazowaniu ilościowym.
- Umożliwia standaryzację testów w różnych grupach wiekowych i gatunkach, wspierając generowanie wiarygodnych danych.
- Pozwala na rzetelną ocenę morfologii neuronów w odpowiedzi na perturbacje eksperymentalne.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ujednolica odczyty morfologiczne pomiędzy modelami gryzoni i naczelnych innych niż człowiek w celu opracowania translacyjnych biomarkerów.
- Zapewnia ciągłość od wczesnej fazy odkryć po walidację przedkliniczną poprzez wsparcie analizy międzygatunkowej.
- Redukuje ryzyko translacyjne, umożliwiając bezpośrednie porównanie fenotypów neuronalnych w różnych modelach.
- Wspiera decyzje dotyczące rozwoju projektu, skorygowane o ryzyko, w oparciu o ilościowe punkty końcowe morfologii.
Integracja potoku i przepływu pracy
Oznaczanie metodą DiOLISTIC wpisuje się w kontinuum od odkryć do badań przedklinicznych, umożliwiając wysokotreściową analizę morfologiczną w skrawkach mózgu gryzoni i naczelnych, co wspiera walidację celów, screening fenotypowy oraz badania translacyjne.
- Biologia odkryć: Dostarcza ilościowych danych morfologicznych do weryfikacji hipotez i wyjaśniania szlaków sygnałowych.
- Przesiewy: Umożliwia uzyskanie powtarzalnych, gotowych do analiz preparatów skrawków mózgu do przesiewów związków chemicznych lub genetycznych.
- Analityka: Generuje wysokorozdzielcze, ilościowe obrazy do analizy porównawczej cech neuronów.
- Badania translacyjne: Łączy dane z gryzoni i naczelnych w celu synchronizacji biomarkerów i zapewnienia ciągłości badań przedklinicznych.
- Zastosowania w przedsiębiorstwach: Oferuje szeroko stosowaną platformę znakowania, którą można dostosować do wielu gatunków, grup wiekowych i kontekstów eksperymentalnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów neuronalnych i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje znakowanie morfologiczne i obrazowanie w różnych modelach oraz laboratoriach.
- Wartość strategiczna: Poprawia jakość decyzji typu go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez umożliwienie generowania rzetelnych danych międzygatunkowych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój zasobów neurobiologicznych.
Kwestie dotyczące wdrożenia
- Wymagana biegłość w przygotowywaniu skrawków mózgu, znakowaniu fluorescencyjnym oraz obrazowaniu o wysokiej rozdzielczości.
- Wymagany dostęp do aparatury gene gun oraz platform mikroskopii konfokalnej lub dwufotonowej.
- Konieczna rygorystyczna standaryzacja przygotowania pocisków i obchodzenia się z tkanką w celu zapewnienia powtarzalności.
- Metoda możliwa do adaptacji dla różnych gatunków, wieku oraz protokołów fiksacji, jednak wrażliwa na jakość tkanki i parametry znakowania.
- Ograniczenia praktyczne obejmują rozwiązywanie problemów z jakością pocisków, stopniem fiksacji i stężeniem detergentu jako krytycznymi czynnikami sukcesu.
