DiOLISTIC Labeling neuronów z wycinków mózgu gryzoni i naczelnych innych niż ludzie

Pokazujemy użycie pistoletu genowego do wprowadzania barwników fluorescencyjnych, takich jak DiI, do neuronów w wycinkach mózgu gryzoni i naczelnych w różnym wieku. W tym konkretnym przypadku używamy dorosłych myszy (w wieku 3-6 miesięcy) i dorosłych małp Cynomologus (w wieku 9-15 lat). Ta technika, pierwotnie opisana przez laboratorium dr Lichtmana (Gan i wsp., 2000), dobrze nadaje się do badania rozgałęzień dendrytycznych i morfologii kolców dendrytycznych i może być łączona z tradycyjnym barwieniem immunologicznym, jeśli detergenty są utrzymywane w niskim stężeniu.

Nazywam się Gail Siebel i jestem adiunktem w laboratorium dr Veroniki Alvarez w Narodowym Instytucie ds. Nadużywania Alkoholu i Alkoholizmu. Praca ta została wykonana we współpracy z dr Kathleen Grant i Andrew Wow z Oregon Primate Center oraz dr Jamesem Dene z Wake Forest University, którzy dostarczyli tkanki naczelnych innych niż ludzkie wykorzystane w tym badaniu. Celem tej procedury jest wprowadzenie barwników fluorescencyjnych do neuronów i oznakowanie wycinków mózgu różnych gatunków, takich jak gryzonie i naczelne w każdym wieku.

W celu zbadania morfologii dendrytów i kolców dendrytycznych osiąga się to poprzez uprzednie pokrycie T i koralików barwnikiem lipofilowym, takim jak oko D. Drugim krokiem procedury jest wyłożenie rurki koralikami pokrytymi oczkiem D i pocięcie ich na małe kawałki, które służą jako kule do systemu pistoletów genowych Helios. Trzecim krokiem procedury jest wystrzelenie koralików pokrytych oczami D w wycinki mózgu za pomocą pistoletu genowego.

Ostatni etap procedury jest opcjonalny, ponieważ stylistyka może być połączona z barwieniem immunologicznym w celu jednoczesnej lokalizacji innych markerów. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które wskazują na rzadkie znakowanie fluorescencyjne neuronów odpowiednie do obrazowania w wysokiej rozdzielczości, takiego jak mikroskopia konfokalna lub mikroskopia dwufotonowa, oraz badanie rozgałęzień dendrytycznych i morfologii kolców dendrytycznych. Główną przewagą tej techniki nad naszymi istniejącymi metodami jest to, że stylistykę można zastosować do wycinków mózgu zwierząt wszystkich gatunków, w każdym wieku i o wszystkich genotypach.

Może być stosowany w połączeniu z barwieniem immunologicznym i wytwarza rzadkie znakowanie fluorescencyjne, które jest odpowiednie do mikroskopii o wysokiej rozdzielczości przed wykonaniem kul. Pokryj kulki wolframowe barwnikiem lipofilowym w chemicznym dygestorium o stężeniu 450 mililitrów chlorku metylenu do 13,5 miligrama lipofilowego barwnika barwnikowego eye, aby uzyskać końcowe stężenie 30 miligramów na mililitr. Weź jedną probówkę pre Eloqua zawierającą 300 miligramów kulek wolframowych i dodaj 300 mikrolitrów chlorku metylenu, energicznie ją przepompuj, aby ponownie zawiesić kulki i uzyskać jednorodny roztwór.

Tylko 100 miligramów kulek wolframowych jest używanych na zestaw kulek, pipetując w górę iw dół, aby utrzymać kulki w stanie ponownego zawieszenia, dodaj 100 mililitrów kulek i rozpuszczone oko matrycy na szklane szkiełko i dokładnie wymieszaj je ze sobą. Za pomocą końcówki do pipet pozostaw do całkowitego wyschnięcia na powietrzu, aż kulki zmienią kolor na jasnoszary. Umieść czysty kawałek woskowanego białego papieru pod szkiełkiem za pomocą czystego ostrza wyścigowego Dla każdego koloru kul zeskrob koraliki ze szkła, wsuń i pokrój je w drobną kostkę na drobny proszek.

Zeskrob powlekane koraliki na papier serwatkowy i przelej je do 15-mililitrowej stożkowej tuby. Dodaj trzy mililitry wody i sonikuj w łaźni wodnej przez 10 do 30 minut w temperaturze pokojowej, aby dokładnie rozbić wszelkie grudki. Przeciąć 0,7 metra turkusowej rurki pod kątem na jednym końcu i podłączyć drugi koniec do 12-mililitrowej strzykawki za pomocą adaptera do rurek, umieścić wolny koniec w probówce zawierającej 10 mililitrów 10 miligramów na mililitr roztworu poliwinylu lub PVP lub PVP i całkowicie przeciągnąć roztwór przez rurkę do strzykawki.

Wirować roztwór kulek podczas pompowania strzykawką, aby uzyskać jednorodną mieszaninę działającą szybko, aby uniknąć wytrącania się kulek, wciągnąć roztwór całkowicie do rurki. Unikaj wprowadzania pęcherzyków powietrza, które zapobiegną przyczepianiu się koralików do rurki w tym miejscu, jednocześnie utrzymując rurkę napiętą z obu końców. Przechylaj go z boku na bok, aby równomiernie.

Rozłóż koraliki. Włóż rurkę do stacji przygotowawczej i pozwól kulkom osiąść przez 30 do 60 sekund. Użyj strzykawki, aby powoli, ale płynnie.

