Ukierunkowana integracja genów za pośrednictwem TALEN: wykorzystanie zmodyfikowanych nukleaz specyficznych dla sekwencji do precyzyjnej insercji genu białka fluorescencyjnego do hiPSC

Zacznij od indukowanej przez człowieka pluripotencjalnej zawiesiny komórek macierzystych lub hiPSC w pożywce. Dodaj parę nukleazy efektorowej podobnej do aktywatora transkrypcji lub plazmidów kodujących TALEN. Suplement plazmidem dawcy zawierającym gen białka fluorescencyjnego, sprzężony z genem oporności na antybiotyki, z sąsiednimi ramionami homologicznymi w celu specyficznego dopasowania do docelowych loci.

Elektroporuj mieszaninę, aby wytworzyć przejściowe pory w błonach komórkowych, umożliwiając internalizację plazmidu. Po wejściu do komórek plazmidy kodujące TALEN są przetwarzane, wytwarzając TALEN-y - chimeryczne białka złożone z specyficznej dla miejsca domeny wiążącej DNA TALE, połączonej z niespecyficzną domeną cięcia endonukleazy restrykcyjnej FokI.

Każdy monomer TALEN poprzez swoją domenę wiążącą DNA - składającą się z tandemowych modułów powtórzeń aminokwasów - rozpoznaje i wiąże się z loci docelowymi, po jednym module na nukleotyd, na każdej nici DNA w przeciwnych orientacjach, oddzielonych sekwencją dystansową. Domeny FokI następnie dimeryzują i rozszczepiają DNA w sekwencji dystansowej, tworząc dwuniciowe pęknięcia z nawisami.

W obecności plazmidu dawcy zawierającego ramiona homologiczne komplementarne do regionów flankujących rozszczepione miejsce, następuje naprawa ukierunkowana na homologię, wykorzystująca sekwencję homologiczną jako matrycę do syntezy naprawy DNA w celu wypełnienia pęknięć dwuniciowych. Po ligacji nacięć, białko fluorescencyjne i geny oporności na antybiotyki zostają zintegrowane z genomem gospodarza.

Traktuj hiPSC, wysiane na warstwie komórek żywiciela w celu wsparcia wzrostu, za pomocą pożywki zawierającej antybiotyki. Gen oporności na antybiotyki bez promotora - napędzany przez endogenny promotor - ułatwia selekcję komórek edytowanych przez TALEN.