Indukowalna regulacyjna ekspresja genów oparta na systemie Tet-On in vivo: indukowany tetracykliną system ekspresji genów do aktywacji transkrypcji genu docelowego w modelu mysim

System tetracykliny-On lub Tet-On to warunkowy system ekspresji genów, który aktywuje ekspresję interesującego genu w obecności tetracykliny lub jej analogu, doksycykliny.

Zacznij od genetycznie zmodyfikowanej myszy ze zmodyfikowanym genomem zawierającym gen kodujący białko aktywatora transkrypcji kontrolowane przez odwrotną tetracyklinę lub rtTA, napędzane przez specyficzny dla wątroby promotor w komórkach wątroby lub hepatocytach. Dodatkowo mysz zawiera interesujący gen pod kontrolą operatora tetracykliny lub sekwencji tetO zlokalizowanych przed i selektywnie połączonych z minimalnym promotorem. TetO i promotor nazywane są pierwiastkiem reagującym na tetracyklinę lub TRE.

Ekspresja rtTA - białka fuzyjnego składającego się z represora tet, tetR i domeny transaktywacyjnej białka wirusowego VP16 - tworzy dimery, które są nieaktywne i nie mogą wiązać się z sekwencją tetO TRE, zapobiegając aktywacji docelowej ekspresji genu.

Przygotować roztwór zawierający doksycyklinę i sacharozę. Dodatek sacharozy zwiększa smakowitość. Po przefiltrowaniu podaj myszowi roztwór doksycykliny i sacharozy jako wodę pitną. Podana doksycyklina kumuluje się w wątrobie.

W hepatocytach doksycyklina wiąże się z rtTA, powodując zmianę konformacyjną i zwiększone powinowactwo do miejsca wiązania DNA tetO. Domena wiążąca DNA tetR rtTA związana z doksycykliną wiąże się z sekwencją tetO elementu TRE. Domena VP16 dalej rekrutuje polimerazę RNA, prowadząc do transkrypcji, tworzenia mRNA, a następnie ekspresji dalszego genu reporterowego docelowego.