Usuń wodę, pozostawiając koraliki. Natychmiast odłączyć strzykawkę i rozpocząć obracanie rurki. Dostosuj przepływ azotu w stacji przygotowawczej do czterech do pięciu l/min na sucho przez 10 do 20 minut, aż kropelki wody przestaną być widoczne.

Wyjmij rurkę ze stacji przygotowawczej, pokrój pociski na 13 milimetrów długości za pomocą obcinaka do rurek, a na dobrych pociskach pojawi się delikatna szara mgiełka równomiernie pokrywająca wnętrze. Umieścić kule w owiniętych folią fiolkach scyntylacyjnych zawierających środek suszący, taki jak bezwodny siarczan wapnia. Przechowuj go w temperaturze pokojowej, aż będzie gotowy do strzału.

Znakowanie diiczne może być stosowane do barwienia neuronów w tkance mózgowej różnych gatunków i w różnym wieku oraz konserwowanych przy użyciu różnych metod. Umieść plastry mózgu, które zostały utrwalone przed lub po pokrojeniu, w dołkach 24. Talerz studni.

Umyj plastry w jednym XPB S3 razy przez pięć do 10 minut na pranie. Odpipetuj PBS za pomocą pędzla, aby wyśrodkować plasterek w dołku. Umieść kawałek filtra mikrometrycznego 3.0 między dwoma metalowymi sitkami dyfuzyjnymi na końcu wkładki lufy pistoletu genowego.

Trzymaj pistolet genowy tak, aby koniec wkładki lufy znajdował się w odległości 1,5 centymetra od próbki. Wystrzel koraliki w plasterek o ciśnieniu helu od 120 do 180 PSI. Szybko opłucz plastry trzy razy jednym XPBS, aby usunąć nadmiar barwnika.

Upewnij się, że powierzchnia plastra jest skierowana do góry podczas wszystkich etapów obchodzenia się z płynem. Przechowuj plastry w PBS przez trzy do sześciu godzin, aby DAI mógł rozprowadzić się wzdłuż dendrytów, przykryj folią. Ponieważ dai jest wrażliwy na światło, plastry można na tym etapie zamontować lub poddać dalszemu barwieniu przeciwciałami, jak opisano w następnej sekcji, aby przystąpić do barwienia w 300 do 500 mikrolitrach roztworu przenikającego zawierającego 0,01% TRITTON X 100 w jednym XPBS do każdej warstwy, inkubować w temperaturze pokojowej dokładnie przez 15 minut.

Usunąć roztwór przenikający z dołków, zablokować plastry w roztworze zawierającym 10% surowicy koziej i 0,01% tritanu X 100 w jednym XPBS inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Do każdego dodać od 300 do 500 mikrolitrów przeciwciała pierwszorzędowego rozcieńczonego w roztworze blokującym. Dobrze inkubować w temperaturze pokojowej przez jedną do dwóch godzin lub przez noc, w zależności od przemywania przeciwciał trzy razy jednym XPBS przez pięć do 15 minut przy każdym myciu, usunąć roztwór z dołka.

Do każdego dodać od 300 do 500 mikrolitrów przeciwciała drugorzędowego rozcieńczonego w roztworze blokującym. Dobrze umyj cztery razy jednym XPBS przez pięć do 15 minut przy każdym myciu jak poprzednio, zamontuj plastry na szklanym szkiełku z fluorescencyjnym medium montażowym i przykryj 18 na 18 milimetrów. Szkiełko nakrywkowe pozostaw do wyschnięcia na sześć do 12 godzin w temperaturze pokojowej przed uszczelnieniem krawędzi przezroczystym lakierem do paznokci przechowywanym w ciemności lub pokrytym w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Przykładowe zdjęcia oznaczonych fragmentów mózgu są pokazane tutaj. Dwie ważne cechy, na które należy zwrócić uwagę, to rzadki wzór znakowania przy małym powiększeniu i zdolność do identyfikacji poszczególnych składników komórkowych. Nieprawidłowe przygotowanie kulek lub nadmierne utrwalenie tkanki może prowadzić do złego oznakowania, jak pokazano tutaj.

Wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów znajdują się w tekście tutaj. Istnieje konfokalny obraz środkowego wirującego neuronu TAL z mózgu myszy i jego złożonego wzoru rozgałęzień dendrytycznych. Przekrój optyczny uzyskany przy użyciu mikroskopii konfokalnej pozwala na izolację pojedynczych znakowanych komórek w wycinku tkankowym.

Obrazy w dużym powiększeniu pokazują segmenty dendrytów z mózgu gryzonia i mózgu naczelnych innych niż ludzie. Należy zauważyć, że wysoka intensywność barwienia fluorescencyjnego osiągnięta dzięki tej technice skutkuje dobrze zdefiniowanymi kolcami dendrytycznymi podczas łączenia ICS z barwieniem immunologicznym. Na tym obrazie przedstawiono przykład kolokalizacji znakowania oka D na czerwono z barwieniem immunologicznym dla ekspresji GFP na zielono.

Obraz ten odpowiada wycinkowi sal od transgenicznej myszy wykazującej ekspresję białka fluorescencyjnego GFP pod promotorem receptora dopaminy D-jeden. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować kule i użyć pistoletu Jing do słabo podatnych neuronów za pomocą barwników fluorescencyjnych. Technika ta pozwala na przejrzystą wizualizację morfologii neuronów oraz na badanie rozgałęzień i kolców.